⑴ 《肺癌MRD的检测和临床应用共识》
2021年3月肺高论坛上最终达成了“肺癌MRD的检测和临床应用共识”。
——肺癌分子(微小)残留病灶(MRD)的检测和临床应用共识
共识一：MRD的概念
1、肺癌分子残留病变，指的是经过治疗后，传统影像学(包括PET/CT)或实验室方法不能发现，但通过液体活检发现的癌来源分子异常，代表着肺癌的持续存在和临床进展可能；
2、肺癌分子异常：指的是在外周血可稳定检测出丰度≥0.02％的ctDNA，包括肺癌驱动基因或其他的Ⅰ/Ⅱ类基因变异。
共识二：MRD检测的基本技术要求
1、MRD检测的基本技术，包括Tumor-informed assays(个体化定制)和 Tumor agnostic assays( NGS panel和多组学技术)，目前均处在探素阶段，需要前瞻性研究确定其敏感性、特异性和预测价值；
2、采用二代测序技术(NGS)，所选的多基因 panel中必须覆盖患者Ⅰ/Ⅱ类基因变异，基本技术标准是可稳定检出丰度≥0.02％的ctDNA；
3、驱动基因阳性的非小细胞肺癌，MRD的分子panel应包括该驱动基因；
4、MRD评估报告中必须包括cfDNA丰度， ctDNA丰度，所检测基因VAF值；
5、需要建立针对免疫治疗的MRD标准。
共识三：可手术早期肺癌MRD的应用
1、早期非小细胞肺癌患者根治性切除术后，MRD阳性提示复发风险高，需进行密切随访管理。建议每3～6个月进行一次MRD监测；
2、建议基于MRD开展可手术非小细胞肺癌的围术期临床试验，尽可能提供围术期精准治疗方案；
3、建议分别探索MRD在驱动基因阳性和驱动基因阴性两种类型患者中的作用。
共识四：局部晚期非小细胞肺癌MRD的应用
1、局部晚期非小细胞肺癌根治性化放疗后完全缓解患者，建议检测MRD，有助于判断预后和制定进一步的治疗策略；
2、建议开展基于MRD的化放疗后现固治疗的临床试验，尽可能提供精准的巩固治疗方案。
共识五：晚期非小细胞肺癌MRD的应用
1、晚期非小细胞肺癌目前缺乏针对MRD的相关研究；
2、晚期非小细胞肺癌系统治疗后完全缓解患者，建议检测MRD，有助于判断预后和制定进一步的治疗策略；
3、建议在完全缓解患者中开展基于MRD的治疗策略研究，尽可能延长完全缓解持续时间，使患者能最大获益。
⑵ MRD（微小残留病灶）检测的原理、优势和不足
引言
恶性血液病学领域有众多三个字母的缩写: MDS（ myelodysplastic syndrome， 骨髓增生异常综合征）、CML（chronic myeloid leukemia，慢性髓性白血病）、ALL（acute lymphoblastic leukemia，急性淋巴细胞白血病）、CLL（chronic lymphoblastic leukemia，慢性淋巴细胞白血病） 等等，不胜枚举。
MRD，即可测量的残留疾病（Measurable Resial Disease）, 也称为最小残留病灶（minimal resial disease），已经成为另一个血液肿瘤领域最常见的三字母缩写。
MRD，是指白血病/淋巴瘤/骨髓瘤患者经治疗缓解后，体内仍残留少量癌细胞的状态，最终可能会引起疾病复发。
MRD检测逐渐成为判断疗效和预后的预测指标之一。
MRD检测指的是什么？
MRD检测可以识别出传统方法可能检测不到的少量恶性细胞。
传统检测方法，比如免疫组化或免疫荧光，检测恶性细胞的敏感度大约为100个细胞中能检测到1个细胞（1%）。
与传统检测方法相比，NGS（next-generation sequencing，二代测序）或NGF（ next-generation flow cytometry，二代流式），可以显着提高MRD检测的敏感性。
NGS和NGF检测MRD恶性细胞的敏感度低至10^-5（0.001%或10万分之一的恶性细胞），甚至10^-6（0.0001%或100万分之一）。
MRD的检测样本可以是外周血（如慢性淋巴细胞白血病），也可以是骨髓抽吸液（如多发性骨髓瘤和急性白血病）。
对于治疗后达到完全缓解（CR，complete response）的患者，NGS或NGF检测能够将MRD阳性与MRD阴性的患者区分开来。
MRD阳性的阈值因疾病（或临床试验）不同而异。急性骨髓性白血病（AML）通常设定为10^-4，而在多发性骨髓瘤中则为10^-5。
NGS和NGF如何检测MRD？
NGS通过高通量测序来检测恶性肿瘤的特异性基因序列。
NGF使用多色标记抗体检测恶性肿瘤细胞表面的特定标记分子。
MRD检测时，NGS和NGF之间如何做出选择？
需要考虑的关键因素有2个：
（1）NGS可以对储存的组织样本（如石蜡包埋组织或冻存组织）进行检测，而NGF则需用新鲜样本进行检测（因为死亡细胞表面的标记物通常会脱落）。
（2）NGF通过异常免疫表型分子来识别恶性细胞，而NGS通过已知的肿瘤基因突变来识别恶性细胞。
在最佳条件下，NGS和NGF检测对MRD的灵敏度均能达到10^-5和10^-6之间。
MRD阴性是否意味着病人处于完全缓解期？
并不总是如此。
单一的MRD检测并不能完全说明问题。
例如，一个骨髓瘤患者骨髓活检MRD阴性，但仍可能存在活动性浆细胞瘤的影像学表现。另外，骨髓瘤患者MRD阴性，但血清M蛋白仍有可能阳性（骨髓瘤治疗完全反应的定义是，强化治疗后血液中M蛋白完全被清除）。
此外，取样或技术误差也会干扰MRD的检测结果。
对于像慢性淋巴细胞白血病（CLL）或急性淋巴细胞白血病（ALL）这样的疾病，取外周血进行MRD检测可以避开采样误差（与骨髓抽吸液相比），但敏感性可能会打折扣。
对骨髓抽吸液进行MRD检测，抽吸液的稀释也可能会影响MRD的检测结果。这也是为什么要用第一次抽出的骨髓液进行MRD检测的原因。
在临床实践中，MRD检测的意义有多大？
除了临床研究，昂贵的MRD检测还很少（如果有的话）能明确改变临床实践。
B细胞ALL患者在治疗达到完全缓解后，如果进行异体造血干细胞移植，MRD阴性患者比MRD阳性患者的预后更差。因此，对于B细胞ALL，MRD检测具有判断预后的临床价值。
另外，有临床研究尝试根据MRD检测结果调整治疗强度，甚至停止治疗，包括CAPTIVATE研究（伊布替尼/维尼曲松治疗CLL）和MASTER研究（Dara-KRd疗法，即达雷妥尤单抗、卡非佐米、来那度胺和地塞米松，治疗骨髓瘤）治疗骨髓瘤。
然而，由于存在取样误差、检测技术差异和疾病异质性，MRD检测有其局限性。
因此，MRD检测的临床价值还需要对每种特定疾病进行前瞻性研究。
MRD检测在临床研究中的意义何在？MRD阴性是临床试验中可接受的替代终点吗？
MRD检测确实具有判断预后的临床价值。
针对骨髓瘤、B细胞ALL和AML的Meta分析显示，与没有达到MRD阴性的患者相比，达到MRD阴性的患者有更好的预后。
然而，如果在有治疗反应与无治疗反应患者之间比较MRD检测的预后价值，是存在逻辑漏洞的。
为什么这么说呢？
因为，这本质上是将不同肿瘤生物学特性之间进行比较。MRD阴性不仅仅反映治疗效果，也是疾病本身的肿瘤生物学特性的比较。
我们来做一个类比。
一个12周龄大的婴儿能睡一整个晚上，父母自然很开心，不必半夜起床喂孩子或哄睡孩子。
然而，孩子的睡眠表现如此好，是归功于睡眠训练，还是安抚奶嘴的作用，抑或是宝宝本身就具备的天赋，就不好说了。
总结
最新MRD检测技术（二代测序和二代流式）的优势和不足总结如下表：
在未来几年，MRD检测在恶性血液病中的应用可能会继续增加，但前提是MRD的检测方法学不断优化，并被更多临床试验验证。
虽然MRD检测是一个令人兴奋的概念，但MRD阴性是否可以作为公认临床疗效终点（如总生存期）的替代终点，还需要精心设计的临床试验来验证。
⑶ MRD微小残留和融合基因什么区别
MRD微小残留是看残留的白血病细胞是否存在以及存在多少，如果是阴性的，那么患者的预后就越好。
MRD检测可以用很多方法检测，例如：流式检测白血病细胞，RT-PCR检测融合基因，或者测序检测基因突变等；
当一种白血病有标志性的融合基因时，就可以通过检测这种标志性的融合基因来判断MRD微小残留的情况。
所以，MRD微小残留检测是一项临床目的，符合条件的情况下，检测融合基因是一种手段。
⑷ MRD检测技术革新助力肿瘤精准医疗
MRD（Minimal Resial Disease），即微小残留病灶，指癌症患者在治疗中或治疗后体内仍有残留的恶性肿瘤细胞存在，细胞坏死或凋亡过程中释放出肿瘤循环DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）。同时也有NCCN指南和专家共识将MRD表示为Measurable Resial Disease，即可测量残留病灶[1]。MRD会引起癌症患者术后肿瘤复发，所以癌症患者需要监控MRD，监测术后肿瘤复发风险。
基于检测ctDNA的技术因其高灵敏度和无创、便捷等特点，优于传统的临床或影像学方法鉴定出有肿瘤复发的患者。但是ctDNA的检测受大量游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）背景信号影响。因此，MRD检测应使用高灵敏度的检测技术。目前检测MRD的技术众多（详见图2），而最广泛使用的检测技术是其中三种：
1） 多参数流式细胞术（ MFC），是一种快速、定量鉴定癌细胞的方法，其峰值灵敏度为0.01%，即1万个正常细胞中的1个癌细胞。6色（或更多）流式细胞术分析是检测异常MRD免疫表型的最常用方法。
2）聚合酶链式反应技术，分为qPCR或RT-qPCR，可以根据其特有的遗传变异，如突变或染色体变异识别恶性肿瘤细胞；本质上是癌细胞的特定DNA片段被复制和扩增，使它们更容易检测和计数，因此即使癌细胞数量非常少，也能通过PCR检测出基因异常；
3）NGS是一种极为敏感的DNA测序方法，其峰值灵敏度为0.0001%，即100万个正常细胞中有1个癌细胞。NGS可以检测B/T细胞抗原受体基因的克隆性重排，作为新兴的MRD检测方法，已受到国内外专家认可并推荐。2017年版国际临床实践指南（NCCN）、和2017年版《中国多发性骨髓瘤诊治指南》均推荐NGS作为MRD检测方法。
总的来说，临床应用中，应根据不同治疗目的，选择合适的MRD检测方法。qPCR及RT-qPCR检测MRD的灵敏度较MFC高，但更为费时。NGS作为MRD检测的最新技术，进一步提高了MRD检测的灵敏度，对于评价治疗疗效、预测疾病复发、实施精准治疗具有重要的指导意义。
MRD检测最成熟也是最主要的应用是血液肿瘤，已成为NCCN临床标准实践的一部分，FDA唯一批准的MRD检测产品也仅用于血液疾病。但随着很多临床试验的推进，MRD近年也在慢慢扩展到实体肿瘤中，如乳腺癌，肺癌，结直肠癌，前列腺癌等，并以实验室自建方法（LDT）的方式参与临床决策【3-6】。目前实体肿瘤MRD的检测难度较大，主要体现在两方面：
1、不同实体瘤个体化差异大，即每个患者个体中仅携带非常少量、相同的基因突变，对panel的设计要求高。
2、早期实体瘤释放到外周血的ctDNA含量非常少（低于1%），对检测灵敏度要求极高。
针对上述难题有两种解决方案：①使用NGS大panel；②开发个性化的MRD检测panel。也就是目前采用ctDNA检测MRD主要存在两大技术路线：tumor-agnostic（仅基于血浆检测的固定panel）和tumor-informed（基于肿瘤组织测序的ctDNA个性化定制方案)[7]。
由于组织先验（tumor-informed）策略在检测灵敏度上的优势，目前许多肿瘤检测公司基于此进行开发。其技术路线为先检测与肿瘤发生发展相关基因的变异信息，形成每个患者的个性化基因变异图谱，将其纳入MRD检测；最后通过液体活检定向追踪患者血液中的个性化变异。
如上图所示，通过采集患者肿瘤组织进行全外显子测序（WES），针对每位患者选取肿瘤特异性的克隆位点进行个性化定制NGS Panel（或使用多重PCR方法)，在监测时提取血浆中的ctDNA进行超高深度测序，通常在术后约四周进行MRD检测。 在一项研究中，相对于固定panel测序策略，可为病人多争取42%的时间采取适合的对策[6]
与此同时，也有研究引入新的方法学进一步升级MRD检测。鉴于甲基化在肿瘤发生早期已有显着变异、变异位点数目丰富，这些表观基因组“标记”在不同患者之间甚至在不同癌症之间更相似，使其成为新MRD检测方法的可能（尤其是针对早期患者）。针对甲基化位点进行设计个性化Panel，这种多组学捕获可以对肿瘤治疗全过程进行精准、高效地全程监测。
1、 Panel 卓越的性能表现
不论是10Kb小Panel还是42Mb WES，伯科液相捕获芯片均展现出卓越的性能：优异捕获效率与均一性。因此能保证个性化的panel检测灵敏度，为MRD检测提供优质的工具。
2、 丰富的引物/探针设计经验，极速定制周期
快速针对患者选取肿瘤特异性的克隆位点设计引物/NGS Panel，最大程度实现MRD检测高特异性的同时，七天极速定制周期能极大满足临床术后约四周进行MRD检测的需求。
3、 不管定制个性化Panel还是Spike in，极大用户客户需求
TRACERx研究发现大约12%的患者复发时是一个新原发肿瘤【9】。部分检测机构为了提高MRD检测灵敏度的同时降低检测成本，采用基础模块（癌症中常见的热点驱动基因突变位点）+个体化模块（个体化突变位点）组合个体化定制panel代替原有大panel进行MRD检测。不论是小区域还是大区间，不论是Spike-in到小Panel还是全外显子，伯科探针体系均能胜任，实现了MRD检测广度和深度上的完美结合。
4、 拥有多组学共捕获Panel开发经验
例如DNA&RNA共捕获技术。随着检测技术的进步，可进一步支撑DNA&Methyl共捕获等技术流程的开发。
[1] Minimal Resial Disease (MRD). (n.d.). Minimal Resial Disease (MRD). Leukemia & Lymphoma Society.
[2] Chen Xueyan, Wood Brent L., Monitoring Minimal Resial Disease in Acute Leukemia: Technical Challenges and Interpretive Complexities, Blood Reviews (2016), doi:10.1016/j.blre.2016.09.006
[3] Coakley Maria, Garcia-Murillas Isaac, Turner Nicholas C, Molecular Resial Disease and Adjuvant Trial Design in Solid Tumors. [J] .Clin Cancer Res, 2019, 25: 6026-6034.
[4] NCCN Guidelines https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/default.aspx
[5] Abbosh C, Birkbak NJ, Wilson GA, et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution [published correction appears in Nature. 2017 Dec 20]. Nature. 2017;545(7655):446-451. doi:10.1038/nature22364
[6] Coombes RC, Page K, Salari R, et al. Personalized Detection of Circulating Tumor DNA Antedates Breast Cancer Metastatic Recurrence. Clin Cancer Res. 2019;25(14):4255-4263. doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-3663
[7] Prof.Jeanne Tie, 2020.ASCO-GI
[8] Shannon chuai，ctDNA Methylation & Mutation — A Two-Dimensional MRD Method Identifies More At-risk Patients and Predicts DFS in NSCLC.
[9] Zviran, A. et al. Genome-wide cell-free DNA mutational integration enables ultra-sensitive cancer monitoring. Nat Med 26, 1114–1124 (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0915-3