肿瘤组织标本研究方法

㈠ 病理学主要研究的方法有哪些

• 人体病理学研究方法：尸体剖验 (autopsy)、活体组织检查 （biopsy）、细胞学 （cytology）、分子生物学 （Molecular Biology）

• 实验病理学研究方法：

  1．动物实验

  利用人工方法在动物身上复制出人类某些疾病的模型及病理过程，研究疾病的病因学、发病学、病理改变及转归，并可施加干预因素，对疾病进行进一步的研究。

  2．组织培养和细胞培养

  将某种组织或单细胞用适宜的培养基在体外培养，以观察细胞、组织病变的发生、发展（如细胞癌变、肿瘤生长、病毒复制、染色体变异等）可以对培养的组织、细胞施加射线，药物等外来因子，观察对其影响。

㈡ 肿瘤3大研究方向之 纯粹肿瘤异质性探索

DOI: 10.1126/science.1254257

Broad研究所和麻省总医院(MGH)于2014年6月12日发表在Science上： Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma

目前将胶质母细胞瘤分为4个亚型，在单细胞水平对不同分型的脑胶质瘤细胞进行瘤内异质性检测是本文的重点。

这是第一次对获取胶质母细胞瘤中的单个细胞展开大规模的研究 ，当时单细胞转录组还是相对较新的办法。利用流式细胞术的方法，对来自5位患者的脑胶质瘤细胞进行分选，检测了430个细胞的基因表达模式，揭示了：每个胶质母细胞瘤都包含来自多种癌症亚型的细胞，肿瘤之间这些细胞的分布各不相同。

doi: 10.1126/science.aad0501.

Broad研究所于2016年4月8日在Science上发表： Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq

对19名黑色素瘤病人的单细胞样本进行测序，共计4645个不同的肿瘤细胞；类型包括了恶性肿瘤细胞，免疫细胞，间质细胞和内皮细胞。发现：在同种肿瘤中的恶性细胞，其转录的异质性与细胞周期，空间分布和抗药性相关。单细胞转录组表达矩阵：GSE72056

doi: 10.1016/j.cell.2017.10.044

2017年12月发表在CELL杂志上，题目是： Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer 。通讯作者为Itay Tirosh 、Derrick T. Lin 、 Aviv Regev 、Bradley E. Bernstein

HNSCC 头颈部鳞状细胞癌是最常见的十大癌症之一，是一种与酒精和烟草暴露密切相关的具有异质性的上皮肿瘤，患者往往在晚期出现的淋巴结转移（LN)。实验使用 Smart-seq2 方法得到了：研究者对 18个头颈部鳞癌（HNSCC）患者（ 其中包含5对原发性肿瘤和淋巴结节转移配对样本）中分离得到的 6000个单细胞 进行大规模scRNA-seq分析【数据公布在 GSE103322】。实验验证用的是细胞系 Oral cavity HNSCC cell lines (Cal-27, SCC9, SCC4, SCC25, and JHU-006; all derived from male patients) 做了RNA-seq 数据。 创造了头颈部肿瘤的第一个细胞图谱，揭示了头颈部肿瘤及其转移的许多不同类型的细胞。

DOI: 10.1126/science.aai8478

美国麻省总院和Broad研究所合作，于2017年3月31日发表在Science上： Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq

对 10例星形胶质瘤 样本中的9800个细胞和 6例少突胶质瘤 样本中的4300个细胞进行了单细胞RNA测序。再结合癌症基因组Atlas中的165例转录组数据。两种肿瘤都含有3种癌症细胞：非增殖性细胞（nonproliferating cells）、类神经干细胞（resemble neural stem）和祖细胞（progenitor cells）。结果表明两种脑肿瘤亚型起源于神经祖细胞的相同类型，由基因突变模式和其微环境的组成分而区分开。结果重新定义了两种密切相关胶质瘤的细胞组成，它们是以IDH基因突变为特征的星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。

doi: 10.1002/hep.29778.

美国国家癌症中心Zheng H, Pomyen Y, Hernandez M O等于2018年7月发表在Hepatology上： Single‐cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma

肝细胞癌（HCC，hepatocellularcarcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。研究人员在 单细胞水平 （10X Chromium、SMART-seq）上 整合转录组学和功能分析 用以评估CSC的异质性程度。结果表明， CSC在单细胞水平上的表型、功能和转录均存在异质性，不同的CSC亚群具有不同的分子特征 。而且不同CSC亚群内的不同基因与HCC预后相关，并且彼此相互独立，表明 CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展 。

DOI: 10.1126/science.aat1699.

2018年8月英国剑桥大学、桑格研究所等在Science上发表： Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors

探究了来自胎儿、儿童和成人肾脏的 72,501 个人肾肿瘤和正常组织的单细胞转录组，将儿童期Wilms肿瘤与特定的胎儿细胞类型相匹配，从而为Wilms肿瘤细胞是异常胎儿细胞的假设提供证据。在成人肾细胞癌中，对肿瘤组成的分析定义了癌症相关的正常细胞，并描绘了复杂的血管内皮生长因子（VEGF）信号转导通路。结果揭示了人类肾脏肿瘤的确切细胞特征和组成。

doi：10.1038/s41586-019-1373-2

2019年8月发表在nature上： A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors.

对来自9个人类捐赠者的正常肝脏组织内约10,000个单细胞进行了RNA测序,并构建了人类肝细胞图谱。首次揭示了未知的内皮细胞、Kupffer细胞和肝细胞的亚型，并对其中一些群体进行了转录区划分。证实了EPCAM+ 种群是异质的。EPCAM+ 种群包括肝细胞偏置种群、胆囊素种群以及具有强大双能性肝脏类器官转化潜力的TROP2int 祖细胞群体。单细胞转录组表达矩阵，数据公布在 GSE124395

doi: 10.1016/j.cell.2019.06.024

哈佛医学院、博得研究所2019年8月8日 发表在cell上，题目是： An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma.

采用了包括 28个肿瘤的单细胞RNA测序 、 401个肿瘤基因组图谱(TCGA) 标本的大量遗传和表达分析、功能方法和单细胞谱系追踪的整合方法获得了胶质母细胞瘤细胞状态和遗传多样性的统一模型。发现胶质母细胞瘤中的恶性细胞 以四种主要的细胞状态存在 ，这些细胞状态概括了不同的神经细胞类型，受肿瘤微环境的影响。胶质母细胞瘤不同状态下细胞的相对频率不同，受CDK 4、EGFR和PDGFRA基因拷贝数扩增和NF1位点突变的影响。作者整合了胶质母细胞瘤恶性细胞程序，其可塑性以及其通过遗传驱动因素的调节，为胶质母细胞瘤研究提供了一个模型。

doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0094

2019年7月13日冷泉港实验室发表在Cancer Discov： Cross-species single-cell analysis of pancreatic ctal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts

癌症相关的成纤维细胞(CAFs)是胰腺导管腺癌(PDAC)进展和耐药的主要因素。文章对人和小鼠使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）将CAFs分为三个不同的亚群（myCAFs、iCAFs、apCAFs），确定每个亚群的特定功能和特征。证实了肌纤维母细胞CAFs(myCAFs)和炎症性CAFs(iCAFs)的存在，并定义了它们在体内的独特基因特征。描述了一种表达MHCⅡ类基因和CD 74基因、但不表达经典的共刺激分子的新的CAFs（抗原呈递CAFs），在模型系统中以抗原特异性方式激活CD4 + T细胞，证实了它们被推测的免疫调节能力。

DOI：10.1038/s41422-019-0195-y

Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College于2019年7月4日发表在Cell Research： Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ctal adenocarcinoma

使用10× scRNA技术测序：【Case】 24例胰腺导管腺癌 （PDAC）（41986个细胞）；【Control】 胆管肿瘤和十二指肠肿瘤共3例，8例非恶性胰腺肿瘤患者 （15444个细胞），揭示了导管腺癌肿瘤微环境图谱特征；比较了实验组和对照组之间以及不同细胞类型之间细胞CNV水平的差异，发现相对于1型导管来说，2型导管是恶化程度较高的导管细胞；另外对两种导管细胞的marker进行免疫组化，发现通过单细胞测序鉴定出的marker基因可以作为临床中导管腺癌进程的分子标志物；伴随着导管的恶性化进程，导管高表达细胞增殖和细胞迁移相关的基因；基于上述挖掘到的恶性导管细胞的marker基因，作者进行TCGA数据挖掘，将178个PAAD病人分为4种类型；通过不同的靶点抑制剂作用实验发现CDK1可以作为一个比较好的潜在治疗靶点；增殖性导管细胞伴随着T细胞活化的缺失预示着较差的预后

doi: 10.1038/s41586-019-1434-6

美国圣犹大儿童研究医院和麻省总医院于2019年7月25日在Nature上发表： Resolving melloblastoma cellular architechture by single-cell genomics 。

髓母细胞瘤是最为常见的恶性儿童脑瘤。2012年，国际上将髓母细胞瘤分为4种分子亚型：WNT型、SHH型、三型和四型。WNT和SHH的肿瘤也有较为确定的细胞起源，但是三型和四型的细胞起源却仍是个未知之谜。从目前的存活率来看，WNT亚型患者存活期较长，而三型和四型的存活期却明显偏短。通过将肿瘤细胞和发表的成熟脑细胞单细胞图谱进行比较，作者发现SHH型肿瘤和其已知的起源细胞，小脑颗粒神经祖细胞（GNP ）最为类似，而四型肿瘤和单极刷细胞（UBC）最为类似。

单细胞转录组测序技术检测了25个儿童髓母细胞瘤样品。 发现三型和四型的主要差异在于不同类型的细胞比例，并通过计算推测出三型和四型肿瘤的可能起源和致癌通路。

doi: 10.1038/s41467-019-11738-0.

美国杜克大学医学院的Jason W. Locasale、Ziwei Dai和Zhengtao Xiao于2019年8月21日发表在Nature Communications上： Metabolic landscape of the tumor microenvironment at single cell resolution

分析了来自两种代表性人类肿瘤的 9000多个单细胞 的代谢基因表达谱，包括 黑色素瘤和头颈癌 ，然后为评估该研究中单个肿瘤细胞的转录组图谱是否与常用组织样本的转录组图谱一致，研究人员将测序数据 与来自TCGA的RNA-seq数据进行了比较 。研究发现，该单细胞RNA-seq研究中的肿瘤样本与TCGA中的肿瘤样本大致相当。

首次在单细胞水平解析了肿瘤微环境中的细胞代谢基因表达谱，揭示了肿瘤代谢异质性在单细胞和组织水平上的显着差异 。在肿瘤微环境中， 不同患者来源的肿瘤细胞拥有不同的代谢基因表达特征，但不同类型非肿瘤细胞的代谢基因表达并不受患者来源的影响 ，且不同细胞类型具有各自独特的基因表达特征。

㈢ 病理学研究最常用的方法

是尸体剖检。

对死亡者的遗体进行病理剖检（尸检）是病理学的基本研究方法之一。尸体剖检（autopsy）不仅可以直接观察疾病的病理改变，从而明确对疾病的诊断，查明死亡原因，帮助临床探讨、验证诊断和治疗是否正确、恰当，以总结经验，提高临床工作的质量。

而且还能及时发现和确诊某些传染病、地方病、流行病、为防治措施提供依据，同时还可通过大量尸检积累常见病、多发病、以及其他疾病的人体病理材料，为研究这些疾病的病理和防治措施，为发展病理学作贡献。

显然，尸检是研究疾病的极其重要的方法和手段，人体病理材料则是研究疾病的最为宝贵的材料。

(3)肿瘤组织标本研究方法扩展阅读：

病理学与临床医学之间的密切联系，明显地在对疾病的研究和诊断上。临床医学除运用各种临床诊察、检验、治疗等方法对疾病进行诊治外，往往还必须借助于病理学的研究方法如活体组织检查、尸体剖检以及动物实验等来对疾病进行观察研究，提高临床工作的水平。

病理学则除进行实验研究（实验病理学）外，也必须密切联系临床，直接从患病机体去研究疾病，否则也不利于病理学本身的发展。

病理学长期以来被形象地喻为“桥梁学科”，这充分表明了它在医学中，特别是在临床医学中占有不可替代的重要地位。其理由主要是由病理学的性质和任务所决定的。

㈣ 肺癌的基因检测面面观

已知有基因突变的肺癌患者已经达到肺癌总数的62%。这意味着肺癌基因检测将造福更多的肺癌患者，将有62%的肺癌患者可以通过基因检测找到靶向药物，延长生存时间，提高生活质量。

靶向治疗通常是口服用药，毒性低于化疗。

精准的基因检测可实现肺癌精准诊断和精准治疗，肺癌的基因检测是指目前针对非小细胞型肺癌，观察有没有 EGFR基因突变 、 ALK基因融合 、 R0S1突变 、 C-MET基因扩增 、 C-MET基因突变 或者 HER-2过度表达 等情况。如果有上述基因突变，通常可以使用相应的靶向药物，并且靶向药物目前在临床上都已经上市。

肺腺癌，常规行基因检测；

肺鳞癌， 需要确定组织标本是“小标本”还是“手术标本”：

如果是手术标本诊断的鳞癌，一般不推荐做基因检测 ，因为目前治疗相关驱动基因主要还是发生在肺腺癌；

如果是小标本——穿刺标本或内镜下取的标本，这部分组织一般并不能反映整体肿瘤组织的状态，尤其是对于混合性肿瘤组织来说，鳞癌的诊断不一定完全正确。同时，临床实践也告诉我们，有部分鳞癌患者基因检测能发现驱动基因阳性，疗效也比较好。 因此，“小标本”诊断肺鳞癌可考虑进行基因检测

前期的研究表明，非小细胞肺癌若有基因突变，使用靶向物要比化疗药物，无论在 客观缓解率 、 患者生活质量，还是无进展生存时间上，都要比化疗来得更好 。

目前关于肺癌的精准治疗，主要内容是进行基因检测，在使用靶向之前需要找到相应的靶点，有相应靶点才使用相应的靶向药物，比如EGFR可以使用一代的吉非替尼、厄洛替尼或三代的奥希替尼等。

基因突变对应的药物或意义

1- EGFR基因突变：

* 19号外显子缺失、21号外显子L858R/L861、18号外显子G719X，G719、20号外显子S768I对第一、第二代TKIs敏感（易瑞沙、特罗凯）

*20号外显子点突变T790M对一、二代TKIs获得性耐药，对第三代TKIs奥西替尼有效

*20号外显子插入突变可能预测对一、二代TKIs的获得性耐药

*KRAS变异与TKIs原发耐药有关；KRAS变异与EGFR变异在肺癌患者重叠率<1%

2-ALK基因重排对ALK抑制剂敏感

3-ROS-1重排阳性一代ALK抑制剂（克唑替尼）对此敏感

4-PD-L1表达≥50% 帕博丽珠单抗（K药）

5-PD-L1表达≥1%纳武单抗（O药）

其他：

1-抗血管治疗（无需检测靶点）雷莫卢单抗获批用于晚期NSCLC的治疗；贝伐珠单抗获批用于晚期肺腺癌的治疗，不提倡用于肺鳞癌

2-BRAFV600E突变：威罗菲尼、达拉非尼、达拉非尼+曲美替尼（MEK抑制剂）

3-高水平MET扩增或MET外显子14突变：克唑替尼

4-RET重排卡博替尼、凡德他尼

5-HER2突变曲妥珠单抗、阿法替尼

对于肺癌患者，国内医院常规的肺癌基因检测靶点为三个(EGFR、ALK、ROS1)，目的是检测是否适合使用已经上市的靶向药物，这种方案的优点是：

1、经济实惠，满足大多数患者需求

2、EGFR和ALK是东亚非小细胞肺癌患者中最常见的，约占50%

3、不吸烟女性中比例更高

肺癌基因检测有以下两种方法：

1、体液检测，如胸腔积液、血液，通常普通是送检标本，抽血10ml左右，根据所需组织学体液量不同，约需100ml；

2、肿瘤标本，即肿瘤实质性组织做标本检测。标本检测有新鲜标本，还有取完标本后做成蜡块检测，不同实验室，检测技术不同，所需标本不同。多数是用组织标本，通常需10张较厚切片标本，厚度为5-8μm，还需要挂胶，将标本附着于载玻片上，实验室通过肿瘤组织细胞进行一系列基因检测。后续检测复杂，需实验室技术员完成。

推荐美国foundation基因检测、 美国CARIS生命科学公司、北京诺禾致源科技股份有限公司、世和基因、泛生子基因科技有限公司。

二次基因检测：肿瘤复发或耐药，医生会再推荐做一次基因检测，耐药是癌细胞往往发生了新的基因变化，如一半的肺癌患者会发生T790M突变，使用三代的TKI效果会好

NCCN非小细胞肺癌临床实践指南（2018.V1）中对于“分子诊断与靶向治疗原则”（NSCL-G）明确指出 肺癌基因检测时一定要包含这8种基因靶点：包括EGFR突变、ALK基因融合/重排、KRAS、MET扩增突变、ROS1基因融合/重排阳性、BRAF、HER2基因扩增、RET融合。 针对不同的基因突变使用不同的靶向药物治疗。

所以，对于肺癌患者，特别是NSCLC，首选做“8基因检测”，费用应该在3000-4000左右。如果费用受限，最好首选做EGFR基因检测，这个在国内是最常见的突变基因。

【知乎总结】关注“战癌白衣”

㈤ 如何检查肿瘤

,临床上常用的检查方法包括有创检查及无创检查。有创检查是指在肿瘤检查诊断过程中直接对人体正常组织有一定创伤的检查手段，主要是为获取肿瘤细胞或肿瘤组织、转移淋巴结而进行的针吸细胞学检查、切除活检、切取活检、钳取活检、腹腔镜等。取到的细胞及组织经细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片得到最终诊断。部分涂片、切片还可经免疫组化染色、特殊染色进行诊断和鉴别诊断，甚至将取到的组织细胞进行电子显微镜检查。
（1）常用的有创检查方法
①细胞学检查 临床细胞学检查是根据脱落细胞的形态改变诊断肿瘤的一种方法。细胞学诊断具有简便、安全、准确、迅速和经济等特点。细胞学检查细胞标本的采集方法有：刮、擦、刷和印压取细胞法，主要用于皮肤、呼吸道、消化道上下端、泌尿和生殖道的肿瘤；冲洗液取细胞法，主要是从分泌物或渗出液中采集细胞，如痰液、尿液、乳头液和某些破溃的肿瘤组织。此外，还有细针针吸细胞学检查。
细胞学检查的诊断价值在于准确性高而迅速。一般认为细胞学的诊断价值有时相当于外科标本活检诊断。细胞学诊断可在1～2小时内得到结果，尤其当标本太小、冰冻切片困难时，更宜作细胞学诊断。在普查当中细胞学检查可以筛选出无症状的早期肿瘤患者，尤其是在高危人群中，细胞学的筛选工作更为重要。对于不能取活体组织检查的病例，如血友病、有出血倾向的患者、糖尿病和某些儿童以及不愿做活检的病人，细胞学诊断就成为主要手段。近些年来，细胞学检查有新的发展，如利用免疫组化技术了解恶性肿瘤细胞的组织发生或分化，在鉴别低分化肿瘤类型和确定是否是转移性肿瘤极为重要；检测细胞的性激素受体；利用流式细胞术检查癌细胞染色倍数。
②活组织检查 肿瘤病人为明确诊断，进行病理分期及确定治疗方案都必须有一个明确的组织学诊断。病理组织学诊断需有一定的肿瘤组织标本，这种通过穿刺、手术方式获取病人组织标本的方法叫活组织检查。活组织检查的方式有：针吸活组织检查，一般在局部麻醉下操作，将针头（特制）刺入可疑肿快内然后吸得组织送病理检查；切除活检，是指切除整个肿瘤送病理检查以明确诊断，切除的肿决边界必须有一些正常的组织，此法适用于较小的肿瘤；切取活检，是指肿瘤较大时不能做全部切除，可以采用切取活检。可用于浅表肿瘤，亦可用于深部肿瘤。
在活组织检查前必须选择合适的方式，以达到诊断的要求。那么，活组织检查会不会引起扩散？严格地选择适应证，正确地选择活组织检查方式，合理的操作不会引起癌扩散，关于乳腺活组织病理检查的安全性，国内外学者们进行了长期的研究观察，得出基本一致的结论，认为针吸或切除对预后及生存率无明显影响。
（2）无创检查方法
无创检查是指检查过程中无直接创伤的检查手段，包括：普通X光片、X线造影、超声波检查、CT检查、磁共振检查放射性核素扫描及显像检查、胃镜、肠镜、鼻咽镜、宫腔镜等。
有创检查及无创检查对肿瘤的诊断都具有同等重要的作用，具体某一病人需要什么检查方法要根据病情来决定，我们的原则是尽可能避免带给病人痛苦、不便，以最快、最有效、最经济的方法来明确诊断。

㈥ 如何应用蛋白质组学技术进行肿瘤研究思路设计

双向凝胶电泳 双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置，它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究，蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用，细胞分化凋亡研究，致病机制及耐药机制的研究，疗效监测，新药开发，癌症研究，蛋白纯度检查，小量蛋白纯化，新替代疫苗的研制等许多方面。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。 等电聚焦 等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。等电聚焦凝胶电泳依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。 生物质谱 生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术，其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽键）成肽段，对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种：基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI- MS）。 飞行时间质谱 MALDI 的电离方式是 Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶体，当用激光（337nm的氮激光）照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离。它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱，非常快速（每次分析只需3~5min），灵敏（达到fmol水平），可以精确测量肽段质量，但是如果在分析前不修饰肽段，MALDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列。 电喷雾质谱（ESI-MS） ESI- MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。ESI-MS从液相中产生离子，一般说来，肽段的混合物经过液相色谱分离后，经过偶联的与在线连接的离子阱质谱分析，给出肽片段的精确的氨基酸序列,但是 分析时间一般较长。 目前，许多实验室两种质谱方法连用，获得有意义的蛋白质的肽段序列，设计探针或引物来获得有意义的基因。随着蛋白质组研究的深入，又有多种新型质谱仪出现，主要是在上述质谱仪的基础上进行改进与重新组合。

㈦ 细胞检查的标本采集方法有哪些 原发性肺癌脱落细胞

肺癌发病率及死亡率在世界各国均大幅度增长，是恶性肿瘤的第2、3位。肺癌发病隐匿，早期常无临床症状，易被忽略。大多数病例确诊时已是晚期，故其治疗效果一直不满意。5年生存率为10%左右。但早期肺癌患者手术后5年生存率为60-90%，可见早期诊断是当前肺癌的重要研究课题。肺癌的早期诊断可根据早期临床症状、X线检查，痰液涂征检查及纤维支气管镜等各方面配合进行。痰注解细胞学检查阳性率为60-70%，是诊断肺癌的主要方法之一。
标本采集方法：
1、采集痰液的基本要求
采集痰液的质量和方法直接影响痰检查阳性率。
采集痰液的基本要求是：①痰液必须新鲜。②痰液必须是肺部咳出。
2、细胞学检查方法
（1）支气管液细胞学检查：为在纤维支气管镜下直接吸取支气管液作涂片；或对可疑部位刷取、冲洗及细针吸取标本。
（2）经皮肺部细针吸取检查：为在X线或CT引导下作穿刺获得标本。主要应用于经痰液、支气管液细胞学检查仍为阴性的患者、无痰液患者和肺转移病灶患者。
二、人的痰液中能找到癌细胞吗
痰液中也能找到癌细胞，原发性肺癌源于支气管黏膜上皮，癌细胞脱落到管腔，随痰液排出，因此，痰液里能找到癌细胞。早期肺癌，在X线胸片上还发现不了可疑病灶时，痰液中已能找到癌细胞了。痰液细胞学检查不但是肺癌早期诊断的检查手段之一，对于少数患者，还能从细胞学形态上区分出所属类型。但由于脱落癌细胞较少且分散，以痰检作为肺癌的病理分型并不确切。
癌症确诊后，治疗手段的选择较大程度上影响着患者的生存质量和生存期。此外，作为患者家属，做好家庭护理在患者治疗和康复过程中起着重要的作用。首先要照顾好患者的生活起居：保证其周围环境的干净、安静。做一些病人喜欢吃的高热量、高蛋白、高维生素的具有养阴润肺、止咳功能的食物，少量多餐，放疗期间或放疗后让患者食用流食或半流食。
三、肺部良性病变脱落细胞是怎样的
1.、炎症病变的脱落上皮细胞
（1）假复层纤毛柱状上皮细胞：包括：固缩退变、多核纤毛柱状细胞、核增大的柱状上皮细胞、纤毛柱状上皮细胞增生、储备细胞增生、鳞状化生细胞、纤毛柱状上皮细胞衰变。
（2）鳞状上皮细胞：退化变性、巴氏细胞。

㈧ 研究活细胞或组织最好的方法是

1(常用光镜标本制备技术

切片标本的制备。这是最常用的方法。应用光学显微镜观察机体各部的微细结构时，首先应把所有要观察的材料制成薄片，最基本的就是切片方法，其中石蜡切片更为常用。其制备程序大致如下:

(1)取材与固定。将所要观察的人体或动物的新鲜材料切成适当的小块，立即浸入固定液(如甲醛溶液等)中进行固定，防止离体后结构发生变化，使其尽可能保持活体时的结构状态。

(2)脱水与包埋。为了使石蜡能浸入组织内，把固定好的材料用乙醇等脱水，经二甲苯透明后，再浸入加温溶化的石蜡中浸透包埋使组织块变硬。

(3)切片与染色。将包埋的组织蜡块，用切片机切成5-10μm左右的薄片，贴在载玻片上，脱蜡后进行染色。最常用的染色法是苏木精和伊红染色，简称HE染色。

(4)封固。在切片上滴加中性树胶，用盖玻片进行封固，保存备用。

在制作较硬组织(如骨组织等)或较大组织器官(如眼球)等切片，可用火棉胶代替石蜡进行浸透包埋，再进行染色。为了较好地保存细胞内酶的活性 ，可选用冰冻切片，将组织在低温条件下快速冻结，直接切片，进行染色。

2(涂片、铺片、磨片标本的制备

血液等液体材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色。疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织，可在玻片撕开展平，制成铺片，待干燥后进行固定和染色。骨和牙等坚硬组织除用酸(稀硝酸等)脱钙后再按常规制成切片外，还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。

3(组织化学和免疫组织化学方法

组织化学与细胞化学是应用物理、化学和免疫学方法，对组织、细胞内某些化学成分的定性、定位和定量进行研究，从而探讨与其相关的机能活动。

(1)组织化学。其原理是在组织切片上或被取材料上，加某种试剂，使它与组织或细胞内某些物质起化学反应，形成最终反应产物。光镜组织化学要求其最终产物是有色的沉着物;电镜细胞化学要求其最终产物是重金属沉着物。观察其沉着物的颜色、深浅或电子密度，可对某种物质进行定性、定位和定量。

(2)免疫细胞化学。是将免疫学基本理论与细胞化学技术相结合而建立起来的新技术。主要是应用抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某些肽类和蛋白质等大分子物质的分布。肽类和蛋白质种类繁多，均具抗原性。提取动物的某些肽类和蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，则产生与抗原相应的特异性抗体(免疫球蛋白)，从血清中制备该抗体。如使抗体与荧光素结合，则形成荧光标记抗体。常用的荧光素为异硫氰酸荧光素(FITC)，当用该荧光素标记抗体处理组织切片时，则与组织内相应抗原发生特异结合，在荧光显微镜下呈黄绿色荧光部分，即为抗原抗体复合物，称此为荧光标记抗体法。如抗体与辣根过氧化物酶(HRP)等酶标记，与抗原结合后呈棕红色，可在光镜或电镜下观察，此即酶标抗体法。

4(组织培养

组织培养或细胞培养是在体外研究活组织或活细胞的形态结构和生理功能动态变化的一种很有价值的研究手段，已广泛应用于生物医学的各个领域。组织培养是在无菌条件下进行，从机体取得的活组织或活细胞，或者长期传代培养的细胞株，放入盛有营养液的培养基