㈠ 检验目的基因是否转录用什么方法
应用分子杂交进行检测。
分子杂交技术：不同的DNA
片段之间，DNA
片段与RNA
片段之间，如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分子杂交。检测目的基因是否进行转录，即有无互补RNA产生，可以使用分子杂交技术。
㈡ 比较概述基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的概念、研究方法、优缺点及应用设想
组学omics，研究的是整体. 按照分析目标不同主要分为基因组学，转录组学，蛋白质组学，代谢组学。
基因组学研究的主要是基因组DNA，使用方法目前以二代测序为主，将基因组拆成小片段后再用生物信息学算法进行迭代组装。当然这仅仅是第一步，随后还有繁琐的基因注释等数据分析工作。
转录组学研究的是某个时间点的mRNA总和，可以用芯片，也可以用测序。芯片是用已知的基因探针，测序则有可能发现新的mRNA,
蛋白组学针对的是全体蛋白，组要以2D-Gel和质谱为主，分为top-down和bottom-up分析方法。理念和基因组类似，将蛋白用特定的物料化学手段分解成小肽段，在通过质量反推蛋白序列，最后进行搜索，标识已知未知的蛋白序列。
代谢组分析的代谢产物，是大分子和小分子的混合物，主要也是用液相和质谱。
总而言之，这些技术都想从全局找变量，都是一种top-down的研究方法，原因很简单：避免‘只缘身在此山中’的尴尬。
但因为技术局限，都各有缺点，尤其是转录组和蛋白组数据，基本上颠覆了以前一直认为的mRNA水平能代表蛋白水平的观念，因为这两组数据的重合度太低。
所以目前很多研究都开始使用交叉验证方法。
无论如何，都需要对数据进行分析，有经验的分析往往能化腐朽为神奇。
㈢ 研究某一基因的转录水平上的表达,有哪些实验手段
常用的方法有普通的RT-PCR，以及real-time RT-PCR，以及northern blot，现在也有人用数字PCR。
㈣ 转录因子的研究思路
转录因子（Transcriptionfactor，TF)是一种能与特异DNA序列结合的蛋白，可以单独或与其他蛋白形成复合体，提高或阻断特定基因对RNA聚合酶的招募，调控基因的表达。转录因子的特点是它包含一个或多个DNA结合域（DNA-binding domain，DBDs），通过这些结合域与基因附近的DNA序列结合，从而完成调控。下面结合文章介绍转录因子的研究方法。
01 案例文章简介
案例文章 ：
Ahr-Foxp3-RORt axis controls gut homing of CD4+T cells by regulating GPR15. Sci Immunol. 2020, 5(48). （IF=13.44）
GPR15是一种趋化因子受体，在T细胞向大肠归巢的过程中发挥重要作用。这项研究发现小鼠大肠Treg中的GPR15表达水平最高，芳香烃受体（Ahr）可通过增加GPR15的表达促进Treg向大肠的归巢，而Foxp3及RORγt在Ahr介导的GPR15表达上调中分别起到正向及负向调控作用。另外，在人结肠Treg中也可重复上述发现。该研究提示，Ahr-Foxp3-RORγt轴可通过调控GPR15的表达调节Treg的肠道归巢，从而影响肠道免疫稳态。
02 案例文章的研究内容
GPR15在小鼠大肠Treg中表达量最高，并且受Ahr控制。GPR15是一种孤儿鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）偶联趋化剂受体（GPCR），最初是基于其与其它GPCR家族成员的相似性而被发现的，也被称为HIV或猿猴免疫缺陷病毒共受体。最近有研究表明，GPR15对小鼠和人的调节性T细胞（Treg）和效应T细胞（Teff）的肠道归巢至关重要。芳香烃受体（Ahr）是一种环境传感器，可检测外源性配体，如环境毒素（如二恶英），以及宿主细胞、微生物群和饮食（如色氨酸代谢物）产生的内源性配体。通过流式细胞术检测GPR15蛋白在各种T细胞中的表达水平，发现Treg中GPR15的表达水平最高。在Ahr缺陷小鼠的CD4+ T细胞中，GPR15的表达水平降低。而在在Ahr过量表达小鼠的CD4+ T细胞中，GPR15的表达水平升高。
Ahr通过直接与Gpr15基因座结合调节GPR15表达。利用ChIP-seq在iTreg 和TH17细胞中发现Gpr15基因是Ahr最重要的全基因组靶点之一。Ahr在Gpr15基因座具有两个实质性的结合峰（在距转录起始点+15和+17 kb处）。
Foxp3与Ahr协同作用，正调节GPR15的表达。在CD4+ T 细胞中用shRNA干扰Foxp3，GPR15的表达水平降低。在来自Ahr+/+小鼠的iTregs细胞中强制表达Foxp3可显着提高其GPR15的表达，在来自Ahr-/-（Ahr缺陷）小鼠的iTregs细胞中却没有这种效果。在TH0条件下培养的分选CD4+T细胞中同时表达Ahr和WT Foxp3或Foxp3△FKH可以增加GPR15的表达，而Foxp3单独表达并不影响GPR15的表达。ChIP-qPCR表明Foxp3在Gpr15基因座的结合位点与Ahr相同（距转录起始点+15和+17 kb处）。Ahr缺陷不影响Foxp3在Gpr15位点的结合，但是在iTreg中敲低Foxp3后，Ahr向Gpr15基因座的招募减少。
RORγt负向调节GPR15表达。在RORγt缺陷Treg中，GPR15的表达增加。RORγt和GPR15表达的负相关系在Ahr充足和Ahr缺陷Treg中都很明显。此外，与来自RORγt充足的CD4+ T细胞分化的iTregs和TH17细胞相比，来自RORγt缺陷的CD4+ T细胞具有更高的GPR15表达。
RORγt拮抗Ahr在Gpr15基因座的DNA结合。在从RORγt缺陷小鼠分化的iTregs或TH17细胞中，Gpr15基因座的Ahr募集显着增强，而在没有Ahr的情况下，Gpr15基因座的RORγt结合显着增加，提示Ahr和RORγt与Gpr15基因座结合存在竞争。此外在RORγt缺陷iTregs中表达RORγt抑制GPR15表达。
Ahr通过调节GPR15促进Tregs向肠道归巢。在大肠（LI）和小肠（SI）中，归巢的Ahr缺陷iTreg相对于WT对照组减少了大约三倍。GPR15的强制表达显着增强了Ahr缺陷Treg向LI的归巢，但不增强到包括SI在内的其他器官的归巢，这与GPR15在Treg大肠归巢中的关键作用一致。此外， 在LI中WT-iTreg和GPR15恢复表达的Ahr缺陷iTreg的归巢能力相当（而不是在SI中），这表明GPR15在Ahr缺陷iTregs中的表达受损是其向LI归巢缺陷主要机制。在Ahr缺陷的iTregs中强制表达GPR15促进其在炎症期间归巢至LI。此外，强制表达GPR15的Ahr缺陷iTreg的过继性转移显着抑制了肠道炎症，表现为减轻了肠道组织学变化和降低了促炎细胞因子（即Tnf和Il1b）的表达。
Ahr信号促进GPR15在人Treg中表达。与之前的报告显示GPR15在人类Treg中的低表达不同，本研究检测到GPR15在所有患者样本中的表达。与外周血单个核细胞（PBMCs）相比，结肠Treg的 GPR15表达显着增高。人Treg中Ahr mRNA表达的增加与Gpr15表达的增加以及其他Ahr靶基因（Cyp1a1和Ahrr）的表达增加有关，这与Ahr促进Gpr15表达的作用相一致。此外，通过蛋白质染色分析GPR15和Foxp3的表达，发现Foxp3的表达与人CD127-CD25+ T细胞中GPR15的表达呈正相关。加入Ahr的配体FICZ显着增强了iTreg中GPR15和其他Ahr靶基因的表达，但不增强Ahr的表达，而用一种特异性Ahr拮抗剂CH223191治疗可消除人iTregs中GPR15的表达。
03 转录因子研究的技术手段
❶ 双荧光素酶实验
某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现非共价结合，从而对基因的表达起增强或抑制的作用。双萤光素酶报告实验（al luciferase assay）是检测转录因子和靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，通过检测转录因子表达水平的改变对荧光素酶基因表达水平的影响，分析转录因子能否作用于启动子。
其原理简述如下 ：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到萤光素酶编码序列上游的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2） 将要检测的转录因子的表达质粒、干扰质粒或者siRNA与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。通常会用另一种萤光素酶作为内参，避免转染效率对实验结果的影响。
（3） 加入特定的萤光素酶底物，萤光素酶与底物反应，发光，通过检测发光强度可以测定萤光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与靶启动子片段有作用。
❷ 染色质免疫共沉淀
染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)被广泛用于研究体内转录因子与靶基因启动子上特异性核苷酸序列的结合，并已成为研究染色质水平基因表达调控的最有效的方法。ChIP的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段。通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的DNA信息。ChIP-PCR用于鉴定转录因子结合到靶基因的启动子上，而ChIP-seq用于筛选转录因子直接结合的靶基因，探究转录因子的作用元件。
❸ 电泳迁移率改变试验
电泳迁移率改变试验 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA ) 也称凝胶阻滞试验，DNA 在凝胶中的迁移率与相对分子质量及构型有关。裸露DNA与含有结合蛋白的DNA- 蛋白质复合物电泳时，裸露 DNA 迁移率主要取决于DNA本身，DNA-蛋白质复合物由于体积较大而滞留在较后位置。电泳迁移率改变试验用于体外分析转录因子与靶基因启动子的结合。将一系列序列不同的DNA片段与转录因子进行电泳迁移率改变试验，可以探究转录因子的体外结合序列。
㈤ 转录因子研究的思路
转录因子是起正调控作用的反式作用因子，是一类蛋白分子，
它能通过与基因上游5’ 端特定序列专一性结合的方式来使目的基因顺利表达。在转录起始过程中，可调控RNA 聚合酶与DNA模板的结合。 转录因子除了能与基因上游的启动子区域结合外，也可以转录因子复合物的形式和其它转录因子结合来调控基因的转录。
无论是TF还是TFBS的同类预测，生物信息的研究手段主要依赖于蛋白质或者DNA的序列保守性进行。具体算法和软件有隐马尔可夫模型,Gibbs抽样,贪婪算法等，但这次重点在于介绍研究转录因子的实验方法，因此不过于叙述这部分信息。
实验方法主要有两种思路：1. 通过已知TF寻找未知TFBS；2.通过已知TFBS寻找未知TF。无论哪种手段，前提都是基于蛋白与DNA之间的结合关系寻找，即交叉寻找目标，这有别于计算机技术的同类型寻找。
https://www.omicshare.com/forum/forum.php?mod=viewthread&tid=756&fromuid=50125
㈥ 转录组测序流程步骤是哪些
以真核转录组测序为例，实验流程为总RNA提取-mRNA分离-建库试剂-定量-文库回收-桥式扩增-上机测序；项目分析流程为数据产出数据=数据去杂-转录组拼接-SSR分析及SNP分析-基因功能注释-基因表达差异分析-差异基因表达模式聚类-差异基因富集分析。
㈦ 转录组测序研究怎么做
首先需要做的是将测出来的readsmapping到基因组上，与此同时可以得到数据mapping比例等信息，依靠这些信息可以进行数据质量的分析，然后还可以统计每个基因的表达情况，如果是比较不同样本之间的转录组，则可以进行差异表达基因的分析
㈧ 2篇文章带你Get肿瘤空间转录组研究思路
10x Visium空间转录组技术继问世以来便受到了科研人员的青睐，已广泛应用于发育生物学、神经生物学、肿瘤生物学等领域的研究。尤其在肿瘤研究领域可以深入揭示肿瘤异质性、肿瘤微环境、肿瘤发生发展、肿瘤浸润细胞等。但目前大多数利用10x Visium空间转录组技术的研究均由国外科学家完成。2021年4月，四川大学华西医院的研究人员利用10x Visium空间转录组技术解析了非小细胞肺癌的空间轨迹。2021年5月，上海东方肝胆外科医院的研究人员再次利用该技术揭示原发性肝癌的空间转录异质性。下面我们一起来了解下这两篇文章的研究思路吧！
一、文章一 ：空间转录组测序揭示非小细胞肺癌的空间轨迹
1、研究背景
肺癌已成为全球癌症死亡的主要原因，占恶性肿瘤的22.7%。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%以上，肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）是两种主要的组织学亚型。获取细胞空间位置，了解肿瘤微环境和肿瘤转移机制对治疗非小细胞肺癌具有重要意义。
2、研究方法
对从12个个体收集的4张LUAD和 8张LUSC切片进行10x Visium空间转录组测序。
3、研究思路
4、研究结果
（1）LUSC表现出更强的侵袭能力
对所有样本的整合聚类分析揭示了10个不同的亚群，但LUAD和LUSC之间的聚类差异很大。LAUD和LUSC之间的显着差异表明它们可能具有不同的空间转录表达模式。 SLPI 、 SCGB3A1 、 SCGB3A2 、 MS4A15 和 NR4A1 等与癌症恶性相关的基因在LUAD_1中高表达，而 SPP1 、 GSTA1 、 MAL2 和 MGST1 等与肿瘤转移和肿瘤细胞增殖相关的基因在LUSC中高表达。此外，LUSC的空间微环境显着富集与上皮-间质转化相关的途径。这些结果表明LUSC表现出更强的侵袭能力，可直接向周围和淋巴结转移，远处转移较少，具有丰富的免疫微环境和细胞通讯。
（2）沿空间轨迹的瞬时基因表达模式
沿肿瘤的侵袭轨迹， DSG2 和 SPRR3 等促进肿瘤增殖相关的基因调节细胞增殖，在非小细胞肺癌中侵袭和细胞凋亡过程中减少，而肿瘤进展相关基因 BGN 和转移生长相关基因 POSTN 的功能逐渐增强。此外，能量代谢过程途径沿轨迹减少，而细胞外基质组织、免疫反应、抗原处理和呈递在肿瘤基质中增强。
（3）肿瘤亚克隆空间表达异质性
将肿瘤细胞重新聚类为4个亚群。肿瘤亚群之间的差异富集通路差异明显。所有亚群都是恶性细胞，且含有不同程度的拷贝数变异。上皮间质转化（EMT）评分高的亚型在患者间相似，这些亚克隆不同于与侵袭和转移相关的上皮间质转化水平。此外，肿瘤亚克隆的免疫细胞组成和肿瘤比例有显着差异，而且肿瘤纯度与肿瘤EMT的趋势相反。
（4）肿瘤内空间轨迹推断
stlearn伪时间轨迹分析表明肿瘤细胞的空间轨迹方向总是从簇1开始，指向其他子群，呈发散状态。这可以解释为亚克隆之间的进化轨迹是从具有低转移侵袭性的亚克隆开始，并逐渐进化为具有强侵袭和转移能力的亚克隆。LUSC_1具有两个分支，主要分支具有多个亚分支，是肿瘤主要的演化轨迹。LUSC_3也具有类似的结果，反映了LUSC亚克隆进化固有的分支进化。
二、文章二：原发性肝癌空间转录组分析
1、研究背景
原发性肝癌（PLC）是死亡率第二高的肿瘤，其中肝细胞癌（HCC）和肝内胆管癌（ICC）是两种主要的组织学亚型。PLC由于其高度的肿瘤内异质性，有效非手术治疗策略较少，因此准确地评估空间异质性对于了解肿瘤细胞亚群是必不可少的。
2、研究方法
收集了7名患者的21份组织标本，包括5例肝细胞癌（HCC-1、2、3、4、5）、1例肝细胞和胆管细胞癌混合型（cHC-1）和1例肝内胆管细胞癌（ICC-1）。对于HCC-1/2/3/4和cHC-1，进行三个连续切片（N：非肿瘤；L：前缘；T：肿瘤）；对于ICC-1，仅收集了L切片；对于HCC-2，还收集了门静脉癌栓的切片（P）。利用10x Genomics Visium平台对这些切片进行空间转录组测序。
3、研究思路
4、研究结果
（1）PLC空间异质性的不同模式
聚类分析表明HCC-1T、HCC-3T和HCC-4T的簇具有区域分布特征，而HCC-2T和cHC-1T的簇是相互交织的。HCC-3L的簇5是一个独特的簇。分层聚类分析发现来自相同类型区域的簇在总体上更相似，扩散图分析表明正常和肿瘤区域簇位于分支中，基质区域簇位于连接处。间质区域富含成纤维细胞和内皮细胞，而不同肿瘤区域的免疫细胞表现出高度的多样性。变异曲线分析发现T细胞、B细胞、内皮细胞和成纤维细胞的变异模式高度相似，而NK细胞和髓细胞高度变异。
（2）肿瘤边缘微环境特征
HCC-1、HCC-3和HCC-4的L&T切片的肿瘤区域具有更高的空间连续性和更低的转录组多样性。包膜完整的肿瘤组织具有较高的空间连续性和较低的转录组多样性，其完整性与肿瘤细胞的空间异质性及其周围间质和免疫细胞的分布密切相关。基因组变异分析发现，包膜完整性对正常和肿瘤区域的标志通路活性影响不大。
（3）PLC的瘤内异质性
肿瘤区域spots的标志通路活性的分级聚类识别出两个模块，分别显示细胞周期、代谢相关途径的高活性和炎症、血管生成、上皮间质转化途径的高活性。HCC-1的肿瘤簇属于两个不同的模块，簇2（T.2）为模块2，簇5和6（T.5&6）为模块1。从空间转录组数据推断出的CNV大多与WES数据一致，这表明从ST数据推断出的CNV是可靠的。而且空间转录组数据在不同肿瘤簇之间产生了更微妙的CNV异质性。这些结果表明肿瘤内存在广泛的空间异质性，某些肿瘤的不同亚群具有不同的通路活性和不同的细胞起源，不同亚群的细胞通讯可能对肿瘤的生态和进化至关重要。
三、总结
空间转录组技术可以解析肿瘤异质性，肿瘤免疫微环境及肿瘤转移机制。未来空间转录组技术将在筛选肿瘤药物靶点，提高临床诊断准确率及发掘新的治疗手段方面提供新的思路和见解。
参考文献：
1. Li Zhang et al. Spatial transcriptome sequencing revealed spatial trajectory in the Non-Small Cell Lung Carcinoma. bioRxiv, 2021.
2. Rui Wu et al. Comprehensive Analysis of Spatial Architecture in Primary Liver Cancer. bioRxiv, 2021.
㈨ 转录组数据分析RNA-seq
转录组学（transcriptomics）的研究对象是全基因组尺度下所有转录本（transcript），即转录组（transcriptome）
将荧光标记的cDNA制成微阵列探针来测定样本中特定转录本含量。又称为 基因芯片（Gene Chip）、微阵列（Microarry）。
获取表达量的步骤：
提取RNA -> 反转录 （->扩增）->标记->杂交->扫描->获得原始数据
局限性：
• 只能检测已知或；确定性的序列
• 无法检测新发现的，未放置到芯片上的基因
• 有部分探针的信号可能会收到非特异性杂交或个体序列差异的影响
基于高通量二代测序技术的转录组学研究方法。
特点：
高通量、低成本；不依赖已知转录本探针，可以测全转录组；对于低表达丰度的转录本灵敏
度高；以reads数量腐酸表达，比芯片的荧光信号更为精确。
应用和最新进展
依据文库要求检查完整性分值，如果不合格将不适合建库测序。一些特殊文库对RNA提取要求很高，如全长转录组文库，需要特殊提取流
程保证RNA 完整性。
需要的数据：参考基因组数据fasta、GFF注释信息、双端测序的fastq文件
我这里用的是普通栽培稻( Oryza sativa L.)的参考基因组和、GFF文件和SRR17439319数据。
参考步骤： https://blog.csdn.net/sunchengquan/article/details/79781366
注意：配置时，需要在bin目录下执行 ./vdb-config --interactive ，然后弹出一大堆乱七八糟的之后，按X退出即可。再执行./fastq-mp，若没有报错，而是帮助信息的话即可以使用。
测序数据分析前需要经过数据预处理，并检查数据GC含量、序列重复成俗、是否存在接头等。
在质控后，再质检一次，对比看看有什么不同。
将 reads 匹配到参考基因组或转录组的相应位置上
• 非剪接比对：转录组
Bowtie、BWA
• 剪接比对：参考基因组
STAR、HISAT、Topha
对鉴定SNP做了优化： GSNAP、MapSplice等
① 建立基因组索引
②利用注释文件比对
没有注释文件的比对方法
③ SAM 文件处理
使用 samtools 对 SAM 文件排序并转化为 BAM 文件。samtools是一个用于操作sam和bam文件的工具合集，包含有许多命令。
④比对结果可视化
比对结果使用 IGV 、Genome Maps 和Sacant 等可视化查看。
例如：IGV 通过读入基因组和注释信息以及BAM 文件展示比对结果。
需要额外添加 BMA 的索引: samtools index test_sorted.bam test_sorted.
⑤比对结果评估
比对结果评估工具：RSeQC、Qualimap
计算FPKM
-p 线程数
-G 参考基因组注释
-e 只估计已给参考基因组注释的基因丰度
-A 基因丰度估计输出文件
-o 输出文件