中试反应器放大的研究方法主要有

A. 发酵50l到500l的中试放大怎么做

如何做好中试放大， 对小试研究的指导 中试放大
1、中试—小型生产模拟试验品生产申报的一个重要的 基础内容
2、进行中试的条件
3、中试要实现的目标
4、中试的研究内容
5、新技术/设备的应用给中试放大赋予新的内涵 如何做好中试放大，应注意哪些问题，避免那些问 题
总结
1、中试——小型生产模拟试验 是从小试过渡到工业生产必不可少的重要环节； 是在模型化的生产设备上（设备的设计要求和操作原 理与生产设备相同）基本完成由小试工艺向生产操作 规程(草案)的过渡； 确保按操作规程（草案）能始终如一地生产出预定质 量标准的产品/中间体。
2、进行中试的条件 产品的合成路线已确定； 小试的工艺考察已完成： 各部反应的工艺过程及工艺参数已确定（如加料方式、 反应时间、反应温度、压力、终点控制，提取、分离、 结晶、过滤、干燥等）； 对成品的精制、结晶、分离、干燥的方法及要求已确 定（晶型、残溶）； 小试的3~5批稳定性试验说明该小试工艺可行、稳定； 必要的材质腐蚀性试验已经完成； 已建立原料、中间体和产品的质量控制方法/质量标准。 成熟的小试是进行中试/生产的最主要的基础
3、中试要实现的目标
目的
1、考查小试工艺的工业化生产的可能性，核对、校正和 补充实验室数据，并优化工艺条件；
2、制定生产工艺规程；为车间设计、施工安装、中间质 控以及生产管理提供必要的数据和资料。 〇物料和能量衡算，计算产品质量、经济效益、劳动强 度等
3、解决实验室阶段未能解决或尚未发现的问题；
4、为临床前的学和理毒理学研究以及临床试验提供 一定数量的品。
指导原则（第二稿）对化学原料的中试放大提出了八 项主要任务
1、考核实验室提供的工艺路线在工艺设备、条件、原材料等 方面在中试放大时是否有特殊的要求，是否适合工业化生 产；
2、确定所用起始原料、试剂或有机溶媒的规格或标准
3、验证小试工艺是否成熟合理，主要经济指标是否接近生产 要求；
4、进一步考核和完善工艺条件，对每一步反应和单元操作均 应取得基本稳定的数据；
5、根据中试研究资料制订或修订中间体和成品的质量标准、 分析方法；
6、根据原材料、动力消耗和工时等进行初步的技术经济指标 核算；
7、提出“三废”的处理方案；
8、提出整个合成路线的工艺流程，各个单元操作的工艺规程。 一般来说，中试所采用的原料、试剂的规格应与工业化生 产时一致。

B. 中试放大的详细内容

当化学制药工艺研究的实验室工艺完成后，即药品工艺路线经论证确定后，一般都需要经过一个比小型试验规模放大50~100倍的中试放大，以便进一步研究在一定规模装置中各部反应条件变化规律，并解决实验室阶段未能解决或尚未发现的问题。
新药开发中也需要一定数量的样品，以供应临床试验和作为药品检验及留样观察之用。根据该药品剂量大小，疗程长短，通常需要2~10kg数量。
中试放大是药品研发到生产的必由之路,也是降低产业化实施风险的有效措施。文献报道的药物的合成工艺多为实验室工艺，为科研人员的进行科学研究所采用的工艺。在药物的研发初期申报单位所采用的合成工艺多在文献工艺的基础上进行研究，但该工艺在产业化生产时仍需进行很多改进。中试放大是联结二者的桥梁，可为产业化生产积累必要的经验和试验数据，具有重要意义。
确定工艺路线后，每步化学合成反应或生物合成反应不会因小试、中试放大和大型生产条件不同而有明显变化，但各步最佳工艺条件，则随试验规模和设备等外部条件的不同而有可能需要调整。

C. 化工中的“设备选型”和“过程放大”

化工生产的过程，一言以蔽之，就是化学实验技术在工程中的应用。然而化工生产不是仅仅是化学问题，在化学实验室的理想条件下，实验的实施相对容易，可以得到比较理想的指标。实验室的规模，可以使很多过程在间歇条件下实现。实验室中的过程通常是在尽可能简单的条件下进行，并尽可能排除对过程产生不利影响的因素，在所寻求的优化条件下操作，以期得到最好的结果，筛选出最好的催化剂并获得反应物浓度、流速和反应温度等要素之间的关系。但是在工业生产中，这些过程比实验室中进行的同一性质的过程大数万数十万倍，并且大型过程多数是连续的，在小型设备中可不予考虑的不均匀性，在大型设备中显得十分突出并且严重影响着生产指标。因此，将实验室中所获得的结果在工业规模实施就成了一个完全不同的问题。要将实验室结果过渡到化工生产，在连续不断的过程中大规模、动态地完成指定的化学反应及其他物理过程，就必须综合其它学科和技术，搞清楚并控制住无聊的流动、混合、反应和分离等一系列过程。如果说实验室化学家的任务是制备催化剂，筛选出最好的催化剂，并通过实验确定适宜的反应条件，那么化工项目的开发，即化学实验原理在工业生产领域的应用，则是化工生产过程工程师的任务。

第二部分：化工项目开发的方法介绍
设备选型
在化学家工作基础上，过程工程师的任务是选择最适宜的工业反应器型式或称选型。选型过程包括对多种因素的综合考虑。例如，所能达到的指标、设备投资、能耗和操作费用、设备制造和材料、环保和安全性、操作和控制以及人员素质等。

过程放大
所谓放大，是根据所选定的反应器型式，通过实验或其他可以利用的一切手段，在最短的时间内，用最少的投资，进行设备的放大，供设备工程师选购或制造设备所用。
现代过程工业的标志之一是设备大型化，因为过程工业的效益获得主要依靠设备的大型化，而不是依靠增加设备数来实现。化学工业属于过程工业，随着技术的进步，化学工业规模不断增大。例如，单套乙烯装置生产能力从30万吨/年 提高到45万吨/年，又提高到60万吨/年乃至100万吨/年。又如甲醇，单套装置的能力从10万吨/年提高到40万吨/年，又提高到100万吨/年乃至200万吨/年。总之，规模是在不断扩大的。
长期以来，就化学工业来说，小试验撑过为什么不能迅速产业化，就技术而论，对以化学反应为特征的项目来说，认识放大规律和利用化工放大技术以实现规模生产时关键，也是我国与发达国家的重要差距。（换个位置）
为了能真正地面对国际竞争，我们必须重视过程放大，建设大型化化工装置。
化工过程有下面两种类型，一是传递过程，包括传动、传热和传质过程，属于没有物质组成变化的物理过程；二十化学反应过程那个，属于有组分变化的化学过程。这些过程是在设备中实现的，所以过程放大就是设备能力的放大。

过程放大一般经历的阶段
（1） 实验室研究阶段；
（2） 小量试制阶段；
（3） 按预定工艺规模进行概念设计；
（4） 中试，着重解决概念设计中遇到的问题；
（5） 编制工艺软件包；
（6） 按要求的规模进行工程设计；
（7） 工业装置的建设和投产。
过程放大的方法
1.全流程逐级放大
一种最为传统的方法是通过从小型试验、稍大规模的试验、中间试验、扩大中间试验，逐级地实现大型工业生产。这种通过多个试验层次的逐级放大过程必然是耗时费资的。在过程工业发展的早期，经验放大几乎成了唯一的方法。过程开发技术发展到今天，纯经验放大显然不大可取了，但对于一些过于复杂的、人们认识甚少的过程，有时还不得不求助于
经验放大。
2.数学模拟法放大
建立数学模型(一组数学方程)对过程进行描述，并通过不同规模的实验以确定模型的参数，然后通过计算机模拟过程大型化后的各种行为，以确定放大的准则。这种放大从理论上是合理的，然而事实表明，单纯地用数学模拟法放大的成功例子不多，其原因是：
(1)由于实际过程通常极为复杂，而人们对它们
的认识往往还不够系统和全面，因而为数学模型的
建立带来困难；
(2)即使对复杂的实际过程已完全了解，数学模型的建立必须作出不少简化假定，因而为了便于描述，很可能得到了过度简化的模型；
(3)实验测定的模型参数的可靠性往往受实验手段的限制和实验过程中噪音的干扰，因此模型参数存在或多或少的不确定性。
由于数学模拟法放大只能适用于人们对过程的认识已相当透彻，参数的测定相当可靠的场合。随着人们认识水平、测试手段和计算机应用水平的提高，数学模型与计算机相结合，建立全流程的数学模型进行放大，不乏有成功的例子，如低压法甲醇就是一例。诚然，利用数学模型仍需做一些辅助实验作为补充和验证，但采用数学模拟放大是过程放大最省时省钱的有效方法。

过程放大应注意的问题
1. 必须保证设备放大后经济上的合理性和各项指标的先进性及系统调优
设备放大以后还必须保证经济上的合理性和各项指标的先进性。往往放大之后，有一些指标趋于合理，如能耗一般可以降低。但另一些指标，由于在大型化以后，如反应产物的收率往往有所降低，温度等操作条件不易控制，这就是通常所说的“放大效应”。放大效应被认为是一种弊端。我们的一个重要任务就是尽可能使这些指标在过程放大后仍然保持一个较高水平。另一个现实是，一个实际过程，通常不能处在最优的操作状态下。这是因为过程的复杂性和人们的认识能力限制所决定的，何况过程的一些参数会随时间变化。
上述仅就单个设备而言，因为过程是由多套设备组成完整的流程，即是一个系统。从这个意义上讲，过程放大应该是系统放大，系统中单个设备的放大并不等于系统放大，因此必须要系统优化。所以，完整的过程放大应包括设备放大与系统调优。
2. 中试规模的确定
为什么要进行中试?需要验证小试规律，但更重要的是解决大生产装置可能遇到的问题，那么大生产装置可能会遇到什么问题?对于一个新产品，尚未工业化是无法回答的，为了尽可能预知可能遇到的问题，就是先搞一个概念设计，概念设计的规模应是预想的工业装置规模，在进行概念设计的过程中，可以套用现有的过程经验和消化公开发表的文献资料，但在假想的工业规模设计过程中，仍会碰到许多问题(如数据、材质、控制方法、反应终点控制、物料平衡等)，这些问题妨碍概念设计进一步深入进行，恰恰就是这些问题要在中试中解决。为了解决或搞清这些问题，可能要求中试必须达到一定的规模，这就是中试规模确定的依据和中试设计应达到解决这些问题的途径。
3. 要把工程试验数据的获得作为中试的目标之一
许多开发项目不重视基础数据的开发，将会影响工业装置的运行，一个实际例子是某装置建成后，反应釜中物料不进行反应，而反应条件、原材料均符合实验室要求，影响工期达半年。经多次试验比较才查明，搅拌器使用了铜轴瓦，铜离子会阻止反应进行，但这一点，在小试时并未作为相关数据提出，以致设计时没有注意到这一点而影响生产。又如结晶的条件，影响晶粒大小的条件因素是什么，如果能做好相关数据对放大是大有益处的。又如多元组分的气液平衡数据，往往查不到，必须要对反应的全组分进行测定才能获得。又如反应终点的测定和控制等等，这些均是小试不可能做的，而中试是必须要做的。

4. 材质试验
材质的耐腐蚀试验是中试的主要任务，关于这一点，相信大部分可在耐腐蚀手册及供应商获得足够信息。除此之外，还应特别注意少量离子的存在，对腐蚀的作用，如金属离子的影响、卤素的影响、热应力、腐蚀应力等，应测定或做挂片试验，特别要注意“实际”介质，而不是纯介质。如醋酸介质的腐蚀性在有关的手册上也能查到，但醋酸中含有微量的卤素，到底有多大的腐蚀性，没有现成的资料，必须对实际介质进行研究。

5. 注意关键设备的选型
一一般的泵、风机、压缩机的放大不应存在大的问题，精馏、分离的放大，目前也可解决。但反应器是中试要解决的重点，反应器采用何种型式为好，对传热、反应温度控制、催化剂寿命、中毒、再生，通过中试要搞清，为放大设计提供依据。另外特殊的如干燥型式，特别是浆料，应由试验选定设备。又如过滤，看似简单而实际不同物料的过滤机型式选择，滤布选择，也应由试验确定，避免工程返工。

6．对原材料中间产品及成品的研究
一般实验室阶段只用试剂级产品作原料，中试尽可能采用工业级产品作原料，其少量杂质对产品质量有无作用，是什么影响，采用什么方法进行预处理，这些问题要在中试中搞清楚。有些可能要脱水，有些可能要预蒸馏。小试数量少，有些杂质不一定分离出，中试数量多了，尽可能作全分析，把中间体、成品、残渣的组成、成分搞清楚，有利于做物料平衡及对全过程作通盘分析。

7．安全、生产、环保
应收集全部原料中间体及成品的MSDS，对其物料化学特性、毒性全面了解，并采取相应的防护及消防，安全措施。
对排出物、废渣、废液、废水的成分及处理方式作认真研究，以指导工程设计进行。
8. 注意放大过程中，研究人员与工程设计人员的密切配合
因为研究人员主要是在机理上理论上研究较多，工程设计人员会更多考虑工艺布置系统放大等问题。发挥各自特长，有利于工作顺利进行。

总结：
总之，化工过程的放大是新产品开发过程中的必由之路，是科研转化为生产力的毕竟途径。这个环节处理好了，就能加速实现新产品的工业化。过程放大过程中，不能停留在拿出产品，打通流程；也不仅追求设备和单元过程的优化，而是最终追求全系统的优化。
实验室阶段的小试是探索性的，着重研究机理、可行性、物性数据、查(测定)找出工艺路线。这是以研究人员为主，工程人员参加，在小试的基础上，进行目标规模的概念设计，从中找出中试(放大)需要解决的问题，用于指导中试装置的设计。概念设计可由研究人员完成，也可由工程人员完成，当然两者结合共同进行更好。中试装置规模和流程的确定，应能满足概念设计的需要，期间必须做到工程人员和研究人员的密切配合。中试应该是全流程的，否则达不到要求。由于可以借鉴现成有效单元过程和进行计算机模拟，并不机械地要求全流程，避免低水平的重复，集中精力解决难题。在中试完成的基础上完成软件包的编制、基础设计，然后进行工程设计。当然在上述每一阶段均要做技术经济分析，以判断项目的前景，可行性。

D. 如何做好中试放大，对小试研究的指导

如何做好中试放大， 对小试研究的指导 中试放大
1、中试—小型生产模拟试验药品生产申报的一个重要的 基础内容
2、进行中试的条件
3、中试要实现的目标
4、中试的研究内容
5、新技术/设备的应用给中试放大赋予新的内涵 如何做好中试放大，应注意哪些问题，避免那些问 题
总结
1、中试——小型生产模拟试验 是从小试过渡到工业生产必不可少的重要环节； 是在模型化的生产设备上（设备的设计要求和操作原 理与生产设备相同）基本完成由小试工艺向生产操作 规程(草案)的过渡； 确保按操作规程（草案）能始终如一地生产出预定质 量标准的产品/中间体。
2、进行中试的条件 产品的合成路线已确定； 小试的工艺考察已完成： 各部反应的工艺过程及工艺参数已确定（如加料方式、 反应时间、反应温度、压力、终点控制，提取、分离、 结晶、过滤、干燥等）； 对成品的精制、结晶、分离、干燥的方法及要求已确 定（晶型、残溶）； 小试的3~5批稳定性试验说明该小试工艺可行、稳定； 必要的材质腐蚀性试验已经完成； 已建立原料、中间体和产品的质量控制方法/质量标准。 成熟的小试是进行中试/生产的最主要的基础
3、中试要实现的目标
目的
1、考查小试工艺的工业化生产的可能性，核对、校正和 补充实验室数据，并优化工艺条件；
2、制定生产工艺规程；为车间设计、施工安装、中间质 控以及生产管理提供必要的数据和资料。 〇物料和能量衡算，计算产品质量、经济效益、劳动强 度等
3、解决实验室阶段未能解决或尚未发现的问题；
4、为临床前的药学和药理毒理学研究以及临床试验提供 一定数量的药品。
指导原则（第二稿）对化学原料药的中试放大提出了八 项主要任务
1、考核实验室提供的工艺路线在工艺设备、条件、原材料等 方面在中试放大时是否有特殊的要求，是否适合工业化生 产；
2、确定所用起始原料、试剂或有机溶媒的规格或标准
3、验证小试工艺是否成熟合理，主要经济指标是否接近生产 要求；
4、进一步考核和完善工艺条件，对每一步反应和单元操作均 应取得基本稳定的数据；
5、根据中试研究资料制订或修订中间体和成品的质量标准、 分析方法；
6、根据原材料、动力消耗和工时等进行初步的技术经济指标 核算；
7、提出“三废”的处理方案；
8、提出整个合成路线的工艺流程，各个单元操作的工艺规程。 一般来说，中试所采用的原料、试剂的规格应与工业化生 产时一致。

E. 什么物质和5'AMP混合难于萃取分离但通过多次萃取又能分离

现代生物制药工艺学上课讲义（2）

第二章 生物制药工艺技术基础
第一节 生物材料与生物活性物质
一、生物材料的来源
供生产生物药物的生物资源主要有动物、植物、微生物的组织、器官、细胞与代谢产物。应用动植物细胞培养与微生物发酵技术也是获得生物制药原料的重要途径。基因工程技术与细胞工程技术和酶工程技术更是开发生物制药资源的新途径。
（一）动物脏器
（1）胰脏 （激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）
（2）脑 （脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、神经肽等）

（3）胃粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）
（4）肝脏（维生素、磷脂类、胆固醇）
（5）脾脏（免疫器官）
（6）小肠（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃肠道激素）
（7）脑垂体（各种激素）
（8) 心脏（细胞色素C、辅酶Q10）
其它等
（二）血液、分泌物和其它代谢物
血液制品：人血制剂、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等。
尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生长因子、HCG

（三）海洋生物
（1）海藻
（2）腔肠动物 海葵毒素
（3）节肢动物 甲壳素
（4) 软体动物 多糖、多肽、毒素
（5）棘皮动物 海星、海胆、海参 海参素抗癌
（6）鱼类 鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素
（7）爬行动物 龟 滋阴养肾 抗肿瘤
（8）海洋哺乳动物 鲸鱼鱼肝油
（四）植物
生物碱、强心甙、黄酮、皂甙、挥发油、树脂、鞣质等。

（五）微生物
1.细菌
常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：
（1）氨基酸
利用微生物酶可转化对应的α酮酸或羟基酸作用产生氨基酸。
（2）有机酸 柠檬酸、苹果酸、乳酸
（3）糖类 利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。
（4）核苷酸类 用细菌可生产5‘－AMP，5’－肌苷酸
（5）维生素 VB1,VB2，VB6, Vc
（6）酶 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶

2.放线菌
放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约2/3产自放线菌。
（1）氨基酸 发酵法
（2）核苷酸 5-脱氧肌苷酸
（3）维生素
（4) 酶
3.真菌
（1)酶
（2）有机酸
（3）氨基酸
（4）核酸及有关物质
（5）维生素
（6)促生素
（7）多糖

4.酵母菌
（1）维生素
（2）蛋白质与多肽
（3）核酸

（六）开发生物新资源
（1）动植物细胞的大规模培养
（2）应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞

二、生物活性物质的存在方式
（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能
根据生物活性物质的生物功能推断其存在部分和分布方式。生物活性物质分为胞内与胞外两种存在部位。
（二）生物分子间的作用力

三、生物活性物质的存在特点
（一）生物材料组成的复杂性
（二）生物活性物质存在地特点
生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量很高，而且生理活性愈高，含量愈低。
生物材料中的生化组成数量大，种类多，分离纯化比较困难。

四、生物材料的准备
生物材料的制造主要包括以下工艺过程：
1)生物材料的选取与预处理；
2)从生物材料中提取有效活性物质；
3)有效成分的分离，纯化
4)后处理及制剂

（一）生物材料的选取
1.有效成分的含量
（1）生物品种
根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。（催乳素，哺乳动物）

（2）合适的组织器官 （胃蛋白酶，胃）
（3）生物的生长期
生物的生长期对生理活性物质含量影响很大。
2.杂质情况
难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。
3.来源
应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。
胰脏 制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。

（二）生物材料的采集与保存
生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。
保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。
（三）动物细胞的培养与保存
（四）微生物菌种的选育与保存
1.菌种的分离
微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各种生物药物的主要材料。
（1）含菌样品的收集
根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，如到堆积和腐烂纤维素的地方去取样分离纤维素酶产生菌。

到温泉附近取样分离高温蛋白酶产生菌。
一般可以从土壤中分离所需微生物，取样时先将表土刮去2~3cm，在同一条件下选好2~5点土样混在一起包好，表明采样地点及日期备用。
（2）富集培养
收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控制温度，pH或营养成分即可达到目的。有时用能分解的底物作为生长和诱导产生所须成分的培养基成分，以使所需要的菌种得到快速生长，有利于进一步分离。
（3）菌种纯化
在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。

2.菌种的筛选
（1）筛选对象的选择
筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据文献收集可能性最大的的微生物进行筛选。
（2）培养方式的确定
微生物的培养方式，有固体培养与液体培养。
3.菌株的选育
从自然界直接分离得到的菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。选育方法基本上可以分成两类：随机选择突变体；根据代谢的调节机制选择各种突变体。
（1）随机选择法
一般程序是采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定它们的生物活性。最后挑选出产量或其它性能比亲代菌株优秀的突变株。
（2）根据代谢的调节机理选择高产突变体
根据代谢的调节机理选择高产突变体。(抗性基因)
4.菌种的保藏
（1）菌种的退化与防止
生产菌种本来在自然环境下生长，所以在人工培养条件下，任何菌株通过一系列的转接传代都可能发生退化。
退化—一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降，成为退化。
菌种退化现象：①单位容积中发酵液的活性物质含量；②琼脂平皿上的单菌落形态；③不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征。如形成孢子能力；④发酵过程pH变动情况；⑤发酵液的气味、色泽。

菌种退化防止措施：①防止基因突变，基因突变是菌种退化的一个主要原因，低温保藏法可以减少突变得产生。②采用双重缺陷型 采用双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变。③制定科学管理制度 制作平行菌种斜面；④分离单菌落；认真进行单菌落分离工作，再多做平行的菌种斜面；⑤选择培养条件 选择有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。
（2）常用的菌种保藏方法
斜面保存法—将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上，待生长良好后，于4℃保存。根据具体情况，间隔一定时间后转接。
矿油法—在菌种斜面上覆盖矿物油以隔绝空气防止蒸发。
索氏法—将小试管斜面的菌种放在大试管内，大试管内装几粒氢氧化钾，管口加橡皮套，然后用石蜡包封。

干硅胶法—试管内装硅胶约半满，180℃加热灭菌1.5小时，置密封干燥器内冷却，接种菌液约1ml，塞好棉花，放入预置有色硅胶的大瓶中，蜡封瓶口，于低温处保存。
砂土管法—取普通黄沙，洗净过60目筛，晒干，另取普通圆土研碎，过筛，晒干。两者以6:4混合。分装于安醅瓶或小试管中，然后在60℃干热灭菌2小时，连续灭菌三次后即可使用。装管时可吸取少许孢子悬浮液加入，待干燥后抽真空封口或用棉花塞紧后蜡封，低温保藏。
冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥。
甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15%消毒甘油，混匀速冻，冻存于－70~－80℃.

（五）组织与细胞的破碎
组织与细胞的破碎方法有物理法、化学法与生物法。
1.物理法
（1）磨切法
工业上常用的有绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉机。实验室常用的有匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。
（2）压力法
有压榨法、高压法和减压法，渗透压法。
（3）超声波法
（4）反复冻融法
2.化学法
用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。

3.生物法
（1）组织自溶法
利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为组织自溶法。
(2) 酶解法
用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，蜗牛酶等
（3）噬菌体法
用噬菌体感染细胞、裂解细胞，释放出内容物。
（六）细胞器的分离
为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方法是匀浆破碎细胞，差速离心。

第二节 生物活性物质的提取
提取是利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固形物成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞生理状态转入特定溶液环境的过程。
一、物质性质与提取
（一）物质的性质与提取方法的选择
要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。
生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要杂质种类及溶解性质，有关酶的特征等。其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。操作者可根据文献资料及本人的试验摸索获得的有关信息，在提取过程中增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度。

（二）活性物质的保护措施
（1）采用缓冲盐系统
在生物药物制备中，常用的缓冲盐有磷酸缓冲盐，柠檬酸缓冲盐，Tris缓冲液，醋酸缓冲盐，碳酸缓冲盐，硼酸缓冲盐和巴比妥缓冲盐等。
（2）添加保护剂
防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏，如巯基是许多活性蛋白质和酶催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸，－巯基乙醇。对易受重金属影响的，可添加EDTA。
（3）抑制水解酶的作用

二、物质的性质与溶解度
（一）物质溶解度的一般规律
相似相溶
（二）水在生化物质提取中的作用
水是提取生化物质的常用溶剂。水分子的存在可使其它生物分子之间的氢键减弱，而与水分子形成氢键，水分子还能使溶质分子的离子键解离，这就是所谓的水合作用。水合作用促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。
三、提取效率

（4）其它保护措施（冷、热、酸、碱）

四、影响提取的因素
（一）温度
多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。另外较高的温度可以降低物料的粘度，有利于分子扩散和机械搅拌，所以对耐热成分的提取可以用加热的方法。对不耐热的生物活性物质的提取，一般在0~10℃进行提取。
(二)酸碱度
多数生化物质在中性条件下较稳定，pH值一般应控制在4～9范围内，为了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等电点附近进行提取。
巧妙地选择溶剂系统的pH值不但直接影响目的物与杂质溶解度，还可以抑制有害酶类的水解破坏作用，防止降解，提高收率。

（三）盐浓度
盐溶作用
盐析作用

五、提取方法
（一）用酸、碱、盐水溶液提取
（二）表面活性剂提取
表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的提取的蛋白质或酶的提取。

（三）有机溶剂提取
1.固－液提取
丙酮从动物脑中提取胆固醇，
溶剂分级提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。
丙酮粉
2.液－液萃取
液－液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。分配系数和溶剂用量
溶剂萃取的注意事项：
（1）pH
在萃取操作中正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。

（2）盐析
加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少，这种现象成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。
（3）温度
一般在室温下或低温下进行萃取操作。
（4）乳化
在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。
液液萃取时溶剂的选择：
（1）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系数差异愈大愈好。
（2）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。

(3)两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。
（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。
第三节 生物活性物质的浓缩与干燥
一、生物活性物质的浓缩
（一）盐析浓缩
硫酸铵沉淀蛋白质
（二）有机溶剂沉淀浓缩
在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇，丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来。
（三）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩
（四）用聚乙二醇透析浓缩

（五）超滤浓缩
（六）真空减压浓缩与薄膜浓缩
真空减压浓缩在药物生产中使用较为普遍，具有生产规模较大，蒸发温度较低，蒸发速度较快等优点。
薄膜浓缩器的加速蒸发的原理是增加汽化表面积。使液体形成薄膜而蒸发，成膜的液体具有较大的表面积，热传播快而均匀，没有液体静压的影响，能较好地防止物料的过热现象。
二、干燥
干燥的目的：提高药物或药剂的稳定性，以利于保存和运输；达到规格标准；便于进一步处理。
表面水，毛细管中的水，细胞内的水

（一）减压干燥
（二）喷雾干燥
（三）冷冻干燥
第四节 生化物质的分离纯化方法
一、生物制药中分离制备方法的特点
生物制药中分离、制备方法有以下特点：
（1）生物材料组成非常复杂。一种生物材料常含成千上万成分，各种化合物的形状、大小、分子量和理化性质都各不相同。没有固定操作方法。
（2）有些化合物在生物材料中含量极微，只达万分之一，甚至百万分之一。因此，分离操作步骤多，不易获得高收率。
（3）生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，分离进程必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。（难点）

（4）生物制药的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH，离子强度）对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。
（5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的逐级分离方法。亲和层析分离具有分离的专一性，高效性。
（6）生物产品最后均一性的证明与化学纯度的概念不完全相同，因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂。
二、生物制药中分离制备方法的基本原理
生物大分子分离纯化的主要原因：
（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心、膜分离（透析，电渗析）与超滤，凝胶过滤法。
（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。

（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。
（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法与吸附层析法。
（5）根据配体特异性进行分离—亲和层析法。
三、分离纯化的基本程序和实验设计
生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致上分为五个基本阶段。
（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法。
（2）制备物理化性质稳定性的预备试验。
（3）材料处理及抽提方法的选择。
（4）分离纯化方法的摸索。
（5）产物均一性测定。

提取是分离纯化目的物的第一步，所选的溶剂应对目的物具有最大的溶解度，并尽量减少杂质进入提取液。
分离纯化是生化制备的核心操作。分离策略：
1.分离纯化早期使用方法的选择
分离纯化的早期，由于提取液中的成分复杂，目的物浓度较稀，与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩的作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。
一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化，收率愈高。
2.各种分离纯化方法的使用程序

生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要依据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。而每一种方法又都是在特定条件下发挥作用。因此，在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。
在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率。（盐析－吸附，吸附－盐析）
对于一未知物通过各种方法的交叉应用，有助于进一步了解目的物的性质。
3.分离后期的保护性措施
在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气氧化和某些事先无法了解的因素。

四、分离纯化方法步骤优劣的综合评价
每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。
对每一步骤方法的优劣，体现在所得产品重量与活性平衡关系上。例如酶的分离纯化，每一步骤产物重量与活性关系，通过测定酶的比活力及溶液中蛋白质浓度的比例。
五、制备物均一性的鉴定
均一性是指所获得的制备物只有一种完全相同的成分。（纯度鉴定）
生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法、化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法。

第五节 生物制药中试放大工艺设计
一、生物制药中试放大工艺特点
中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模生产至关重要。这些研究工作都是围绕如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进行。中试放大，验证实验室工艺路线的可行性以及在实验室阶段难以解决或尚未发现的问题。
在考查工艺条件的研究阶段中，必须注意和解决：
（1）原辅材料规格的过渡试验
在小试时，一般采用的原辅材料（如原料，试剂，溶剂，纯化载体）规格较高，目的是为了排除原料中所含杂质的不良影响，从而保证实验结果的准确性。但是当工艺路线确定之后，在进一步考察工艺条件时，应尽量改用大规模生产时容易得到的原辅材料。过渡试验

2.设备选型与材质质量试验
在小试阶段，大部分实验是在小型玻璃仪器中进行，但在工业生产中，物料要接触到各种设备材料，如微生物发酵罐，细胞培养罐，固定化生物反应器，多种层析材料以及产品后处理的过滤浓缩、结晶、干燥设备等。
3.反应条件限度试验
反应条件限度试验可以找到最适宜的工艺条件（如培养基种类，反应温度，压力，pH等），一般均有一个许可范围。有些反应对工艺条件要求很严，超过一定限度后，就会造成重大损失。进行工艺条件限度试验，全面掌握反应规律。
4.原辅材料、中间体及产品质量分析方法研究
5.下游工艺的研究
尽量简化下游工艺操作，采用新工艺，新技术，新设备等。

二、中试放大方法与内容
中试放大的方法有经验放大法，相似放大法和数学模型放大法。经验放大法主要凭借经验通过逐级放大（实验装置，中间装置，中型装置和大型装置）来摸索反应器的特征。
中试放大程序可采用步步为营或一竿子到底策略。
中试放大的研究内容主要有：
（1）工艺路线与各步反应方法的最后确定
（2）设备材质与型号的选择
（3）反应器的规模选择及反应搅拌器型式与搅拌速度的考查。
（4）生产反应条件的研究
（5）工艺流程与操作方法的确定

（6）物料衡算
（7）安全生产与三废防治措施研究
（8）原辅材料，中间体的物理性质和化工常数的测定
（9）原辅材料、中间体质量标准的制定。
（10）消耗定额，原料成本，操作工时与生产周期计算。

生产工艺规程的制订

F. 微生物发酵过程为什么要进行中试放大(从影响中试放大的因素考虑)

微生物发酵一般是从实验室摇瓶发酵（无氧发酵是密闭瓶）开始的。主要作用是两个，一是筛选出适宜、高产的菌种；二是找出合适的培养基配方和初步的发酵条件。方法一般是正交试验。其初步结果经验证后，需要进行中试放大。中间试验的规模有大有小，小到10升罐，大到1吨罐。其目的是：一方面是对小试结果进行进一步验证，进一步摸清发酵条件，另一方面是，由于小试与中试各方面条件有所变化，特别是对发酵条件的控制，如温度、溶解氧（含通风量和搅拌参数）（无氧发酵无此参数）、pH值等主要参数的控制方式与小试不同，会造成发酵结果与小试差别很大，而且有可能在不同的发酵阶段，采用不同的参数控制方式，这些都是在摇瓶小试时无法做到的。中间试验是为将来的大生产做准备，为大规模生产提供准确的工艺参数和设计依据，因而中间试验是不能省略的，如有必要，还需进行逐级放大、不同规模的中间试验。

G. 中试放大的介绍

中试放大是在实验室小规模生产工艺路线的打通后，采用该工艺在模拟工业化生产的条件下所进行的工艺研究，以验证放大生产后原工艺的可行性，保证研发和生产时工艺的一致性。 中试放大的目的是验证、复审和完善实验室工艺所研究确定的反应条件，及研究选定的工业化生产设备结构、材质、安装和车间布置等，为正式生产提供数据，以及物质量和消耗等。

H. 什么是反应器放大效应

就是在基于原反应器工作原理的基础之上，把通过它的物质配比提高到最大优化的程度，具很高的工作效率。

I. 反应工程专题：1.3反应器放大

实验室小试技术实现工业化生产，普遍存在所谓的“放大效应”，也就是物理因素的负面影响引起的结构严重偏差。因此，反应器放大是实现新技术转移和产业化不可逾越的关键步骤。

以模型装置的某些参数为基准进行比例放大。如：按照流体流动的雷诺数相同的放大过程属于相似放大。但大多数情况下，并不适用于反应器的放大，这是因为无法保证反应器内物理相似的同时满足化学相似

以小试、中试、工业装置不断增大反应器体积进行试验的方法模式。此外，为了研究流体流动特性，有时需要进行冷模试验。

优点：设计参数安全可靠，放大成功率高

缺点：耗费大量资源，开发周期长

在认知化学反应过程的本质规律基础上，先建立物理模型（抽提出主要影响因素，忽略次要因素），然后建立数学模型（将主要参数用等式联系起来，得到联立的方程组），以数学模型为基础进行反应器的设计计算）

优点：节省资源，缩短开发周期，可以通过改变条件和参数设置对反应器进行调优

缺点：放大倍数很大时，可靠性降低。因此，在工程实践中，常常采用经验放大和模型放大结合的方式，即可节省资源，又可以保证可靠性。

1）从“三传一反”四个方面关联反应速率、浓度、温度、时间等参数，得到一组联立方程

    a）质量传递

    b）热量传递

    c）动量传递

    d）反应过程

2）反应动力学方程是模型的核心，关联的是反应速率与温度和浓度的关系

3）物料衡算、热量衡算、动量衡算的通式表示：[输入量] - [输出量] - [反应量或消耗量] = [累积量]

4）这里的反应量或消耗量要与反应动力学方程进行关联

冷模试验：在没有 化学反应 的条件下，利用水、空气、沙子等方便的 模拟 物系进行的 试验