色谱分析方法的验证

1. 高效液相色谱含量测定中分析方法认证的主要内容

含量方法学认证主要考察以下几个性质：

1.专属性：查看被测物质与被测结果间是否正确且唯一对应。

考察方法：将处被测成分外的其他物质均做空白干扰对照，包括流动相、辅料空白、溶剂空白、其他成分（多组分产品）空白、如果方法有衍生还应包括衍生空白等等。

2.精密度：查看方法多次测定是否能够得到相同的结果。

考察方法：重复性试验，应包括仪器精密度（对照多次进样查看偏差），方法精密度（多次测定同一样品查看结果，该测定应包含全部试验过程，即配制多个供试品溶液），中间精密度（不同人员不同时间不同仪器，最好试剂和实验室也更换，测定同一样品，查看结果偏差）。RSD应小于2%

3.准确度：测得结果与实际量间是否一致。

考察方法：通过回收率试验来确定，应包含3个浓度至少9个样品的测定结果，测定时应采取对照品（或原料）加辅料等其他干扰，计算回收率和结果偏差。视方法而定一般回收率应在95~105%，RSD小于2%

4.线性：在线性范围内，测得峰面积与被测物质的量是否能够呈线性关系。

考察方法：线性试验，应取至少5个浓度点，绘制标准曲线，计算线性相关系数，液相色谱法中一般认为R=0.9999以上才能算呈线性。

5.定量限：当物质达到定量限浓度以上时，该方法可以对该物质进行定量检测。

考察方法：当被测物峰高：信号噪音=10:1时，当前浓度即为定量限。如果想做更加可靠的实验，应在定量限处考察精密度和回收率。

6.耐用性：方法对实验环境的耐受程度。即当实验条件发生细微变化时，方法仍然能够保持测定的准确。

考察方法：通过几项实验来确定：溶液稳定性（相同溶液在几小时内多次进样查看结果），色谱条件变化（应包括柱温、流速、色谱柱批次、检测波长等条件的轻微变化）。

2. 采用高效液相色谱法测定化学原料药时,如何论证方法的专属性

采用高效液相色谱法测定化学原料药时，论证方法的专属性为：需要验证的检测项目检测项目是为控制药品质量，保证安全有效而设定的测试项目。

根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要求，本指导原则将需验证的检测项目分为鉴别、杂质检查（限度试验、定量试验）、定量测定（含量测定、溶出度、释放度等）、其他特定检测项目等四类。

测定方式分析

鉴别判定被分析物是目标化学原料，而非其它物质，用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性。杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质，如有机杂质、无机杂质等。

而其中杂质检查可分为限度试验和定量试验两种情况。用于限度试验的分析方法验证侧重专属性和检测限。用于定量试验的分析方法验证强调专属性、准确度和定量限。

3. 如何对一种分析方法做验证试验

1. 绪论
本指南旨在为申请者提供建议，以帮助其提交分析方法，方法验证资料和样品用于支持原料药和制剂的认定，剂量，质量，纯度和效力方面的文件。
本指南旨在帮助申请者收集资料，递交样品并资料以支持分析方法。这些建议适用于NDA，ANDA，BLA，PLA及其它们的补充中所涉及的原料药和制剂。
这些原则同样适用于二类DMF所涉及的原料药和制剂。如果使用了其它方法，鼓励申请者事先和FDA药品评审中心的官员进行讨论，以免出现这种情况，那就是花了人力物力所准备起来的递交资料后来发现是不可用的。
本指南中所述的分析方法验证的原则适用于各种类型的分析方法。但是，本指南中特定的建议可能不适用于有些产品所用的特殊分析方法，如生物药，生物技术药，植物药或放射性药物等。
比如说，许多生物分析是建立在动物挑战模式，免疫原性评估或其它有着独特特性的免疫分析基础上的，在递交分析方法和分析方法验证资料时需考虑这些独特的性质。
而且，许多原料药和制剂的界定和质量控制所需的生物和免疫化学检测并不在本指南的范围之内。
尽管本指南并不专门叙述原料，中间体，赋形剂，包装材料及原料药和制剂生产中所用的其它物料的分析方法及分析方法验证资料的递交，但是应该应用验证过的分析方法来分析检测这些物质。
对于本指南中未提及的关于分析方法验证和资料提交方面的问题，请向FDA相关的化学评审人员咨询。
本指南，一旦定稿，将取代FDA于1987年2月份发布的工业指南：分析方法验证所需提交的样品和分析资料。
II. 背景
每个NDA和ANDA都必需包括必要的分析方法以确保原料药和制剂的认定，剂量，质量，纯度和效力，还包括制剂的生物利用度(21 CFR 314.50(d)(1) 和314.94(a)(9)(i))。
FDA验证文件现场备查，可以不与DMF一起交。
必须要有资料来论证所用的分析方法是符合一定的准确度和可靠性标准的。
分析方法验证是论证某一分析方法适用于其用途的过程。分析方法的验证过程是从申请者有计划地系统性收集验证资料以支持分析方法开始的。
审评化学家会对NDA或ANDA中的分析方法和验证资料进行评审。
一旦FDA有要求，则NDA或ANDA的申请者必须提交制剂，原料药，非药典对照品和空白以使FDA实验室能对申请者所用分析方法进行评审(21 CFR 314.50(e) and 314.94(a)(10))。
FDA实验室的分析会论证该分析方法在实验室内是可以重现的。审评化学家和实验室分析家会从法规的角度确定该分析方法的适用性。
FDA检查官会对分析实验室进行检查确保用于放行和稳定性实验的分析方法符合现行的GMP（21CFR part 211)和GLP (21 CFR part 58)。
每个BLA和PLA都必须要有详细的生产工艺描述，包括分析方法，以说明所生产的产品是符合规定睥安全，纯充和效力标准的(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(iv))。
必须要有资料证明所用的分析方法是符合一定的准确度和可靠性要求的(21 CFR 81211.194(a)(2))。对于BLA，PLA及它们的补充，在所提交的许可证申请中应当要有分析方法和方法验证这部分的资料，审评委员会会对这部分资料进行评审。
需提供代表性样品及该样品所代表批号的检测结果总结(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(vi))。评审委员会主席会要求CBER实验室的分析人员进行分析实验对申请者的分析方法进行评估，并确认其分析结果。
从验证的角度来看，所有的分析方法有着同样的重要性。一般来说，应当要应用已验证过的分析方法，而不论其是被用于过程控制，放行，合格或稳定性实验。高等每个定量分析方法时都应当要减少其分析误差。
分析方法和验证资料应当摆在申请的分析方法和控制章节中提交。本指南的第III到IX章和XI章给出了所需提供资料方面的建议。向FDA实验室提供样品和递交NDA和ANDA中的分析方法验证资料的信息见第X章。
III分析方法的类型
A. 法定分析方法
法定分析方法是被用来评估原料药或制剂的特定性质的。USP/NF中的分析方法是法定的用于药典项目检测的分析方法。为了确认符合法规，需使用法定分析方法。
B. 替代分析方法
替代分析方法是申请者提出用于代替法定分析方法的分析方法。只有当一替代分析方法相当于或优于法定分析方法时，才可以应用验证过的替代分析方法。
I如果提交了替代分析方法，申请者还应当提供其理由，并标明其用途（如，放行，稳定性实验），验证资料及其与法定分析方法的对比资料。
C. 稳定性指示分析
稳定性指示分析是能检测出原料药或制剂的某些性质随着时间的延长而出现的变化的定量分析方法。
稳定性指示分析能不受降解产物，工艺杂质，赋形剂或其它潜在杂质的影响而准确测定其中的活性成分。
如果申请者递交了用于放行检测的非稳定性指示分析方法，则应当要有能定性和定量地监测杂质，包括降解产物，的分析方法对其进行补充。稳定性试验中所用的含量分析方法应当要有稳定性指示能力，除非有科学的理由能证明其合理性。
IV 标准品
A．标准品的类型
可以从USP/NF处或其它官方(比如说，CBER，21CFR 610.20)获得标准品 (也就是一级对照品)。如果不能确定一标准品的来源是否会被FDA认为是官方来源，申请者应当要向适当的化学评审人员咨询。如果没有官方来源，则被用来作标准品的物质应当要有尽可能高的纯度，并得到充分界定。
工作对照品 (也就是内部标准品或二级标准品)是根据一级对照品标定的，并用来代替一级对照品的。
B．分析报告单
对于非官方标准品，在申请的分析方法和控制章节中应当要提供该标准品的分析报告单。对于从官方获得的标准品，用户应当要确保标准品的适用性。应当正确储存标准品并在已确定的时间段内使用该标准品。
C．标准品的界定
从USP/NF及其它官方来源获得的标准品是不需要进一步界定的。非官方对照品要有尽可能高的纯度，并进行充分地界定以确保其结构，剂量，质量，纯度和效力。
T用于界定标准品的定性和定量分析方法应当要不同于用于控制原料药或制剂的结构，剂量，质量，纯度和效力的分析方法，要比它们更深入。用于标准品界定的分析方法不应仅仅是和先前的指定标准品进行比较实验。
一般来说，界定资料应当要包括：
标准品的简单工艺描述，如果其生产工艺是否于其相应的原料药的话。应当要叙述制备标准品时所用的补充精制过程。
相关光谱图，色谱图，TLC照片及其它仪器输出的清晰复印件。建立纯度的资料。应当要应用适当的检测方法来获得这些资料，比如说TLC，GC，HPLC，相溶解分析，适当的热分析方法及其它必要的分析方法。
适当的化学性质资料，比如结构式，经验式和分子量等。结构确证资料应当要包括适当的分析测试，比如元素分析，IR，UV,NMR和MS，及适用的官能团分析。还应当要提供具体的结构解析资料。
物理性质的描述，包括颜色和物理形态。 适当的物理常数，比如说熔程，沸程，折射率，离解常数(pK值)和旋光度。用于界定标准品的分析程序的详细叙述。
至于生物技术/生物产品的标准品，应当要考虑上述建议，可能可以应用。然而，其它确定物理化学性质，结构特性，生物活性和/或免疫化学活性的补充检测和/或其它检测将是非常重要的。
物理化学性质包括异构体，电泳和液相色谱行为及光谱性质等。结构界定可能包括氨基酸序列，氨基酸组成，缩氨酸图和碳水结构。确定生物和/或免疫化学活性的分析方法应当要和用来确定产品效力的分析方法一样。
Th这些分析方法可以包括基于动物的，细胞培养的，生物化学的或配位体/接受体螯合的分析方法。如果这些检测需用于某些标准品的界定，生物和免疫化学检测的分析方法验证方面的特殊建议并不在本指南的范围之内。
V．IND中的分析方法验证
对于IND而言，每个阶段的研究都需要有足够的资料以确保合适的认定，质量，纯度，剂量和/或效力。所需的分析方法和方法验证方面的资料会随着研究的阶段变化而变化(21CFR312.23(a)(7))。
N关于在第1阶段研究所需提交的分析方法和方法验证资料方面的指南，发起人可以参考FDA的指南：药品（包括结构确定的，有疗效的，生物技术产品）第1阶段研究的IND申请的内容和格式（1995年11月）。
第2和第3阶段研究所需提交的分析方法和方法验证资料方面的指南，发起人将可以参考FDA的指南：药品（包括结构确定的，有疗效的，生物技术产品）第1阶段研究的IND申请的CMC内容和格式（草案，1999年4月）。
在递交NDA，ANDA，BLA或PLA时，所有的分析方法都应当要开发出来，并得到验证。
VI．NDA，ANDA，BLA和PLA中分析方法的内容和格式
NDA，ANDA，BLA和PLA中所提交的任一分析方法都应当要有详细的描述，以使合格的分析人员能重现出所需的实验条件并获得和申请者相当的实验结果。应当要叙述分析方法中需要特殊注意的地方。
如果所用的分析方法是USP/NF或其它FDA认可参考文献（如，<>）中且所参考的分析方法未经过修改的话，则需提供该分析方法的参引，而不用提供该分析方法的描述（21 CFR 211.194）。
对于从其它公开发表的文献上获得的分析方法，应当要对其进行叙述，因为评审官可能并不能很方便的获得这些文献。
分析方法描述中需要包括的典型内容如下所示：
A．基本方法
HPLC进行分离的，检测器为UV检测器。
B．取样
需要叙述的有：所选样品的数目（比如，瓶，片等），它们是如何使用的（也就是，单独的或是混合样品），每个样品分析的重复次数。
C．仪器和仪器参数
需要叙述的有：仪器列表（比如，仪器类型，检测器，柱子类型，尺寸等）和仪器参数（比如，流速，温度，运行时间和设定波长等）。如果必要的话，还要提供实验结构示意图（比如，阐述喷洒式分析方法的位置）。
D．试剂
需要叙述的有：试剂列表及其相应的规格（比如：USP/NF，美国化学社（ACS）分析试剂）。如果使用的是自制试剂或更改过的商业试剂，则应当要有其制备方法。对于不稳定的或有潜在危险的试剂，应标明其储存条件，安全使用说明和使用周期。
E．系统适应性实验
系统适应性实验参数和合格标准是建立基础是：仪器，电子元件，分析操作和待测样品是个不可分割的整体。系统适应性实验确保系统在样品分析的时候能很好地运行。在分析方法中应当要包括适当的系统适应性合格标准。
所有的色谱分析方法都应当要有系统适应性实验及相应的合格标准。CDER评审官指南<<色谱分析方法的验证>>（1994年11月）对用于评估系统适应性的典型参数进行了定义和讨论。
建议系统适应性实验应成为所有分析方法的一部分，而不仅仅是色谱分析方法。无论是哪类分析方法，都要采用实验来证实该系统能不受环境条件的影响而正确地运行。比如说，滴定法一般来说需要进行空白实验。
F．标准品的制备
要有所有标准品溶液（比如，储备液，工作对照品溶液，内部对照品溶液）的配制方法。
G.操作过程
应当要按操作步骤对操作过程进行逐步叙述。叙述应当要适当包括如下信息：平衡时间，样品进样顺序和系统适应性或启动参数。需标明不常见的危险。

4. 色谱定性分析有哪些方法

在日常生活中，很多人对于色谱定性分析不是很了解，也不知道它是什么意思，下面就简单介绍一下色谱定性分析包括哪些方法？

色谱定性的依据，是在同一特定的色谱条件下，不同的物质在固定相上保留的能力不一样，因此它们的保留时间不同，也就是说他们的出峰时间不同，可以通过保留时间来进行定性，目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值。在精度高的色谱上，保留时间可以精确到零点几秒。从色谱图中可以得到定性的信息有：被测样品中有几种物质，它们大概的比例，从出峰的出峰顺度可以粗略的判断化合物的极性。

色谱定性分析的方法：包括纯物质对照法、利用保留值经验规律定性、利用其它方法定性这三种。

5. 高效液相色谱(HPLC)系统适用性试验是指哪些内容进行该试验的目的是什么

一、在高效液相色谱法系统适用性试验中，有常用的四个内容：分离度、柱效、重复性和拖尾因子。

1、分离度（resolution，R）——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。

2、柱效：色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6 或3.9mm ，长度为15 ～30cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000 ～10000。减小填料粒度和柱径以提高柱效。

3、拖尾因子（tailing factor，T），用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子或不对称因子。

二、目的：按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。

(5)色谱分析方法的验证扩展阅读

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

6. 通常有哪几种色谱定性分析方法

色谱定性分析是确定色谱图上每个色谱峰所代表的物质组分及性质的分析方法。通常有:①利用保留值（描述色谱峰位置或相应体积值，在一定的固定相和操作条件下，任何物质都有其确定的保留值）特性定性；②结合质谱、红外光谱、紫外光谱和核磁共振等其他物理化学方法定性；③利用预处理或柱上处理等化学反应或物理吸附原理定性；④利用鉴定器对某类化合物的选择性（如火焰光度检测器判别含硫、磷化合物；氮磷检测器判别含磷、氮化合物）定性等。

7. 气相色谱面积归一法分析方法怎样做方法验证

在同一推动力下气相色谱分析(chromatography)是使混合物中各组分在两相间进行分配。按流动相可分为气相色谱(GC)和液相色谱(LC) ，其中一相是不动的（固定相），不同组分在固定相中滞留的时间不同，又称色层法或者层析法，与固定相发生作用，依次从固定相中流出,另一相（流动相）携带混合物流过此固定相

8. 如何建立气相色谱分析方法

色谱分析常用的定量方法：归一化法、内标法和内加（增量）内标法、外标法。
1、面积归一化法优点是简便、准确，当操作条件变化时对结果影响较小，宜于分析多组分试样中各组分的含量。但是试样中所有组分必须全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。
2、外标法是用纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液（或直接购买不同浓度标准溶液）分别取一定体积，注入色谱仪，根据峰面积和浓度做标准曲线。在分析未知样时按与标准曲线相同的操作条件和方法，由标准曲线查出所需组分的浓度（现在在工作站上直接就能求出浓度）。此法要求进样准确，操作条件稳定，分析样品和标准曲线条件必须一致。
3、内标法是试样中所有组分不能全部出峰或只要求测定试样中某个或某几个组分时，可采用此法。内标法是在准确称取一定量的试样中，加入一定的标准物质（内标物），根据内标物和试样的质量以及色谱图上的相应峰面积，计算待测组分的含量。内标法的关键是选择合适的内标物，内标物应是试样中不存在的纯物质，物质与被测物质相近，能溶于样品中，但不能于样品发生反应。此法比较费事，一般不使用于快速分析。

9. 色谱分析有哪些方法

色谱定性分析的方法：包括纯物质对照法、利用保留值经验规律定性、利用其它方法定性这三种。

色谱分析法的分类比较复杂。根据流动相和固定相的不同，色谱法分为气相色谱法和液相色谱法。按色谱操作终止的方法可分为展开色谱和洗脱色谱。按进样方法可分为区带色谱、迎头色谱和顶替色谱。

色谱法分离效率高、分离速度快、灵敏度高、可进行大规模的纯物质制备。

色谱定性的依据，是在同一特定的色谱条件下，不同的物质在固定相上保留的能力不一样，因此它们的保留时间不同，也就是说他们的出峰时间不同，可以通过保留时间来进行定性，目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值。在精度高的色谱上，保留时间可以精确到零点几秒。从色谱图中可以得到定性的信息有：被测样品中有几种物质，它们大概的比例，从出峰的出峰顺度可以粗略的判断化合物的极性。

10. 在气相色谱分析方法验证时，耐用性的验证标准时什么

起码要考察流速±20%，柱温±2℃，不同色谱柱三个条件。如果你的条件是顶空，还要加上顶空温度±2℃。如果比较严格，还会加上进样口温度±2℃和检测器温度±2℃。正常条件和波动条件的rsd在5%以内。
因为各家做的都不一样，而且气相的耐用性实在不容易达到标准，所以这方面的做法很有争议。如果是自动进样，尽量做全面。