核苷酸序列分析常用方法

A. DNA的一级结构也即碱基在核酸链上的排列顺序是如何测定的

DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）的排列方式。

最常用方法是Sanger（桑格）双脱氧链终止法，是弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核苷酸可能随机地被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸又少了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。

B. 获得一个未知的基因的核苷酸系列后，你如何对其功能进行初步预测如何得到该基因产物及其抗体

1.可以去NCBI进行blast，搜索其同源基因，这样其功能便知道个大概了。
2.已知这个基因的核苷酸序列，如果你已有其质粒，想要得到，最简单的方法就是使用PCR扩增，如果没有就只有去相关基因公司购买或者请专业的基因合成公司来为你合成。
3.这个问题太过复杂，关于抗体的制备有杂交瘤技术，噬菌体筛选技术等等。
你问的这些问题牵涉到分子生物学，免疫学等极为专业的知识，详细解答恐怕几年也说不完，建议你先去学习相关知识。
另外二楼的回答第一句是不正确的，从已知基因是可以推出蛋白序列的，但反过来，由于简并密码子的原因，从蛋白是不能推出准确的核苷酸序列的。

C. DNA测序技术有哪些

DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法与Gilbert（1977）发明的化学降解法。这两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。

D. 核糖核酸检测步骤

1、核酸提取使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。
2、逆转录合成cDNA。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。
3、PCR扩增反应PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCR扩增方法。
4、扩增产物定性分析；扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DNA序列分析等。
5、结果判定和完成报告单：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。
(4)核苷酸序列分析常用方法扩展阅读：
检测新型冠状病毒特异序列的方法最常见的是荧光定量PCR。因PCR反应模板仅为DNA，因此在进行PCR反应前，应将新型冠状病毒核酸逆转录为DNA。在PCR反应体系中，
包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；
如反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。
每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高， Ct值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。
参考资料：网络——核酸检测法

E. 用DNA探针测定目的基因中的核苷酸序列的实验步骤有哪些

首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口.
然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa
poly
merasⅠ）的外切酶活性，切去带有32P标记的磷酸的核苷酸。
同时又利用该酶的聚酶活性，使互补32P标记的核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向的方向移动。
最后，实验结果为DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。

F. ITS序列分析的应用原理和主要步骤有哪些

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途： (1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量mRNA生成 cDNA文库； (3) 从cDNA中克隆某些基因； (4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移； (7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

G. sanger加减法核酸序列分析的原理

DNA序列测定技术（双脱氧末端终止法）使用须知
(张宏、李振甫)

一、背景介绍
目前最常用的手工DNA序列测定技术，仍然是Sanger等(1977)提出的酶法，也称双脱氧末端终止法。这种方法生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种(或多种)特定的残基,形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度，各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基，在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后,从放射自显影胶片上，直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300-500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法，为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。
除传统的双脱氧链终止法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外,新的测序方法亦在不断出现,如上世纪90年代提出的杂交测序法等。
二、双脱氧末端终止法测序步骤
(一)制备模板
有两种类型的DNA可以作为Sanger法测序的模板,即纯化的单链DNA和经热变性或碱变性的双链DNA。
1、单链DNA模板 在一般情况下,可将靶DNA片段克隆于M13mp载体中,从M13mp系列噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板效果最佳，只要细心掌握模板与引物的最佳比例,有经验的测序人员通过一次末端终止反应,能读取300-500个核苷酸序列。
2、经热变性或碱变性的双链DNA模板 利用双链质粒模板测序,其中有两个至关重要的因素,即模板的质量和聚合酶的种类。用小量制备的质粒DNA来测定未知序列的DNA克隆,往往因为有污染而并不可取。高纯度的质粒最好采用氯化铯-溴乙锭梯度平衡超速离心法制备。其次是应采用高质量的聚合酶。一次末端终止反应亦可能读出300核苷酸序列。
(二)引物
酶法测序反应中都有一个与模板链特定序列互补的寡核苷酸作为DNA合成的引物。不管是单链DNA作模板,还是用变性双链DNA作模板,都有通用引物可用,而不必另行设计与未知DNA序列互补的引物。通用引物可直接从厂商购买。
（三）DNA测序酶
该酶是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，是测定较长DNA的首选酶。市售的各种以该酶为基础的测序试剂盒，效果甚佳。
(四)放射性标记
传统的DNA测序方法都采用α-32P-dNTP作为放射性标记物,但由于32p发射的高能β射线，常会引起二个问题：首先是放射自显影图谱条带扩散、分辨率低，限制了识读序列的数量和准确性；其次是32P衰变会导致DNA样品分解，通常都应在测序反应后24小时内进行电泳,否则无法获得好的结果。
近年来α-35S-dNTP被广泛采用，是由于35S产生较弱的射线,克服了32P的二大缺点。放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底，测序反应产物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。
（五）测序胶的准备及电泳
1、硅化玻璃板
2、配置电泳试剂和缓冲液
3、凝胶液的配置
4、电泳
5、电泳后凝胶的处理
(六)DNA序列的识读
DNA序列的识读: ①在显影前后一定要注意标明模板名称、日期和测序人等,并标明各套反应位置；②识读时从显而易见的特征序列开始，如连续的同聚核昔酸(如TTTTT、AAAAA)或交替出现的嘌呤和嘧啶(如GTGTGTGT),一旦找到这种序列，便可较快地确定目的序列的位置。
三、注意事项
尽管核酸序列测定方法越来越成熟、简便并且可以自动化，但事实上,对于一个片段较长、序列未知的待测核酸而言,仍然是一件耗时且繁琐的工作。对于一个待测DNA分子,要制定一个能够简捷准确的测定方案，一般可以从以下几个方面考虑：
1、DNA片段大小。
2、背景资料：是否清楚DNA限制性酶切图谱,是否有一段已知序列,是否具有重复序列等。
3、测序目的: ①测定未知序列；②确定重组DNA的方向与结构；③对突变(如点突变)进行定位和鉴定；④比较性研究，如比较同种病毒不同株系之间的基因差异。后3种测序目的称为确证性测序。
4、实验条件：如手工测序还是自动化测序,合成引物费用等。
由于单套测序反应所能准确测定的DNA序列最长一般仅300-400bp。因此，在进行序列测定之前，必须首先考虑待测DNA分子的大小，其次是所要测定的序列范围以及要求的序列精确程度等，再结合实验室的条件选择切实可行的克隆及测序方案。

DNA序列如何测定

一、常规DNA测序的原理

制作物理图谱的过程是一个逐步精细的过程。第一步把每条染色体分成平均长度在400kb的长片段，每段克隆到一个YAC上，所有YAC克隆都按照其在染色体上的实际位置进行排序，我们就得到了一个能够覆盖整个染色体的YAC文库。

把每一个YAC克隆携带的染色体片段经部分酶切形成一系列有重叠区域的40kb左右的片段克隆到粘粒上，得到粘粒文库。每个粘粒上的染色体片段再经酶切形成4kb左右的片段克隆到测序专用的质粒载体上。测序质粒上携带的4kb的片段就可以用现在常规测序的方法进行测序了。把所有质粒克隆的DNA片段序列读出，再按照各个片段在染色体上的实际位置进行排列，最后就可以得到染色体的全部核苷酸碱基对序列。染色体的DNA碱基序列是基因组物理图谱的最精细形式。

所谓“常规测序方法”的基本特点有两个：第一，把待测序的DNA分子进行处理，得到每个只差1个核苷酸的一系列逐步缩短的DNA分子的混合物；第二，通过凝胶电泳把这些DNA分子分离开来，形成阶梯状排列的条带，然后逐个读出DNA的碱基序列。

二、化学法测序

得到长度只差一个碱基的DNA分子的方法主要有两种。一种是用化学方法把待测序的DNA片段在每个碱基处切断一次。这是由Maxam和Gilbert发明的方法。具体做法是把待测序的DNA分子成单链分子，其5’端用32p进行放射性标记。然后把这些单链DNA分于分成4份，每份用一种化学试剂处理DNA片段，每种试剂可使DNA分子在一种碱基的5’端的磷酸二酯键处发生断裂。例如，试剂一可使单链DNA分子在A碱基处断裂，试剂二可使单链DNA分子在T碱基处断裂，依此类推。把反应条件控制好，使每个DNA分子只发生一次断裂，这样，我们就得到4种反应产物，每种由在一种碱基处发生断裂形成的DNA片段组成。

把这4种反应产物用聚丙烯凝胶电泳进行分离，两个DNA片段只要相差1个碱基，就可以在这种凝胶中被分成两个条带。电泳完成后，用X光胶片进行曝光，最后得到一张由不同条带组成的序列图。从这张图上就可以读出待测DNA片段的碱基序列。5’端的第一个碱基G读不出来，可以通过测定互补链的序列测出这个碱基。

三、酸法测序与测序的自动化

另外一种得到长度只差一个碱基的DNA分子的方法是英国科学家桑格发明的，这种方法利用DNA聚合酶以待测序的DNA单链分子为模版合成互补的新链。在合成新链时，合成原料除了4种脱氧核糖核苷酸外还加入一种2’和3’位上的羟基都脱除的核苷酸。由于缺少3’羟基，当这种核苷酸被结合到链上后，它的后面不能再结合其他核苷酸，链的合成就此终止。与化学法测序类似，我们可以准备4种反应物，加入的核苷酸类似物分别携带A，G，C，T碱基，每种反应物里包含在一种碱基处终止链延伸的长短不同的DNA片段。这些DNA片段也要用放射性标记，经过凝胶电泳和放射自显影，得到DNA条带图谱，根据图谱可以读出DNA的碱基序列。

这种方法比化学法简单，条件易于控制。用4种不同的荧光化合物分别标记4种反应的产物，就可以做到把4种反应物混合在一起进行电泳，可以提高电泳分析的效率。这种方法利用现代精密仪器和机器人技术可以实现DNA测序的高度自动化。目前市场上已经有各种型号的DNA自动测序仪可供选购。

根据最新计划，到2000年人类基因组的“草稿”要出来。这个“草稿”包含了90％的人类基因组的序列，每个区域测定5次左右。到2003年完整的人类基因组序列测定可以完成，这个序列可以作为“参考基因组”或者“标准基因组”用于生物医学研究。测定这个“标准基因组”所用的DNA是由10到20位志愿者提供的，用男性的精子DNA和女性的血液DNA作为样品构建了人的基因组文库，因此，“标准基因组”序列不是哪一个具体的人的序列，而是几十位志愿者的序列的综合体现。

四、单分子荧光测序

单分于荧光测序是一种快速DNA测序法，这是利用单分子操作技术直接读取DNA的碱基序列的方法，与传统的荧光测序法相比，这种方法可大大提高速度。用桑格测序方法现在每天可以解读上万个碱基序列，但是如果单分子荧光测序取得成功，它可以在两分钟内完成传统方法一天的工作。

单分于荧光测序的主要过程如下。第一步，取一条大约有5万个碱基那么长的单链DNA分子，把它的一端用化学方法连接在一个非常微小的塑料球上，DNA分子就会缠绕在塑料球上。第二步，在一张类似激光唱片的圆盘上铺一层很薄的液体薄膜，然后用激光光钳把塑料球放在这张光盘的液体膜上进行移动，DNA分子就会在后面被拖着展开，就好像一只船拖着一条绳子快速前进，把绳子拉展一样。第三步，让拉展的的DNA分子与一种核酸外切酶结合。这种核酸外切酶可以和DNA的游离的末端结合，然后逐个把DNA的碱基切割下来。第四步，用单分子光谱技术逐个识别并且读出碱基即达到了测序的目的。

目前，单分子荧光测序技术还没有完全成熟。主要问题是用于识别单个碱基的单分子光谱技术还没有过关。利用隧道扫描显微镜和原子力显微镜直接读取DNA分子碱基序列的研究也正在进行之中，近期内有可能取得突破。

五、DNA芯片与杂交测序

DNA芯片是一种通过杂交测定未知DNA序列的新技术。在一个玻璃或硅片上合成大量的寡聚核苷酸片段，例如可以合成8个碱基长的全部可能的寡聚核苷酸片段（48＝65，536种）。这些探针一头固定在固体基质上，另外一端是游离的。它们在硅片上有规律地排列着，每个特定位置上探针的序列都是已知的。

假如有一个DNA片段需要测序，我们可以把它的单链形式用荧光进行标记，然后与硅片上的6万多种探针进行分子杂交，在荧光显微镜下观察杂交结果。如果某个探针与持测DNA的某个部分的序列是完全互补的，待测DNA分子就被结合到硅片上，这个探针所在的位置就会发出荧光。这种包含大量的生物遗传信息的寡聚核着酸阵列就叫DNA芯片，也叫基因芯片。

DNA芯片的制备要利用微电子芯片生产中的光刻技术以及在位组合化学技术。DNA芯片的阅读要使用显微术，信息的解读要利用计算机技术。因此，DNA芯片是多学科交叉的产物。
参考资料：http://www.wsjk.com.cn/gb/paper124/1/class012400001/hwz92638.htm

H. 基因测序的步骤是什么

PCR产物直接测序技术现已成为分子生物学和基因组学研究中的一个重要技术,广泛用于基因突变检测、遗传性疾病诊断、单核苷酸多态性研究、基因组重叠序列群等.与传统克隆测序技术相比较,直接对PCR扩增的DNA进行测序,省去了耗时的克隆步骤,避免了传统的细菌培养,模板提取等重复性操作,可以从少量的原始样品中得到正确的DNA序列信息.PCR产物直接测序技术具有快速、简便、稳定经济的优点.
试验试剂
PCR扩增的双链DNA模板
长约20个核苷酸的DNA引物
DNA聚合酶
测序胶
0.1mol/L DDT
α-32P-dATP
dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L)
dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L)
测序反应缓冲液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl
终止缓冲液：95% 甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚蓝,0.05% 二甲苯腈
试验步骤：
1、 4个微量离心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC温浴5min,备用.
2、 在一个空的微量离心管中加入1pmol的PCR扩增双链DNA,10pmol测序引物,2μl 5×测序缓冲液,加双蒸水至总体积10μl,96OC加热8min,冰浴泠却1min,4OC 10000g离心10s.
3、 加入2μl预冷的标记混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,测序酶2U,加水至15μl,混匀后置冰上2min,标记新合成的DNA链.
4、 在第1步骤的4个管中各加入3.5μl标记反应混合物,37OC温浴5min.每管各加入4μl终止液.
5、 样品在80OC的水浴中热变性5min,每一泳道加2μl 加到测序胶上,电泳分离这些片段.
注意事项：
1.?PCR产物要有一定的长度(>200bp),因为测序结果两端20-30bp的电泳峰图的准确性较低.
2.?纯化PCR产物可通过离子交换层析使扩增的DNA段与反应剩余的dNTP及引物分离；也可通过琼脂糖凝胶电泳,将PCR产物与非特异性扩增产物和引物分离开来；如果扩增的特异性较高时,可直接通过酚：氯仿抽提,乙醇沉淀的方法来纯化.
3.?测序引物设计原则类似于PCR引物设计,可在DNA合成仪上合成20个左右的核苷酸作为引物,经过高压液相层析或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后,即可用作测序引物.
PCR循环测序法
PCR循环测序法是将PCR扩增和核酸序列分析技术相结合,从而形成的一种测定核苷酸序列的研究方法,也称作线性扩增测序.该方法采用PCR仪加热使DNA模板变性,在TaqDNA聚合酶作用下,以温度循环模式在模板上进行多轮的双脱氧核苷酸测序反应,线性扩增标记的DNA分子.
PCR循环测序法与以往的测序方法相比,其优点在于：大大减少所需的模板量；能提高测序反应产生的信号,降低了操作的复杂性,且聚合酶的用量减少；可在小量制备的模板上进行筛选反应；高温下进行的测序反应使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域；双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用,不用作预先碱变性处理.由于PCR循环测序法能够简单、快速地检测特定序列,因此, PCR循环测序法在核酸序列分析研究中受到广泛的重视.
试验试剂：
DNA测序试剂盒
dNTP
ddNTP
丙烯酰胺
双丙烯酰胺
尿素
TEMED(N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺)
过硫酸铵
6%测序胶：6%丙烯酰胺,7mmol/L 尿素,1×TBE.
10×测序缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明胶,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP
终止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L)
终止缓冲液：95%甲酰胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈
试验步骤
1、 4个小离心管,每个小管加入3μl的终止混合液,将管子放在冰上.
2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×测序缓冲液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加双蒸水到30μl彻底混匀,每管7μl加入上面4个小管中.
3、 反应液上加30μl的石蜡油.
4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30个循环,可根据具体的情况进行适当的调整循环条件及循环次数.
5、 反应结束后在油层下加入5μl的终止缓冲液并用加样枪混匀.
6、 上样前将样品在大于80OC的水浴中热变性5min,每一道加2μl加到测序胶上,电泳分离这些片段.
注意事项：
1、 制备测序模板：PCR 扩增的产物可以经过低熔点的琼脂糖凝胶电泳纯化回收后,用于序列分析；可经过柱层析纯化,去除PCR 反应后剩余的dNTP和引物后,用于序列分析.PCR 产物也可不经纯化直接用于测序,但是这种测序产生的结果较差,建议测序之前应进行PCR产物的纯化.各种标准的质粒制备方法所纯化出的质粒均可作为测序模板使用.用标准方法制备的M13噬菌体、粘粒、λDNA都适合用作测序模板用.但要注意的是反应体系中不应有与引物互补的非目的基因序列,否则将会导致测序实验的失败.
2、 测序引物：测序引物是指合成的与测序模板链特异性互补的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5‘端进行标记,反应体系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的标记引物；也可用α-32P-dATP标记新合成的DNA链.引物的浓度不宜高,否则容易形成引物二聚体,或产生非特异性的扩增引物.
3、 酶：各种缺乏3‘—5‘端外切活性的耐热DNA聚合酶都可以用于循环测序,其中TaqDNA聚合酶在DNA测序中最为常用.虽然应用PCR循环测序法能够简单、快速的进行基因序列的测定,但仍未能适应大规模DNA序列测定的需要,而PCR循环测序法、荧光标记和自动测序仪的联合使用成为大规模基因组测序的主要技术.该技术是采用荧光标记引物或双脱氧核苷三磷酸,反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,经特定的DNA序列分析仪和分析系统处理待测的DNA序列.它的应用减轻了DNA序列测定的工作量,提高了测序的效率.

I. 基因工程中转化的方法有哪些什么是载体转化法

通过转化将载体DNA导入受体菌继而得到含有目的DNA插入的转化菌株是构建DNA文库最为关键的一步。
化学法(化学药物如氯化钙等)转化
氯化钙法转化细胞 细菌处于0℃及CaCl2低渗溶液中时，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理促进细胞吸收DNA复合物。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。具体做法：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别载人不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。但这种方法工作量大，具有一定的盲目性。20世纪80年代以后，随着DNA核苷酸序列分析技术的发展，人们已经可以通过DNA序列自动测序仪对提取出的基因进行核苷酸序列分析，并且通过一种扩增DNA的新技术（也叫PCR技术），使目的基因片段在短时间内成百万倍地扩增。上述新技术的出现大大简化了基因工程的操作技术。

J. 说明酶法测核酸序列的原理

• 利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-4-1），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。