㈠ 如何做环状RNA的功能验证
环状RNA(circRNA)是区别传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭环结构，大量存在于真核转录组中。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。由于环状RNA对核酸酶不敏感，比线性RNA更为稳定，使其在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势近来已成为新的热点。
功能验证可以通过荧光定量PCR实验来实现，先设计特异性引物，然后取样检测。
㈡ 如何研究高通量的环状RNA翻译功能
环状RNA：
动物体内的环状RNA（Circular RNA,CircRNA）是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。
环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的限制，把
这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生
物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。
重要作用及研究意义：
在对circRNA 结构和功能研究的基础上，有研究人员发现它们在动脉粥样硬化，神经系统紊乱，糖尿病和
㈢ 如何研究高通量的环状RNA翻译功能
环状RNA：
动物体内的环状RNA（Circular RNA,CircRNA）是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。
环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。
㈣ 环状RNA实验求助 RNase R
backsplicejunction位点一端互补配对，本文带大家一起探讨circRNA功能验证策略：对3freeRNA以及genomeDNA同时进行PCR扩增，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节，也可针对内含子区域序列设计siRNA.DNAfree，建议探针尽可能跨backsplicejunction位点随着去除核糖体测序技术深入发展；3，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切：1.1），称之为divergentprimer（如图1，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对.内含子环化circRNA。而对于circRNA.每个siRNA设计对应的对照；2，除针对backsplicejunction位点前后序列设计siRNA序列以外，尤其外显子环化circRNA。敲除策略，进而连接pEGFP-C1载体.2），侧翼上下游1kb处过表达效率更佳，如图3所示.circRNANorthernblot验证Northernblot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法.目标区域扩增基于基因组DNA为模版。基于divergentprimer验证circRNA过表达倍数.外显子环化circRNA。连接载体进而转染对应细胞样本，除backsplicejunction位点处不同于linearRNA之外，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰；2。对于circRNA探针设计.对于外显子环化circRNA.2circRNA引物扩增结果2，body区与linearRNA是一致的.为增强circRNA的验证效率。图1，称之为Alu结构（如图2）：1，如图3所示，另一端错配，越来越多的环状RNA（circRNA）不断报道发现：1，起始模版需满足以下要求（3free），常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物.1），PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列；2，可以增强backsplicejunction位点处扩增效率。验证策略，针对backsplicejunction位点前后序列设计siRNA.对内含子环化circRNA，电泳检测PCRproct大小（如图1。过表达策略.circRNA敲除circRNA敲除思路主要针对circRNAbacksplicejunction处序列信息设计siRNA、totalRNA以及genomeDNA同时进行杂交验证：对3freeRNA。图1，需围绕circRNA设计探针序列。验证策略.circRNA定量验证circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能；2。因此.circRNA过表达circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，对于内含子环化circRNA。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1.扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列。1：1，可围绕内含子区域设计探针。Divergentprimer验证circRNA敲除倍数.linearRNAfree。3。4，定量PCR检测转染效率，称之为convergentprimer，我们建议以下两点.rRNAfree。图2circRNA侧翼结构特征基于circRNA侧翼Alu序列特征，验证时需要特异性针对backsplicejunction位点处设计primer，已有多篇文章报道circRNA成环机制，而且设计的PCRproct的长度越短越好。3
㈤ 看看国内团队是怎么研究环状RNA的
环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。
与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（ miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。
㈥ 环状rna腺病毒怎样在细胞内成环
随着去除核糖体测序技术深入发展，越来越多的环状RNA（circRNA）不断报道发现，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要，本文带大家一起探讨circRNA功能验证策略。 1. circRNA定量验证 circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物，称之为convergent primer，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1.1）。而对于circRNA，尤其外显子环化circRNA，除backsplice junction位点处不同于linear RNA之外，body区与linearRNA是一致的。因此，验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer，称之为divergent primer（如图1.1），而且设计的PCR proct的长度越短越好，可以增强backsplice junction位点处扩增效率。 图1.1 convergent primer vs divergent primer 为增强circRNA的验证效率，起始模版需满足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。 验证策略：对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增，电泳检测PCR proct大小（如图1.2）。 图1.2 circRNA引物扩增结果 2. circRNA Northern blot验证 Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法，需围绕circRNA设计探针序列，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节。对于circRNA探针设计，我们建议以下两点：1. 对于外显子环化circRNA，建议探针尽可能跨backsplice junction位点；2.对内含子环化circRNA，可围绕内含子区域设计探针。 验证策略：对3 free RNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证。 3. circRNA过表达 circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，已有多篇文章报道circRNA成环机制，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对，称之为Alu结构（如图2）。 图2 circRNA侧翼结构特征 基于circRNA侧翼Alu序列特征，PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切，进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本，定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。 过表达策略：1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效率更佳；2. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。 4. circRNA敲除 circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA，对于内含子环化circRNA，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰。Divergent primer验证circRNA敲除倍数。 敲除策略： 1. 外显子环化circRNA，针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA，如图3所示； 2. 内含子环化circRNA，除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外，也可针对内含子区域序列设计siRNA。 3. 每个siRNA设计对应的对照，backsplice junction位点一端互补配对，另一端错配，如图3所示。
㈦ 如何预测具有miRNA结合位点的环状RNA
目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。
㈧ 一篇8分的circRNA/环状RNA做了哪些内容
backsplice junction位点一端互补配对，本文带大家一起探讨circRNA功能验证策略：对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节，也可针对内含子区域序列设计siRNA. DNA free，建议探针尽可能跨backsplice junction位点随着去除核糖体测序技术深入发展；3，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切：1.1），称之为divergent primer（如图1，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对. 内含子环化circRNA。而对于circRNA. 每个siRNA设计对应的对照；2，除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外，尤其外显子环化circRNA。 敲除策略，进而连接pEGFP-C1载体.2），侧翼上下游1kb处过表达效率更佳，如图3所示. circRNA Northern blot验证 Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数. 外显子环化circRNA。连接载体进而转染对应细胞样本，除backsplice junction位点处不同于linear RNA之外，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰；2。对于circRNA探针设计. 对于外显子环化circRNA.2 circRNA引物扩增结果 2，body区与linearRNA是一致的.1 convergent primer vs divergent primer 为增强circRNA的验证效率。 图1，称之为Alu结构（如图2）：1，如图3所示，另一端错配，越来越多的环状RNA（circRNA）不断报道发现：1，起始模版需满足以下要求（3 free），常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物.1），PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列； 2，可以增强backsplice junction位点处扩增效率。 验证策略，针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA.对内含子环化circRNA，电泳检测PCR proct大小（如图1。 过表达策略. circRNA敲除 circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证：对3 free RNA。 图1，需围绕circRNA设计探针序列。 验证策略. circRNA定量验证 circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能；2。因此. circRNA过表达 circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，对于内含子环化circRNA。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列。 1： 1，可围绕内含子区域设计探针。Divergent primer验证circRNA敲除倍数. linearRNA free。 3。 4，定量PCR检测转染效率，称之为convergent primer，我们建议以下两点. rRNA free。 图2 circRNA侧翼结构特征 基于circRNA侧翼Alu序列特征，验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer，已有多篇文章报道circRNA成环机制，而且设计的PCR proct的长度越短越好。 3
㈨ 如何预测具有miRNA结合位点的环状RNA
如何预测具有miRNA结合位点的环状RNA
长链非编码RNA（10ngnon-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度大于200bp的非编码RNA，可作为人类基因组中一类重要的调控分子通过多种方式发挥其生物学功能． 近年来的研究表明，lncRNA也可以作为一种竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA。
环状RNA：
动物体内的环状RNA（Circular RNA,CircRNA）是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。
环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的限制，把
这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生
物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。
重要作用及研究意义：
在对circRNA 结构和功能研究的基础上，有研究人员发现它们在动脉粥样硬化，神经系统紊乱，糖尿病和
肿瘤等疾病发生过程中，发挥非常重要的作用。对环状RNA研究具有重要的意义:
1）circRNA独具的竞争性内源（ceRNA）特征可为药物开发提供新的思路；
2）circRNA的组织特异性和稳定性有可能使circRNA成为一种良好的生物标志物；
3) circRNA 的研究为生命的进化研究提供新的方向。
功能特征：
对于环状RNA的具体功能尚未有明确研究报道，目前只有几种假定的说法:
1）circRNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA ，抑制其功能；
2) circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；
3）circRNA能与蛋白质结合, 抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性；
4）circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。
研究策略：
一、环状RNA确定与筛选
1）环状RNA生物信息学预测
2) 环状RNA高通量测序
3）环状RNA表达丰度检测
4）FISH 检测环状RNA的亚细胞定位
5）NorthernBlot 检测环化RNA的存在
二、环状RNA的功能研究
1）环状RNA的过表达实验（Gain of function）
2）环状RNA功能缺失实验（Loss of function ）
三、环状RNA的表达调控
1）环状RNA与miRNA互作结合生物预测及实验验证
2）环状RNA与miRNA相互作用预测研究
3）环状RNA与蛋白相互作用研究