A. 如何学明白细胞信号转导
【细胞信号转导】
细胞信号转导是指细胞通过胞膜或胞内受体感受信息分子的刺激，经细胞内信号转导系统转换，从而影响细胞生物学功能的过程。水溶性信息分子及前列腺素类（脂溶性）必须首先与胞膜受体结合，启动细胞内信号转导的级联反应，将细胞外的信号跨膜转导至胞内；脂溶性信息分子可进入胞内，与胞浆或核内受体结合，通过改变靶基因的转录活性，诱发细胞特定的应答反应。
【转导受体】
（一）膜受体
1．环状受体(离子通道型受体)
多为神经递质受体,受体分子构成离子通道。受体与信号分子结合后变构，导致通道开放或关闭。引起迅速短暂的效应。
2．蛇型受体
7个跨膜α-螺旋受体，有100多种，都是单条多肽链糖蛋白，如G蛋白偶联型受体。
3．单跨膜α-螺旋受体
包括酪氨酸蛋白激酶型受体和非酪氨酸蛋白激酶型受体。
（1）酪氨酸蛋白激酶型受体这类受体包括生长因子受体、胰岛素受体等。与相应配体结合后，受体二聚化或多聚化，表现酪氨酸蛋白激酶活性，催化受体自身和底物Tyr磷酸化，有催化型受体之称。
（2）非酪氨酸蛋白激酶型受体，如生长激素受体、干扰素受体等，。当受体与配体结合后，可偶联并激活下游不同的非受体型TPK，传递调节信号。
（二）胞内受体
位于胞液或胞核，结合信号分子后，受体表现为反式作用因子，可结合DNA顺式作用元件，活化基因转录及表达。包括类固醇激素受体、甲状腺激素受体等。胞内受体都是单链蛋白，有4个结构区：①高度可变区②DNA结合区③激素结合区④绞链区。
(三)受体与配体作用的特点是：①高度亲和力，②高度特异性，③可饱和性
1．受体：位于细胞膜上或细胞内，能特异性识别生物活性分子并与之结合，进而引起生物学效应的特殊蛋白质，膜受体多为镶嵌糖蛋白：胞内受体全部为DNA结合蛋白。受体在细胞信息传递过程中起极为重要的作用。
2．G蛋白：即鸟苷酸结合蛋白，是一类位于细胞膜胞浆面、能与GDP或GTP结合的外周蛋白，由α、β、γ三个亚基组成。以三聚体存在并与GDP结合者为非活化型。当α亚基与GTP结合并导致βγ二聚体脱落时则变成活化型，可作用于膜受体的不同激素,通过不同的G蛋白介导影响质膜上某些离子通道或酶的活性，继而影响细胞内第二信使浓度和后续的生物学效应。
【传递途径】
1．G蛋白介导的信号转导途径G蛋白可与鸟嘌呤核苷酸可逆性结合。由x和γ亚基组成的异三聚体在膜受体与效应器之间起中介作用。小G蛋白只具有G蛋白亚基的功能，参与细胞内信号转导。信息分子与受体结合后，激活不同G蛋白，有以下几种途径：（1）腺苷酸环化酶途径通过激活G蛋白不同亚型，增加或抑制腺苷酸环化酶（AC）活性，调节细胞内cAMP浓度。cAMP可激活蛋白激酶A（PKA），引起多种靶蛋白磷酸化，调节细胞功能。（2）磷脂酶途径激活细胞膜上磷脂酶C(PLC)，催化质膜磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）水解，生成三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG）。IP3促进肌浆网或内质网储存的Ca2+释放。Ca2+可作为第二信使启动多种细胞反应。Ca2+与钙调蛋白结合，激活Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶或磷酸酯酶，产生多种生物学效应。DG与Ca2+能协调活化蛋白激酶C（PKC）。
2．受体酪氨酸蛋白激酶(RTPK)信号转导途径受体酪氨酸蛋白激酶超家族的共同特征是受体本身具有酪氨酸蛋白激酶（TPK）的活性，配体主要为生长因子。RTPK途径与细胞增殖肥大和肿瘤的发生关系密切。配体与受体胞外区结合后，受体发生二聚化后自身具备(TPK)活性并催化胞内区酪氨酸残基自身磷酸化。RTPK的下游信号转导通过多种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的级联激活：（1）激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），（2）激活蛋白激酶C（PKC），（3）激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），从而引发相应的生物学效应。
3．非受体酪氨酸蛋白激酶途径此途径的共同特征是受体本身不具有TPK活性，配体主要是激素和细胞因子。其调节机制差别很大。如配体与受体结合使受体二聚化后，可通过G蛋白介导激活PLC-β或与胞浆内磷酸化的TPK结合激活PLC-γ，进而引发细胞信号转导级联反应。
4．受体鸟苷酸环化酶信号转导途径一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）可激活鸟苷酸环化酶（GC），增加cGMP生成，cGMP激活蛋白激酶G（PKG），磷酸化靶蛋白发挥生物学作用。
5．核受体信号转导途径细胞内受体分布于胞浆或核内，本质上都是配体调控的转录因子，均在核内启动信号转导并影响基因转录，统称核受体。核受体按其结构和功能分为类固醇激素受体家族和甲状腺素受体家族。类固醇激素受体（雌激素受体除外）位于胞浆，与热休克蛋白（HSP）结合存在，处于非活化状态。配体与受体的结合使HSP与受体解离，暴露DNA结合区。激活的受体二聚化并移入核内，与DNA上的激素反应元件（HRE）相结合或其他转录因子相互作用，增强或抑制基因的转录。甲状腺素类受体位于核内，不与HSP结合，配体与受体结合后，激活受体并以HRE调节基因转录。
总之，细胞信息传递途径包括配体受体和转导分子。配体主要包括激素细胞因子和生长因子等。受体包括膜受体和胞内受体。转导分子包括小分子转导体和大分子转导蛋白及蛋白激酶。膜受体包括七个跨膜α螺旋受体和单个跨膜α螺旋受体，前一种膜受体介导的信息途径包括PKA途径，PKC途径，Ca离子和钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径和PKG途径，第二信使分子如cAMPDGIP3CacGMP等参与这些途径的信息传递。后一种膜受体介导TPK—Ras—MAPK途径和JAKSTAT途径等。胞内受体的配体是类固醇激素、维生素D3、甲状腺素和维甲酸等，胞内受体属于可诱导性的转录因子，与配体结合后产生转录因子活性而促进转录。通过细胞信息途径把细胞外信息分子的信号传递到细胞内或细胞核，产生许多生物学效应如离子通道的开放或关闭和离子浓度的改变酶活性的改变和物质代谢的变化基因表达的改变和对细胞生长、发育、分化和增值的影响等。
【细胞凋亡】
细胞凋亡是一个主动的信号依赖过程，可由许多因素诱导，如放射线照射、缺血缺氧、病毒感染、药物及毒素等。这些因素大多可通过激活死亡受体而触发细胞凋亡机制。死亡受体存在于细胞表面。属于肿瘤坏死因子受体超家族，它们与相应的配体或抗体结合而活化后，其胞浆区即可与一些信号转导蛋白结合，其中重要的是含有死亡结构域的胞浆蛋白。它们通过死亡结构域一方面与死亡受体相连，另一方面与下游的capase蛋白酶结合，使细胞膜表面的死亡信号传递到细胞内。
capase蛋白酶家族作为细胞凋亡的执行者，它们活化后进一步剪切底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）该酶与DNA修复及基因完整性监护有关，PARP被剪切后，失去正常的功能，使受其抑制的核酸内切酶活性增高，裂解核小体间的DNA，最终引起细胞凋亡。这个过程可概括为：死亡受体含有死亡结构域的胞浆蛋白—capase蛋白酶家族—底物PARP—染色体断裂—细胞凋亡。不同种类的细胞在接受不同的细胞外刺激后引起凋亡的形态学改变是高度保守的，但是它们并不是遵循同一种固定的或有规律的模式进行，而是通过各自的信号转导途径来传递胞膜上的死亡。
B. 细胞间信号转导的主要四种方式
以高中的教材为依据只有三种：
1．通过体液的作用来完成的间接交流。
如内分泌细胞分泌→激素进入→体液体液运输→靶细胞受体信息→靶细胞，（即激素→靶细胞。如胰岛素作用于体细胞）
2．相邻细胞间直接接触，通过与细胞膜结合的信号分子（糖蛋白）影响其他细胞，即细胞←→细胞。 如精子和卵细胞之间的识别和结合。
3．相邻细胞间形成通道使细胞相互沟通，通过携带信息的物质来交流信息。即细胞←通道→细胞。如高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接，进行细胞间的信息交流。
例子很重要，要记住！
C. 细胞膜跨膜信号转导的主要方式有那三种
(一)通道蛋白质介导的跨膜信号转导又分为:1.化学门控通道2.电压门控通道
(二)膜受体蛋白质介导的跨膜信号转导
D. 细胞间信号转导的主要四种方式
以高中的教材为依据只有三种：
1．通过体液的作用来完成的间接交流。
如内分泌细胞分泌→激素进入→体液体液运输→靶细胞受体信息→靶细胞，（即激素→靶细胞。如胰岛素作用于体细胞）
2．相邻细胞间直接接触，通过与细胞膜结合的信号分子（糖蛋白）影响其他细胞，即细胞←→细胞。
如精子和卵细胞之间的识别和结合。
3．相邻细胞间形成通道使细胞相互沟通，通过携带信息的物质来交流信息。即细胞←通道→细胞。如高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接，进行细胞间的信息交流。
例子很重要，要记住！
E. 植物细胞信号转导的主要途径，各途径之间的关系，以及转导中的重要因子
植物体内的信号传导 Signal Transction
生物体的生长发育受遗传信息及环境信息的调节控制。基因决定了个体发育的基本模式，但其表达和实现在很大程度上受控于环境信息的刺激。植物的不可移动性使它难以逃避或改变环境，接受环境变化信息，及时作出反应，调节适应环境是植物维持生存的出路。已经发现的植物细胞的信号分子也很多，按其作用的范围可分为胞间信号分子和胞内信号分子。细胞信号传导的分子途径可分为胞间信使、膜上信号转换机制、胞内信号及蛋白质可逆磷酸化四个阶段
一．胞间信号传递
胞间信号一般可分为物理信号（physical signal）和化学信号（chemical signal）两类。物理信号如细胞感受到刺激后产生电信号传递，许多敏感植物受刺激时产生动作电位，电波传递和叶片运动伴随。水力信号（hydraulic signal）。化学信号是细胞感受刺激后合成并传递化学物质，到达作用部位，引起生理反应，如植物激素等。信号物质可从产生的部位经维管束进行长距离传递，到达作用的靶子部位。
传导途径是共质体和质外体。
二．跨膜信号转换机制（signal transction）
信号到达靶细胞，首先要能被感受并将其转换为胞内信号，再启动胞内各种信号转导系统，并对原初信号进行级联放大，最终导致生理生化变化。
1． 受体（receptor）
主要在质膜上，能与信号物质特异结合，并引发产生胞内次级信号的物质，主要是蛋白质。信号与受体结合是胞间信使起作用并转换为胞内信使的首要步骤。目前研究较活跃的两类受体是光受体和激素受体。光受体有对红光和远红光敏感的光敏色素、对蓝光和紫外光敏感的隐花色素以及对紫外光敏感的受体等；激素受体的研究正在进展中，如质膜上的乙烯受体，质膜或胞内的其他激素的结合蛋白等。
2． G蛋白（G proteins）
GTP结合调节蛋白（GTP binding regulatory protein）。其生理活性有赖于三磷酸鸟苷（GTP）的结合并具有GTP水解酶的活性。70年代初在动物细胞中发现了G蛋白，证明了它在跨膜细胞信号转导过程中有重要的调控作用，Gilman与Rodbell因此获得1994年诺贝尔医学生理奖。80年代开始在植物体内研究，已证明G蛋白在高等植物中普遍存在并初步证明G蛋白在光、植物激素对植物的生理效应中、在跨膜离子运输、气孔运动、植物形态建成等生理活动的细胞信号转导过程中同样起重要的调控作用。由于G蛋白分子的多样性………在植物细胞信号系统中起着分子开关的重要作用。
三，胞内信号
如果将胞外刺激信号称作第一信使，由胞外信号激活或抑制、具有生理调节活性的细胞内因子称第二信使（second messenger）。植物细胞中的第二信使不仅仅是一种，也可总称为第二信使系统。
1．钙信号系统
在植物细胞内外以及细胞内的不同部位Ca2+的浓度有很大的差别。在细胞质中，一般在10－8～10－7 mol/L，而细胞壁是细胞最大的Ca2+库，其浓度可达1～5mol/L。胞内细胞器的Ca2+浓度也比胞质的Ca2+浓度高几百倍到上千倍。几乎所有的胞外刺激信号都能引起胞质游离Ca2+浓度变化，由于变化的时间、幅度、频率、区域化分布的不同，可能区别信号的特异性。
钙调节蛋白
胞内钙信号再通过其受体――钙调节蛋白传递信息。主要包括钙调素（calmolin CaM）和钙依赖的蛋白激酶，植物细胞中CaM是最重要的多功能Ca2+信号受体。这是由148个氨基酸组成的单链小分子酸性蛋白（分子量为17～19KDa）。CaM分子有四个Ca结合位点，当第一信使引起胞内Ca2+浓度上升到一定阈值后，Ca2+与CaM结合，引起CaM构象改变，活化的CaM再与靶酶结合，使其活化而引起生化反应。已知有蛋白激酶、NAD激酶、H+－ATP酶等多种酶受Ca-CaM的调控。在以光敏素为受体的光信号转导过程中，Ca-CaM胞内信号起了重要作用。
3． 肌醇磷脂（inositide）信号系统
这是肌醇分子六碳环上的羟基被不同数目磷酸酯化形成的一类化合物。80年代后期的研究证明植物细胞质膜中存在三种主要的肌醇磷脂，即磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰肌醇－4－磷酸（PIP）、磷脂酰肌醇－4,5－二磷酸（PIP2）。胞为信号被质膜受体接受后，以G蛋白为中介，由质膜中的磷酸脂酶C（PLC）水解PIP2产生肌醇－3－磷酸（IP3）和甘油二酯（DG）两种信号分子，所以，又可称双信使系统。IP3通过调节Ca2+变化、DG通过激活蛋白激酶C（PKC）传递信息。
4． 环核苷酸信号系统
受动物细胞信号启发，在植物细胞中也存在环腺苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）参与信号转导。
四．蛋白质的可逆磷酸化 (phosphoralation)
细胞内存在的多种蛋白激酶（protein kinase）蛋白磷酸酶（protein phosphatase）是前述胞内信使进一步作用的靶子，通过调节胞内蛋白质的磷酸化或去磷酸化而进一步传递信息。如钙依赖型蛋白激酶（CDPK），其磷酸化后，可将质膜上的ATP酶磷酸化，从而调控跨膜离子运输；又如和光敏素相关的Ca-CaM调节的蛋白激酶等。
蛋白磷酸酶起去磷酸化作用，是终止信号或一种逆向调节。
植物体内、细胞内信号转导是一个新的研究领域，正在进展中，需要完善已知的、并发现新的植物信号转导途径（H＋、H2O、Mg2＋、氧化还原物质等）；信号系统之间的相互关系（cross talk）及时空性研究，细胞内实际上存在着信号网络，多种信号相互联系和平衡来决定特异的细胞反应；利用新的技术如基因工程及微注射等研究信号转导的分子途径，以及它对基因表达调控功能；植物细胞壁与细胞内信号的联系，是否存在细胞壁－质膜－细胞骨架信息传递连续体等。
F. 信号通路研究思路
原文：信号通路研究思路_网络文库 https://wenku..com/view/449d5a41ec3a87c24128c450
证明一个药物能通过抑制P38表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是：
要证明你的药物是通过抑制P38表达而发挥保护作用，
首先 ，要证明P38表达增加会导致损伤。
其次，要证明你的药物存在保护作用。
再次，证明你的药物可以抑制P38表达。
最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。
这里需要建立一个损伤模型。正如你提到的，钙离子导致P38mapk的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致P38mapk的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。这时，对P38做个RNA干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说P38mapk的增高会导致损伤。
这里最好不要用P38的抑制剂SB来处理，因为这个抑制剂是针对P38活性的抑制剂，抑制的是P38的磷酸化，而不是表达量。
如果说明的问题是p38磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。这时还可以用Dominant-negative。抑制剂的实验证实该药物不影响P38表达，而影响其活化。（应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。如果在此应用RNAi的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。）
当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说你的药物存在保护作用。
用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测P38表达，如果用药组相对于没有用药组P38表达下降，那么可以说你的药物可以抑制P38表达。
这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。
这里建议还是用RNA干扰P38表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。
抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原因是抑制剂缺乏特异性。虽然我们在文章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。
PI3K的抑制剂---LY294002和wortmannin,它们都能抑制PI3K和相关的激酶，但LY294002的浓度达到200μM常用来抑制DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在浓度超过3μM常用来抑制运动失调性毛细血管扩张基因突变（ATM)以及DNA-PK。相对而言，MEK1/2的抑制剂U0126和PD98059以及P38MAPK的抑制剂SB203580就要好一些。所以研究人员一般应用LY294002时采用20μM，应用wortmannin时采用0.2μM，以此来最小化其他的效应。有些学者们同时应用两种抑制剂进行对比，也许也有顾及于此的原因吧。
但是，从严谨的角度讲起特异性的话，RNAi也不能说是绝对特异的，我们只能说它是高特异性，因为RNAi的机制中还有很多没有完全阐明。 一些研究者会在RNAi处理后，还要在实验中应用Western来同时检测该蛋白所在家族的其他成员的表达量变化以检测其特异性和选择性，以表严谨 。举个例子：
比如针对Survivin进行RNAi之后，你最好同时检测XIAP , cIAP1/2等蛋白。当然，如果你所针对基因的siRNA构建已经很成熟，有前人的文章检测特异性做基础，那就另当别论了，所以给科研态度很严谨的lwjssry兄弟提个醒，如果你的siRNA序列尚无很好的文献应用基础，这个问题你也许应该考虑的。
临时找到一个描诉相关内容的06年文献，影响因子3分多，截取其中的内容供参考
信号通路有细胞特异性和条件特异性，即同一信号通路在不同的细胞之间或同一细胞在不同的条件下，作用机理可能是不同的。
细胞内的信号通路之间存在复杂的相互作用，想证明哪一个分子是另一分子的充要条件真的很难。本人最近研究了一个信号系统的两个信号分子，A和B。A在细胞质，B在细胞核。以往的研究已经证明A是B的上游信号通路之一。我们的研究是想证明在某种病理过程中A和B作为一个系统发挥作用。我们首先应用能够提升该系统的药物干预，发现A升高的同时B也得到升高，但这也不能说明什么问题。所幸的是A分子目前有特异性的阻断剂，于是我们便对A分子的激活进行阻断，结果发现B分子的激活也收到抑制。由此初步推测A和B可能在某种病理过程中作为一个系统发挥作用。但也只能证明了A是B的必要条件而已。
做信号传导的在于你研究一种的机制有什么作用，其机制是否于信号传导有关，有哪些关系，是什么原因导致此信号传导的表达，表达后的下游基因怎么变化，这中间最好有基因敲出或者抑制剂和激动剂干预后看看上游 下游之间的变化和你预期的结果有没有关系。如果单纯的做信号传导而去做没有什么意义的，就像前面楼上说的一样信号的启动/最终发挥功能！
“想证明哪一个分子是另一分子的充要条件真的很难”。 我最近正在做一个实验，证明A对B的作用。先用外源物处理细胞，跑wetern blot，发现A和B都有所增加，B的量增加在A之后。于是用抑制剂抑制A，以及用siRNA使A knockdown，然后看B的表达量也下来了。但是这也只能证明A和B有关联，无法证明A对B是直接作用还是间接作用。甚至无法说明B的改变是A信号knockdown造成的，还是A信号knockdown以后，细胞为了弥补该信号的不足，补充促进了C信号，而C信号可以改变B信号。最近在考虑用Co-IP证明A和B有结合作用，也许能证明A和B的直接关系。
探讨信号转导中分子间的充要条件，与探讨数学中的充要条件是不一样的，因为细胞中信号转导通路往往存在反馈机制。即使X是上游信号，Y是下游信号，改变Y信号也会通过反馈机制使得X信号发生改变。所以，在考虑生物体内的信号分子间充要条件时会复杂得多，要慎之又慎下结论。
信号分子的环路效应普遍存在
个人觉得研究A分子与某个信号通路应该更具体得分为两种情况：
1，以前还不知道A分子是这个信号通路的成分，这时我们要证明A分子是这个信号通路的成分，这时的研究就是上文谈到的研究内容了。
2，A分子是信号通路的成分，这是已知的，现在发现某个现象跟这个通路有关，现在我们要证明A分子是这个信号通路参与这个现象的关键分子，则又是另一种模式。1，“创造信号通路”，别人没有研究过A和B 之间的相互作用，而你发现了，并证明了，这就是创造，其实准确点说应该是“发现”，因为信号通路是客观存在的，只不过被找到了而已，不过用“创造”这个词比较形象。这一类的研究是开创性的，比较困难的，研究的时候常常是用免疫共沉淀去把与某个蛋白结合的一堆蛋白都搞出来，再做质谱分析，进行鉴定，再进一步证明两者间的相互作用，这就涉及到充分必要条件的证明。单纯进行这一类的研究缺乏目的性和研究的意义，所以通常还是建立于某种现象基础上的，用自己“创造”的信号通路来解释某种现象，也就是下面说的第二种模式。
2，“利用信号通路”，利用别人或自己“创造”的信号通路来解释某个具体的现象，比如，某个药物、某种毒物、某种应激、某种射线、等等，在这些刺激下，具体到某种细胞的某条信号通路发挥调控作用。
在第一类中，是用充分必要条件来证实A分子与B分子的作用。
在第二类中，是用充分必要条件来证实A现象与B信号通路之间的关系。
看文献是最基础的训练，看文献，一是看思路，二是学技术和逻辑思维。思路告诉我们为什么去做，技术和逻辑思维教我们怎么去做。
过表达A基因，发现B基因的mRNA水平明显增加，对应的B的蛋白水平也明显增加；干扰A基因表达，发现B基因的mRNA水平明显降低，对应的B的蛋白水平也明显降低。投稿，被拒稿，主要原因是审稿人提出：应该弄清楚A是如何调控B的表达的。请问各位老师，A调控B可能是通过什么途径？需要做什么实验？A和B都是脂类代谢中的酶基因，它们在胞浆和核内都有表达。
回答：
1、下一步应该搞清楚B基因mRNA改变的原因是什么，在转录水平还是影响了RNA的稳定性。
2、假设A和B是直接关联的（假定A影响B的转录），是否一般得做两个实验：Luciferase reporter assay和CHIP assay？只做一个CHIP实验行不行？其中Luciferase reporter assay是否就是为了检验A蛋白是否能结合到B基因的Promoter区？是不是A蛋白必须得是转录因子才有可能结合到B基因的Promoter区？另外，怎么知道A蛋白是不是转录因子呢？
针对这个问题的回答：不过建议找几篇JBC上的文章看看，JBC上这种调调的文章挺多的，精读3-5篇，把它的outline搞清楚，你就胸有成竹了。——我打开JBC网站一看，呵呵，每期专门有Gene Regulation板块。根据JBC上面的文章，A调控B基因，很多都是通过第三者如转录因子实现的。我再翻出以前自己的Real-time PCR实验结果，发现过表达A基因后，转录因子C的mRNA水平显着增加，而干扰A基因表达，转录因子C的mRNA水平显着降低。目前这个现象还没有文献报道。后期，我准备通过Luciferase reporter assay和CHIP assay来验证转录因子C是否能与B基因作用。我想请教的问题是：A基因调控转录因子C，除了前期的Real-time PCR实验（当然再补一个Western Blot实验），我还需要做其他实验吗？会不会审稿人再提出：你需要弄清楚A基因如何调控转录因子C才行。说简单点：A基因通过转录因子C调控基因B，是否要将A影响C，C影响B两步都弄清楚？——看你的目标杂志了，如果是JBC这样偏机制的，估计会要你说清楚的
3、A可以影响B的mRNA水平，也能影响B的蛋白水平，这样的话，可能是只通过影响B的RNA水平影响B的蛋白表达，也可能同时影响B的RNA水平和B的蛋白稳定性。B的蛋白稳定性你可以通过加入CHX检测B的半衰期。另外就是你说的Luciferase reporter assay实验。
4、A和B的变化总是一致的，应该很有可能是通过转录水平调控的，因为你的mRNA、蛋白都变了。既然是转录水平，那就要找到B的启动子的序列，对应和这个序列结合的蛋白，这个蛋白可能是A也可能是其他的间接的。
http://..com/question/187327495.html
将两种因子A和B分别做基因沉默，沉默A gene 看看A和B表达的情况，然后沉默B gene 再看看A和B表达的情况。上游的因子被沉默表达后，下游的因子肯定表达下调或不表达。而下游因子被沉默表达后，上游因子的表达不会受影响。还可以做个免疫共沉淀，看看上游因子是不是直接结合（作用）于下游因子的基因启动子区，开启下游表达。如若不是，可能另有其他的环节在中间过程。
http://www.helixnet.cn/bbs/thread-19295-1-1.html
《受体信号转导研究方法（第2版） 》
作者： （英）维拉斯（Willars，G.B.），（英）查理斯（Challiss，R.A.J）原着，
张幼怡主译
出 版 社： 北京大学医学出版社
出版时间： 2008-3-1 <wbr>
这本书全面反映了G蛋白偶联受体(GPCR)及其信号转导领域中最新的研究现状和成就，详细介绍了受体及其信号转导研究的技术、方法及原理。内容涉及受体与配体的结合、受体抗体的制备、受体与G蛋白的相互作用和激动、受体表达和定位、受体内化和翻译后修饰、GPCR与蛋白质相互作用以及如何利用敲除和敲人策略研究受体生理与药理功能等新技术、新策略。
可以通过对受体 加抗体处理 或者 RNAi/过表达 等方式，调节受体表达量，然后用 基因芯片技术 研究下游通路各基因的表达情况。
在上述方法做完后，可以用受体的好用的抗体，做个免疫共沉淀(CoIP)，将所有和它相互作用的蛋白抓下来，直接煮珠子(protein A-argrose-beads)，做SDS-PAGE，用IgG做对照，然后打质谱，鉴定出差异蛋白，当然这只是补充试验，胶图上分子量大的可能是下游蛋白，而分子量小的可能是上下游信号蛋白。
G. 如何研究信号传导通路请问研究某种受体或蛋白的下游信号传导通路，实验设计的一般方法，都有哪些谢谢
在KEGG或BioCarta这些pathway数据库里找到你感兴趣的通路，在pathway图上找到你感兴趣的蛋白后就能确认它的下游。实验方法大体上就是上调（瞬时表达、mimics）或下调（Knockout、RNAi）你的Gene of Interest，再检测下游的蛋白发生了上调还是下调，看看你的GOI和它们什么联系。
H. 细胞信号转导的传递途径主要有哪些
专业名词叫细胞信号转导
从大类上看共分为
1．G蛋白介导的信号转导途径G蛋白可与鸟嘌呤核苷酸可逆性结合.由x和γ亚基组成的异三聚体在膜受体与效应器之间起中介作用.小G蛋白只具有G蛋白亚基的功能,参与细胞内信号转导.信息分子与受体结合后,激活不同G蛋白,有以下几种途径：（1）腺苷酸环化酶途径通过激活G蛋白不 细胞信号转导同亚型,增加或抑制腺苷酸环化酶（AC）活性,调节细胞内cAMP浓度.cAMP可激活蛋白激酶A（PKA）,引起多种靶蛋白磷酸化,调节细胞功能.（2）磷脂酶途径激活细胞膜上磷脂酶C(PLC),催化质膜磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）水解,生成三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG）.IP3促进肌浆网或内质网储存的Ca2+释放.Ca2+可作为第二信使启动多种细胞反应.Ca2+与钙调蛋白结合,激活Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶或磷酸酯酶,产生多种生物学效应.DG与Ca2+能协调活化蛋白激酶C（PKC）.
2．受体酪氨酸蛋白激酶(RTPK)信号转导途径受体酪氨酸蛋白激酶超家族的共同特征是受体本身具有酪氨酸蛋白激酶（TPK）的活性,配体主要为生长因子.RTPK途径与细胞增殖肥大和肿瘤的发生关系密切.配体与受体胞外区结合后,受体发生二聚化后自身具备(TPK)活性并催化胞内区酪氨酸残基自身磷酸化.RTPK的下游信号转导通过多种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的级联激活：（1）激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）,（2）激活蛋白激酶C（PKC）,（3）激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）,从而引发相应的生物学效应.
3．非受体酪氨酸蛋白激酶途径此途径的共同特征是受体本身不具有TPK活性,配体主要是激素和细胞因子.其调节机制差别很大.如配体与受体结合使受体二聚化后,可通过G蛋白介导激活PLC-β或与胞浆内磷酸化的TPK结合激活PLC-γ,进而引发细胞信号转导级联反应.
4．受体鸟苷酸环化酶信号转导途径一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）可激活鸟苷酸环化酶（GC）,增加cGMP生成,cGMP激活蛋白激酶G（PKG）,磷酸化靶蛋白发挥生物学作用.
5．核受体信号转导途径细胞内受体分布于胞浆或核内,本质上都是配体调控的转录因子,均在核内启动信号转导并影响基因转录,统称核受体.核受体按其结构和功能分为类固醇激素受体家族和甲状腺素受体家族.类固醇激素受体（雌激素受体除外）位于胞浆,与热休克蛋白（HSP）结合存在,处于非活化状态.配体与受体的结合使HSP与受体解离,暴露DNA结合区.激活的受体二聚化并移入核内,与DNA上的激素反应元件（HRE）相结合或其他转录因子相互作用,增强或抑制基因的转录.甲状腺素类受体位于核内,不与HSP结合,配体与受体结合后,激活受体并以HRE调节基因转录.
总之,细胞信息传递途径包括配体受体和转导分子.配体主要包括激 细胞信号转导素细胞因子和生长因子等.受体包括膜受体和胞内受体.转导分子包括小分子转导体和大分子转导蛋白及蛋白激酶.膜受体包括七个跨膜α螺旋受体和单个跨膜α螺旋受体,前一种膜受体介导的信息途径包括PKA途径,PKC途径,Ca离子和钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径和PKG途径,第二信使分子如cAMP、DG、IP3、Ca、cGMP等参与这些途径的信息传递.后一种膜受体介导TPK—Ras—MAPK途径和JAKSTAT途径等.胞内受体的配体是类固醇激素、维生素D3、甲状腺素和维甲酸等,胞内受体属于可诱导性的转录因子,与配体结合后产生转录因子活性而促进转录.通过细胞信息途径把细胞外信息分子的信号传递到细胞内或细胞核,产生许多生物学效应如离子通道的开放或关闭和离子浓度的改变酶活性的改变和物质代谢的变化基因表达的改变和对细胞生长、发育、分化和增值的影响等.
I. 【求助/交流】信号通路如何研究
不过信号通路最好还是从蛋白层面进行，分析可能的4条信号通路，做相关蛋白的western blot，检测下游蛋白常见的如磷酸化修饰silicare(站内联系TA)信号通路太复杂了，还是文献吧，当然是 diea了livee(站内联系TA):tiger07:xuec(站内联系TA)多看些英文文献吧，很多有关报道的 看多了你就有思路了 所以还是勤奋点儿吧tongyanna(站内联系TA)我还真不明白啊xp198766(站内联系TA)帮LZ顶，最近我想也知道类似问题的答案，不知道有没有高手会KEGG的，能不能写一点总结出来啊……期待啊……lwiaanngg(站内联系TA)如果你知道大概的途径，可以用上面说的RT-PCR等手段 如果你不知道，你可以使用蛋白microarray/DNA microarray来测定相对变换量sqhnsd(站内联系TA)先做相关的表型观察，看看表型符合那个通路相关的现象，然后做WB、蛋白质相互作用等试验进一步去检测具体的机制如何。但是如何去做，还必须通过看文献才能帮助你解决问题。charlie9(站内联系TA)信号通路的变化，一般与mRNA的变化关系不大。它一般通过关键蛋白分子的修饰有关，因此RT-PCR一般不能说明问题。Western-blots检测被修饰的蛋白分子为好。
J. 简述信号转导通路。
在细胞中，各种信号转导分子相互识别、相互作用，将信号进行转换和传递，构成信号转导通路。当外界环境变化时，单细胞生物可以直接做出反应，多细胞生物则通过复杂的信号传递系统来传递信息，从而调控机体活动。