生物制品质量属性研究方法

❶ 微生物检测手段及注意事项

1. 微生物计量法

1.1 体积测量法

又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液(如10 mL)放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间(如5 min)和转速(如5000 rpm)，离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

1.2称 干重法

可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

1.3 比浊法

微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600 nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.coli的生长及诱导时间。

1.4 菌丝长度测量法

对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。

2. 微生物计数法

2.1 血球计数板法

血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1 mL菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

2.2 染色计数法

为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

2.3 比例计数法

将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

2.4 液体稀释法

对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5 mL试样，接种1 mL到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN(Most Probable Number)得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

2.5 平板菌落计数法

这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9 cm的平板上出现50~500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的'细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。

2.6 试剂纸

在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

2.7 膜过滤法

用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。

3. 间接测定法

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。因此可利用生理指标等间接参数来测定生物量。

3.1 测定含氮量

大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

3.2 测定含碳量

将少量(干重0.2~2.0 mg)生物材料混入1 mL水或无机缓冲液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加热30分钟后冷却。加水稀释至5 mL，在580 nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。

3.3还原糖测定法

还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。

3.4 氨基氮的测定

离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02 mol/L的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02 mol/L的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。

3.5 其他生理物质的测定

P，DNA，RNA，ATP，NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸，产气，产CO2(用标记葡萄糖做基质)，耗氧，黏度，产热等指标，都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。

4. 商业化快速微生物检测法

微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：

4.1 试剂盒，培养基等手段

抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。如：抗干扰微生物培养基，新型生化鉴定管，微生物计数卡，环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。

4.2 借助新型先进仪器

BACTOMETER全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法(Impedance Technology)将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。

微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是Optical Density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物测定的范围，需要紫外分光光度计测最大吸收波长。用得最多的是：505 nm测菌丝菌体、560 nm测酵母、600 nm测细菌。用测OD方法画微生物生长曲线时，同一株菌的起始培养浓度可以准备多管(根据检测点的需要，如需检测10个点，就准备10管)，然后每个点取一管出来测OD值就行了。

一般测菌体密度的OD的波长范围是580 nm-660 nm，如枯草芽孢杆菌用600 nm，已经属于可见光区(200 nm～400 nm为紫外光区，400 nm～800 nm为可见光区)。空白如用水做，需要离心洗涤菌体;空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤，但是不接种的培养基要和接种的同时培养以求条件一致，最后注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在这个区内的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀释后再测，因为OD太大，分光光度计的灵敏度就会显着降低。

一般都测吸光值，而且最好是整个实验过程中，保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，吸光值与稀释倍数不一定成正比，可保证整个实验点有可比性。且取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。

另，用分光光度计测微生物的OD值为什么要把波长设为600 nm

这个波长其实只是针对浊度，而分光光度计在600 nm处对浊度的反应比较灵敏。测吸收峰的实际意义并不大，比如LB摇瓶培养过夜的大肠杆菌，其实在400多纳米处的吸收最大，但那很可能是培养液的吸收峰。

❷ 简述生物制品的安全检定和效力简定

二、 物测定用 物测定系指采用物反映测物物特性目测定物测定用根据具体情况产品规质控采用其种或几种鉴于种测定仅能反映制品某面特性且变异般较更控制产品质量必要需同采用种进行测定 （）、酶反应试验 指体外能促进酶化或本身具备酶性通底物变化检测酶性主要用于酶、辅酶、激酶、激剂、抑制剂等性测定类变异相较结比较准确 （二）、结合试验 基于产品与某种物质结合特性设计试验免疫结合试验目前主要用于物制品鉴别由于结合试验测定定都具物性所般用作制品性（或效力）测定类变异相较 （三）、细胞测定试验 指产品诱导细胞产测定应答细胞增殖、聚集、化、死亡、迁移或产特定化物质等细胞测定试验般能较反映制品物性用于各种物制品性（效力）测定与述两类相比类变异较与使用传代细胞相比使用原代细胞变异更 （四）、物试验 指整体物试验材料检测制品物性（或效力）试验物保护力试验般用于疫苗效力测定由于物实验本高、周期变异所般仅用于品检定于某些治疗用制品由于其作用机理或本身化性质原难建立体外测采用物试验测定由于类变异般相较进步研究应尽能体外代替

❸ 液相专属性试验如何做.生意经求助

（例UV鉴别时，紫外-可见吸收光谱法应规定在指定溶剂中的最大吸收波长，必要时，规定最小吸收波长；或规定几个最大吸收波长处的吸光度比值或特定波长处的吸光度，以提高鉴别的专属性。）6.化学反应鉴别试验应明确反应原理，特别在研究结构相似的系列药物时，应注意与可能存在的结构相似的化合物的区别，并要进行实验验证。光学异构体药物的鉴别应具有专属性。以下摘自CDE的《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》（一）、专属性生物学测定方法的专属性与测定方法及产品组成密切相关，所以应首先从测试原理、测试用材料和供试品组成等方面分析方法的专属性，进而再进行必要的验证。由于生物制品的性质和组成多样，检定方法各不相同，难以提出统一的专属性验证要求。下面以生物技术产品常用的几种检定方法为例，进行具体分析及说明。1、如采用免疫印迹试验进行生物制品的鉴别，应首先对所使用抗体的特异性进行分析；若供试品中还存在其它组分，则应进一步验证被检测物中其它物质能否引起非特异性免疫反应。2、如采用细胞测定方法检测生物活性，应首先说明被测物质与特定的细胞应答之间的相关性，如二者的相关性较好，则一般认为该方法的特异性较好。为表明细胞测定方法的特异性，可进行相关试验进行验证，如加入抗体或特异抑制剂的封闭实验等。如果成品中加入了可能影响活性测定的辅料，应进行相关验证以排除此种影响。3、如采用ELISA法检测重组产品的残余宿主蛋白含量，可采用与表达体系相同的宿主细胞的蛋白作为免疫原制备抗体，若采用与产品相似工艺进行处理后再免疫动物，则所获得抗体的特异性更好。另外，产品中存在的大量目的蛋白可能影响残余宿主蛋白的测定，应进行相关验证以排除此种影响。|||专属性是指在其他组分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在的情况下，分析方法能准确地测出被测组分的特性。分析方法的专属性高，就可以排除这些干扰组分的影响，准确的测定被测组分。具体到液相应该是将样品的保留值与标准品的保留值作比较吧，就应该个药是个药啊。

❹ 生物制品质量控制时常用的生物学检测方法有哪些及其定义

首先看看你的是什么生物制品，生物制品多了
我还是举例说吧
假如生物制品是 食品 检测方法 测菌落（细菌是否合格）
假如生物制品是 氨基酸 检测方法 薄板层析
假如生物制品是 多肽 检测方法 质谱
……………………蛋白质………………HPLC
……………………注射药品…………测菌落+密封测试
……………………抗体………………纯度HPLC＋活性测试。
所以说你要做的生物制品是什么才能知道需要测什么。生物制品是个很大的范围。

❺ 液相专属性试验如何做.生意经求助

（例UV鉴别时，紫外-可见吸收光谱法应规定在指定溶剂中的最大吸收波长，必要时，规定最小吸收波长；或规定几个最大吸收波长处的吸光度比值或特定波长处的吸光度，以提高鉴别的专属性。）6. 化学反应鉴别试验应明确反应原理，特别在研究结构相似的系列药物时，应注意与可能存在的结构相似的化合物的区别，并要进行实验验证。光学异构体药物的鉴别应具有专属性。以下摘自CDE的《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》（一）、专属性生物学测定方法的专属性与测定方法及产品组成密切相关，所以应首先从测试原理、测试用材料和供试品组成等方面分析方法的专属性，进而再进行必要的验证。由于生物制品的性质和组成多样，检定方法各不相同，难以提出统一的专属性验证要求。下面以生物技术产品常用的几种检定方法为例，进行具体分析及说明。1、如采用免疫印迹试验进行生物制品的鉴别，应首先对所使用抗体的特异性进行分析；若供试品中还存在其它组分，则应进一步验证被检测物中其它物质能否引起非特异性免疫反应。2、如采用细胞测定方法检测生物活性，应首先说明被测物质与特定的细胞应答之间的相关性，如二者的相关性较好，则一般认为该方法的特异性较好。为表明细胞测定方法的特异性，可进行相关试验进行验证，如加入抗体或特异抑制剂的封闭实验等。如果成品中加入了可能影响活性测定的辅料，应进行相关验证以排除此种影响。3、如采用ELISA法检测重组产品的残余宿主蛋白含量，可采用与表达体系相同的宿主细胞的蛋白作为免疫原制备抗体，若采用与产品相似工艺进行处理后再免疫动物，则所获得抗体的特异性更好。另外，产品中存在的大量目的蛋白可能影响残余宿主蛋白的测定，应进行相关验证以排除此种影响。|||专属性是指在其他组分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在的情况下，分析方法能准确地测出被测组分的特性。分析方法的专属性高，就可以排除这些干扰组分的影响，准确的测定被测组分。具体到液相应该是将样品的保留值与标准品的保留值作比较吧，就应该个药是个药啊。

❻ 液相专属性试验如何做.生意经求助

（例UV鉴别时，紫外-可见吸收光谱法应规定在指定溶剂中的最大吸收波长，必要时，规定最小吸收波长；或规定几个最大吸收波长处的吸光度比值或特定波长处的吸光度，以提高鉴别的专属性。）6. 化学反应鉴别试验应明确反应原理，特别在研究结构相似的系列药物时，应注意与可能存在的结构相似的化合物的区别，并要进行实验验证。光学异构体药物的鉴别应具有专属性。以下摘自CDE的《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》（一）、专属性生物学测定方法的专属性与测定方法及产品组成密切相关，所以应首先从测试原理、测试用材料和供试品组成等方面分析方法的专属性，进而再进行必要的验证。由于生物制品的性质和组成多样，检定方法各不相同，难以提出统一的专属性验证要求。下面以生物技术产品常用的几种检定方法为例，进行具体分析及说明。1、如采用免疫印迹试验进行生物制品的鉴别，应首先对所使用抗体的特异性进行分析；若供试品中还存在其它组分，则应进一步验证被检测物中其它物质能否引起非特异性免疫反应。2、如采用细胞测定方法检测生物活性，应首先说明被测物质与特定的细胞应答之间的相关性，如二者的相关性较好，则一般认为该方法的特异性较好。为表明细胞测定方法的特异性，可进行相关试验进行验证，如加入抗体或特异抑制剂的封闭实验等。如果成品中加入了可能影响活性测定的辅料，应进行相关验证以排除此种影响。3、如采用ELISA法检测重组产品的残余宿主蛋白含量，可采用与表达体系相同的宿主细胞的蛋白作为免疫原制备抗体，若采用与产品相似工艺进行处理后再免疫动物，则所获得抗体的特异性更好。另外，产品中存在的大量目的蛋白可能影响残余宿主蛋白的测定，应进行相关验证以排除此种影响。|||专属性是指在其他组分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在的情况下，分析方法能准确地测出被测组分的特性。分析方法的专属性高，就可以排除这些干扰组分的影响，准确的测定被测组分。具体到液相应该是将样品的保留值与标准品的保留值作比较吧，就应该个药是个药啊。

❼ 生物制品鉴别实验包括以下哪些方法

二、 生物学测定常用方法
生物学测定系指采用生物学方法，以反映被测物的生物学特性为目的的测定方法。以下为生物学测定常用方法，根据具体情况，在产品的常规质控时可采用其中的一种或几种。鉴于一种测定方法仅能反映制品某一方面的特性，且方法的变异一般较大，为更好控制产品质量，必要时需同时采用多种方法进行测定。
（一）、酶反应试验
是指在体外能促进酶分子的活化或本身具备酶的活性，通过底物的变化检测酶活性。主要用于酶、辅酶、激酶、激活剂、抑制剂等的活性测定。这类方法的变异相对较小，结果比较准确。
（二）、结合试验
是基于产品与某种物质的结合特性而设计的试验，如免疫结合试验。目前主要用于生物制品的鉴别。由于在结合试验中测定的分子不一定都具有生物活性，所以一般不用作制品的活性（或效力）测定。这类方法的变异也相对较小。
（三）、细胞测定试验
是指产品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞增殖、聚集、分化、死亡、迁移或产生特定的化学物质等。细胞测定试验一般能较好地反映制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性（效力）测定。与上述两类方法相比，这类方法的变异较大。与使用传代细胞相比，使用原代细胞的方法变异更大。
（四）、动物试验
是指以整体动物为试验材料检测制品生物学活性（或效力）的试验方法，如动物保护力试验，一般用于疫苗的效力测定。由于动物实验的成本高、周期长和变异大，所以一般仅用于成品检定。对于某些治疗用的制品，由于其作用机理或本身化学性质的原因，难以建立体外测活的方法，也可以采用动物试验方法测定，但由于这类方法的变异一般相对较大，在进一步的研究中应尽可能以体外法代替。

❽ 生物科学的研究方法

生物科学的研究方法为观察描述的方法、比较的方法和实验的方法等。

观察描述的方法在17世纪，近代自然科学发展的早期，生物科学的研究方法同物理学研究方法大不相同。生物科学的研究是考察那些将不同生物区别开来的、往往是不可测量的性质。生物科学用描述的方法来记录这些性质，再用归纳法，将这些不同性质的生物归并成不同的类群。

比较的方法。18世纪下半叶，生物科学不仅积累了大量分类学材料，而且积累了许多形态学、解剖学、生理学的材料。在这种情况下，仅仅作分类研究已经不够了，需要全面地考察物种的各种性状，分析不同物种之间的差异点和共同点，将它们归并成自然的类群。比较的方法便被应用于生物科学。

实验的方法前面提到的观察和描述的方法有时也要对研究对象作某些处理，但这只是为了更好地观察自然发生的现象，而不是要考察这种处理所引起的效应。实验方法则是人为地干预、控制所研究的对象，并通过这种干预和控制所造成的效应来研究对象的某种属性。

(8)生物制品质量属性研究方法扩展阅读：

生物科学的进展有：

20世纪70年代以来，生物科学的新进展，新成就层出不穷。从总体上看，当代生物科学主要朝着微观和宏观两个方面发展：在微观方面，生物学已经从细胞水平进入到分子水平去探索生命的本质；在宏观方面，生态学的发展正在为解决全球性的资源和环境等问题发挥着重要作用。

生物工程方面生物工程（也叫生物技术）是生物科学与工程技术有机结合而兴起的一门综合性的科学技术。也就是说，它是以生物科学为基础，运用先进的科学原理和工程技术手段来加工或改造生物材料，如DNA、蛋白质、染色体、细胞等，从而生产出人类所需要的生物或生物制品。

参考资料来源：网络—生物科学

❾ 生物制品的实验目的和器材

我知道的如下：
二、 生物学测定常用方法 生物学测定系指采用生物学方法，以反映被测物的生物学特性为目的的测定方法。以下为生物学测定常用方法，根据具体情况，在产品的常规质控时可采用其中的一种或几种。鉴于一种测定方法仅能反映制品某一方面的特性，且方法的变异一般较大，为更好控制产品质量，必要时需同时采用多种方法进行测定。 （一）、酶反应试验 是指在体外能促进酶分子的活化或本身具备酶的活性，通过底物的变化检测酶活性。主要用于酶、辅酶、激酶、激活剂、抑制剂等的活性测定。这类方法的变异相对较小，结果比较准确。 （二）、结合试验 是基于产品与某种物质的结合特性而设计的试验，如免疫结合试验。目前主要用于生物制品的鉴别。由于在结合试验中测定的分子不一定都具有生物活性，所以一般不用作制品的活性（或效力）测定。这类方法的变异也相对较小。 （三）、细胞测定试验 是指产品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞增殖、聚集、分化、死亡、迁移或产生特定的化学物质等。细胞测定试验一般能较好地反映制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性（效力）测定。与上述两类方法相比，这类方法的变异较大。与使用传代细胞相比，使用原代细胞的方法变异更大。 （四）、动物试验 是指以整体动物为试验材料检测制品生物学活性（或效力）的试验方法，如动物保护力试验，一般用于疫苗的效力测定。由于动物实验的成本高、周期长和变异大，所以一般仅用于成品检定。对于某些治疗用的制品，由于其作用机理或本身化学性质的原因，难以建立体外测活的方法，也可以采用动物试验方法测定，但由于这类方法的变异一般相对较大，在进一步的研究中应尽可能以体外法代替。
我知道所以你知道！