实时定量pcr技术有几种分析方法

⑴ 实时荧光定量PCR技术原理是什么

聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 .在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 .无论定性还是定量分析,分析的都是 PCR 终产物.但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量.例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量.在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生.所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析.在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加.每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图.

⑵ 如何对某个微生物菌种进行实时定量pcr

Real2time PCR)技术 ,是在 PCR反应体系中加入荧光基团 ,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程 ,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术于 1996年由美国 AppliedBiosystems公司推出 ,通过对 PCR过程的实时监控 ,可专一、 灵敏、 快速、 可重复地精确定量起始模板浓度 ,真正实现了 PCR从定性到定量的飞跃。荧光定量 PCR技术以其独特的优势得到快速发展 ,这项技术已经广泛应用于临床和生命科学研究的各个领域。现就其在临床微生物检测方面作一概述。1 荧光定量 PCR在检测和鉴定中的应用1 . 1 在病毒检测和鉴定中的应用目前 ,荧光定量 PCR已用于多种病毒的检测。Malmstrom等术对 185份不同基因型混合到一起的 B型肝炎病毒样本进行检测 ,能检测到所有的基因型 ,以此证明该方法的高精确度。OkamotoTaqMan技术平台。雷永良等对 172例临床诊断手足口病患者的 324份标本进行人肠道病毒、 柯萨奇病毒 A组 16型和肠道病毒 EV71型核酸特异性的反转录检测 ,同时进行荧光定量 PCR和 EL ISA法平行检测 ,荧光定量 PCR方法的结果与反转录检测一致 ,两者的灵敏度均高于 EL ISA法 ,与传统的 RT2PCR和 EL ISA相比 ,实时荧光定量 PCR检测标本快捷 ,特异性强、 灵敏度高 ,检测手足口病肠道病毒准确高效 ,值得推广。秦萌等定量 RT2PCR 检测方法 ,实现了同时检测新甲型[1]采用四重 TaqMan荧光定量 PCR技[2]建立了风疹病毒的[3 ]设计的一种四重荧光 2011年 第 2期李春娟等 :荧光定量 PCR技术在临床微生物检测中的应用H1N1流感病毒、 人季节性 H1N1流感病毒和人季节性 H3N2流感病毒 ,该方法特异性强 ,灵敏度高 ,最低可检测至 20个拷贝的 RNA。谭耀驹等[4]以人 3型腺病毒感染的细胞和常见的呼吸道消化道感染的病原体为研究对象 ,建立了人 3型腺病毒 TaqMan荧光定量 PCR检测方法 , TCI D50细胞培养液中病毒核酸最低检出稀释度是 1026,且呼吸道和消化道感染常见的病原体未出现交叉反应。白志军登革热病毒 (DV) 1型 5′设计一套特异性引物和 TaqMan探针进行荧光定量PCR快速监测并应用于临床诊断 ,在登革热的早期诊断中有较高的敏感性、 特异性和重复性 ,可作为DV1的快速诊断方法。其他病毒如 A /C/E型肝炎病毒 DNA[2]、 EB 病毒[13 ]等荧光定量方法均有报道和建立。WHO 于2009年 4月 28日起草了 CDC protocol of Real2timeRT2PCR for influenza A (H1N1) ,详细介绍了 TaqMan技术进行猪流感病毒检测和分型的操作规程1 . 2 在细菌检测和鉴定中的应用近年来 ,由于传统方法鉴别细菌的种种不足 ,Real2time PCR 技术已应用于多种细菌的检测。Chandran等了检测结合分枝杆菌的方法 ,与传统的涂片染色法和培养法相比 , 其灵敏度为 97. 2% , 特异性达100% ,均高于两种传统方法。Tatavarthy等沙门氏菌的 ompF基因进行 Real2time PCR技术检测 ,此方法能检测沙门氏菌属的所有种型 ,特异性为100%。

⑶ 实时定量pcr原理

实时定量pcr原理通常指实时荧光定量PCR原理，即：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每次循环扩增产物量的变化，通过循环阈值和标准曲线的分析对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

⑷ 目前的定量pcr方法基本上可归为哪几种

1、外参法+终产物分析。外参法是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。
2、内参法+终产物分析。谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。
3、外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。
4、内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竟争性抑制。
5、外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。上述是定量pcr方法的五种类型。

⑸ 实时定量PCR的结果是怎样分析的

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算。

2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。

3、举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。

4、首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。

5、几点注意：必须确定扩增的特异性，只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同），2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2，最好不用Syber Green。

(5)实时定量pcr技术有几种分析方法扩展阅读：

PCR原理：

1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

2、PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

参考资料来源：网络--PCR反应

⑹ 实时荧光定量PCR的结果该怎样分析

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；

2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算；

3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；

5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。

(6)实时定量pcr技术有几种分析方法扩展阅读：

PVR的循环参数：

1、预变性；

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，加热时间参考试剂说明书。

2、变性步骤；

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3、引物退火；

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4、引物延伸；

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5、循环数；

大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸；

在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

⑺ 实时荧光定量PCR——RT-QPCR

目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法

SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA 双螺旋 小沟区域的具有绿色 激发波长 的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

一、实验前准备：

实验试剂及耗材：

试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA

试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master

1号管包含：

热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2

仪器及耗材：

罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等

正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】

二、反转录

实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。

按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。

(1)配制NTC对照：（总13ul）

水——10ul

oligo dT引物 ——1ul

随机六聚体引物——2ul

混匀

（2）配制1、2、3、4号管：（总13ul）

总RNA（s1、s2、s3、s4）——1ul

oligo dT引物——1ul

随机六聚体引物——2ul

水——9ul

混匀

【Note：可将总RNA的模板量适当调整至10ng—5ug，mRNA调整至1—100ng。若RNA样品浓度较低，则可加入10ug/ml的MS2 RNA 来稳定模板RNA】

（3）将配好的反应mix在PCR仪中65℃变性10min，可有效减少RNA的二级结构。加热后，迅速置于冰上制冷，放置5min

（4）在反应Templateprimer mix中分别加入以下试剂：

配制总mix（除了RNA模板和引物）

5X反转录酶buffer——24ul（4ulX6管）

dNTP mix ——12ul（2ulX6管）

40U/ul RNase抑制剂——3ul（0.5ulX6管）

20U/ul反转录酶——3ul（0.5ulX6管）

mix总体积——42ul（7ulX6管）

若样品数量多，先配制反应mix再分装到各个反应管，小心吹打混匀，切勿涡旋震荡。混匀后于微型离心机上离心，使样品和离心管落至管底。

将离心管放置PCR仪中，根据使用的引物和目标RNA的长度进行程序设置：

25℃ 10min

55℃ 30min

85℃ 5min

最后置于冰上停止反应。

此反应产物可于2℃—8℃存放1—2h，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更长时间。cDNA产物无需进行纯化即可用于后续的PCR反应。20ul的PCR反应体系可取2—5ulcDNA反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有RNase H 活性，可以在cDNA合成之后去除RNA模板，减少其对后续PCR的影响

SYBR Green 反应体系的配制：

使用LightCycler 480 SYBR Green I Master使用进行基础的绝对定量分析。

实验设计：5个标准样品（包含1个空白对照）

                    5个反转录样品（包含1个NTC对照【Negative Template Control缩写】）

由于样本数较多，如下配置：

不含模板的总体系（594ul）—分装为10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每个样分装为3个复管（每管20ul）

按照体系配方配制：

2x Master mix （绿色盖）——330ul（10ulX33）

10x Primer mix  —— 66ul（2ulX33）

PCR级别水（无色盖）——198ul（6ulX33 ）

总体积 ——594ul

用移液枪轻柔吹打混匀，然后分装为10管，每管55ul。

标准对照组:在各个管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的cDNA，空白对照加入6ul水代替模板，其余加入6ul已经逐级稀释好的标量模板。

反转录样品组:分别加入6ul浓度调整好的模板DNA，包含NTC。

混匀后将每个样按照20ul/孔分装至96孔板中，用封口膜盖好96孔板。将多孔板置于合适的离心机中室温1500g配平离心2min，然后将准备好的96孔板放入罗氏LightCycler 480中

PCR程序设置与运行：

（1）双击打开LightCycler 480 Software release1.5.0SP4中登录，自动进入软件界面。

（2）点击New Experiment

（3）设置反应体积（对于96孔板，反应体积为10ul—100ul）此次设置20ul

（4）在Program中输入反应名称preincubation，预备性设置一个循环，无需进行荧光收集

（5）点击增加按钮，输入amplification，定义扩增循环的次数为445次，选择荧光的收集功能Quantification

（6）设定PCR扩增循环的温度与时间为95℃10s

（7）点击增加按钮，设定退火温度为60℃10s

【6.7两步 Analysis Mode默认None】

（8）设置延伸温度和时间为72℃20s Acquisition Mode选择Single

（9）设置溶解曲线，在program新的一行中输入Melting curve，Acquisition Mode选择Melting Curves 95℃ 5s，新增设置温度，再点击增加按钮，65℃ 1min 以上两步Acquisition Mode默认选择None

（10）点击增加按钮，95℃ Acquisition Mode选择Continuous ，其他设置无需改动

（11）设置保温的过程cooling，1个循环，无需荧光，40℃ 1min

（12）设置完成后，点击右方保存按钮，保存设置的程序

（13）点击start run，开始运行PCR反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。

样品编辑

（1）实验结束，点击Sample editor，进入样本编辑程序

（2）在select Workflow中选择ABs Quant进行绝对定量，根据样本在板中的排布方式进行样本编辑，设置阴性对照、空白对照、标准品等，在SELECT Sample中选择样品孔

（3）在Sample Name中输入被选择样品名称

（4）最后点击make replicates设置复孔

（5）标准品设置时，需填写拷贝数、稀释倍数、初始浓度即可

（6）编辑好样品后，可进行数据分析，如有需要，也可进行组间分析

结果分析

（1）点击左下方的SUM，将显示出所有信息，包括设置的反应程序、实验结果分析等。

（2）点击Analysis，可对已有的数据进行细致的分析

（3）点击Abs Quant/2nd DerivativeMax，弹出Create new analysis窗口

（4）在Subset中选择分析样品的区域即可出现分析图，相应样品的扩增曲线

（5）Standard Curve是根据标准品得出的标准曲线，左侧有扩增效率、斜率、截距、线性关系以及错误率 （一般error值越小，说明实验准确率越高，扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好）

（6）在数据表格，可显示样本的Cp值，以及相应的样本浓度值，按复孔进行数据统计，显示Cp平均值、方差，浓度的平均值以及方差

⑻ 实时荧光定量 PCR

    实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。

    SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料， 可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 在 游离状态 下，SYBR Green I 发出 微弱的荧光 ，但 一旦与双链 DNA 结合 ， 嵌入至 dsDNA， 荧光大大增强 。

    因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算和分析。

实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。

试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。

使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。

配套 LightCycler® 480 使用的试剂盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。

所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler® 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。

接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反应体系的配置； PCR 程序设置； 运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。

首先是反转录合成 cDNA 第一链：

实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。

按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。 先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl，混匀。 然后进行样品一号管的体系配置， 依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 随机六聚体引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总 RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg，mRNA调整至 1-100ng。

若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。

将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂： 2 号管的 5×反转录酶 buffer， 4 号管 dNTP mix， 3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂， 1 号管 20 U/μl 的反转录酶，最终体积为 20μl。

若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。 混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为： 25℃， 10min， 55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶， 再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。

cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。 20μl 的 PCR 反应体系可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，减少其对后续 PCR 的影响。

本部分实验，我们选用罗氏的 SYBR Green I Master 试剂盒进行基础的绝对定量分析。

本实验共设置 5 个标准样品，包含 1 个标记为 0 的空白对照， 5 个反转录样品，包含 NTC 对照，由于样品数较多，先配制不含模版的总体系，再分装为10管，加入各个样品的模板后，再将每个样品分装为 3 个复孔。

按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 级别水。 总体系配好后，在用移液枪轻柔吸打均匀，然后分装为 10 管，每管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标样模板。 反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA， 包含 NTC。混匀，然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板，将多孔板置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在LightCycler® 480 设备中。

双击打开 LightCycler® 480 的 1.5 软件并登陆，自动进入软件界面，点击 new experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检测通道的设定,接下来设置反应体积，对于 96 模块，反应体系为 10μl-100μl 之间，本实验是设定 20μl 的反应体系。

在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation，预变性设定 1 个循环，无需进行荧光的收集，执行的温度和时间设定为 95℃ 10min，视图会根据设定进行实时的调整。

点击增加按钮，输入 Amplification，定义扩增循环的次数为 45 次，并选择荧光的收集功能 Quantification，然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10s，点击增加按钮，设定退火温度和时间为 60℃ 10s，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None，继续点击增加按钮，设置延伸温度和时间为 72℃ 20s，Acquisition Mode 选择 Single， Ramp Rate 均按自动调整值，无需再设置。

设置溶解曲线，在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves， 1 个循环数， Analysis Mode 选择 Melting Curves，时间和温度设置为 95℃ 5s， 点击增加按钮，新增设置温度和时间为 65℃ 1min，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None。点击增加按钮，新增设置温度为 95℃，Acquisition Mode 选择 Continuous,其他设置无需改动。

设置保温的过程 Cooling，只需 1 个循环，无需收集荧光，设定温度和时间为 40℃、 1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR的循环体系、温度的设置已经设定完毕。

点击 Start run 开始运行 PCR 反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。

实验结束，点击 Sample Editor，进入样本编辑区。

Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。

在 Select Sample 中，选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name 输入被选择样品组的名称，并在 Sample Type 中选择样品组的类型，最后点击 Make Replicates 设置复孔。标准品设置时，需填写拷贝数，只需填写好稀释倍数，初始浓度即可。 编辑好样品后，即可进行数据分析。如有需要，也可进行子集编辑。

样品编辑好后，可进行实验结果分析。

点击左边栏下方的 sum 按钮，相应出现实验的所有信息，包括：设计的反应程序，实验结果分析等。

点击 analysis，可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。

点击 Abs Quant second derivative max，弹出 create new analysis 窗口，在 Subset 选项中选择分析样品的分布区域，点击确定，即可出现分析图：相应样品的扩增曲线。

Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线，曲线左侧标有扩增效率、斜率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error”值越小，说明实验的准确率越高。

扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好。

在数据表格，可显示单个样本的 Cp 值，以及相应的样本浓度值。

按复孔进行数据统计，显示 Cp 平均值，方差，浓度的平均值以及方差。