色谱分析方法及仪器校准的讨论

A. 高效液相色谱仪的使用和原理分析

高效液相色谱仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一，其应用越来越广泛。此种仪器在使用过程中，难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因，即可清楚预防和排除这些故障的方法，就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。今天我们要从以下几个方面和您分享下在使用高效液相色谱仪中需注意的几个问题。

一、使用试管的问题

1、试管的洁净问题。

高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的试管，便会影响试验结果的准确性。例如，在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的，因此，在每次进样时，都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实，此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用玻璃试管后，干扰峰消除。

2、塑料试管的溶解问题。

近年来，一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便，但是，在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象，在利用此种试管提取样品时，有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象，这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。这时，可用相同的实验条件先行试验一下，看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否产生干扰信号，如确有干扰信号存在，就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。

3、被测样品在试管壁上的吸附问题。

这个问题也应引起注意，否则也会影响测试结果的准确性，在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被测药物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，为防止提取中吸附现象的发生，可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂，可有效地防止吸附。

二、操作进样阀的问题

目前，在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样操作非常方便，但是，如果使用不当，也会带来问题。例如，在高效液相色谱法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题，这主要是由于操作方法不当所引起，要想解决此类问题，需从以下几个方面入手。

1、进样量的控制。

用进样阀来进样时，阀内的样品环是定量的，(一般分析型进样阀的样品环体积为20ul)，由于进样时，注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)。因此，要想使样品环中充满样品溶液，从而使用进样阀来准确地定量，则必须使进样量大于样品环体积的2倍。如果用注射器来控制进样量，则最大只能注射样品环体积1/2的量，这样才能防止部分样品由溢流管溢出从而导致定量分析的误差。

2、进样阀的清洁问题。

如果样品环中有上次进样时样品的残留，必然会污染下次注射进的样品，为防止这种现象的发生，应按下列步骤操作：a.进样阀有2个位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时，以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次，每次用量大约40ul；b.然后将进样阀板手扳至INJECT位置时，再以流动相清洗几次，每次用量还是40ul；c.最后，再将样品注射到进样阀里。

按照上述的步骤操作，可以避免由进样阀引起的污染，从而使干扰峰消除并提高分析结果的准确性。

3、进样阀溢流管的堵塞。

有时，进样阀的溢流管会发生堵塞现象，向进样阀内注射样品时，注射针推不动。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解样品的流动相用的是盐溶液，而其中的盐在溢流管的排空端口处结晶所致。此时，可用小烧杯盛少量蒸馏水对溢流管口稍加浸泡，端口处盐的结晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次进样完成之后，用蒸馏水反复冲洗至溢流管中的盐分全部冲出，则可避免此故障的发生。

三、流动相(MOBLLE PHASE)的问题

甲醇和乙腈在高效液相色谱分析法中常常被用来配制流动相。高效液相色谱法中常用的试剂最好是高等级的专用试剂，如色谱纯试剂。在要求不太严格时，优级纯甚至分析纯的试剂也能用。高效液相色谱分析法中常用的是紫外检测器，因此，从降低基线噪音和提高分析灵敏度上来考虑，应该使用紫外吸收小且杂质含量少的色谱纯试剂。

1、流动相的过滤。

配制好的流动相在使用前一定要先用0.5um孔径的微孔滤膜来过滤。这是因为溶液中含有很多肉眼难以发现的微小颗粒，如果不把它们滤除掉，就会堵塞泵口、柱头上的过滤器，这样就堵塞了流动相的正常通道，使色谱柱的阻力增加，柱压升高，柱效下降。碰到这种情况时，要换用经过滤的流动相，并将堵塞的滤器拆下来浸泡在20%的硝酸水溶液中以超声波清洗机清洗20分钟，以除去滤片上的堵塞物。

2、流动相的脱气。

流动相在使用前必须脱气，以尽可能的除去溶解在流动相中的气体，否则，这些气体会使柱填料的性能降低，还能够对检测器的信号产生很大的干扰。脱气有多种方法，如超声脱气、真空脱气、氮气脱气等。真空脱气法和氮气流脱气法是目前最常用的脱气法。水和甲醇混合后会产生大量的气泡，如果不脱气就使用，气泡就会进入色谱柱和检测器，并将影响分析工作的正常进行。

四、色谱柱的使用和保养

色谱柱是高效液相色谱仪最主要的部件，被测物质能否被很好的分离和测定，色谱柱的性能起着决定性的作用。因此，在日常工作中，应特别注意色谱柱的正确使用和维修保养，以延长色谱柱的使用寿命。

1、使用预柱和保护柱。

预柱(pre-column)安装于泵和进样器之间，它给色谱柱中的流动相提供了完全的平衡，并防止了对柱填料有破坏作用的组分或污染物进入色谱柱。保护柱(guard column)可以阻挡能够牢固地吸附于色谱柱上的组分进入色谱柱，保护柱应与色谱柱的填料相同。预柱和保护柱可以经常更换，而不需要经常更换色谱柱，这就延长了色谱柱的使用寿命。

2、防止气体进入色谱柱。

有些色谱柱(如凝胶柱)是不允许气泡进入的，否则将会使柱效降低甚至形成微小的难以驱除的气室。因此，为了防止气泡进入色谱柱，一定要使用经过脱气的流动相，并且要严格按照下列步骤来安装色谱柱。a.拆卸下色谱柱入口处的密封螺丝，观察是否有溶剂渗出；b.如有溶剂渗出，即可将色谱柱接到管路上，以避免气泡的进入；c.如无溶剂渗出时，表明色谱柱的此端已经进去空气了，此时，可将色谱柱的出口端接到进样阀上，以流动相来反方向冲洗色谱柱，以便将柱内的空气排除。最好以0.2ml/min的小流量来冲色谱柱，如果溶剂的流速太快或者是压力突然的上升都将会导致柱性能的降低；d.如果流出的溶剂里不含有气泡，说明柱内的气体已经被排出了，再将色谱柱以正确的方向接好，这样气泡就进不到色谱柱里面了。

3、色谱柱的清洗。

为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中，在每次的样品分析工作完成之后，都应及时地清洗色谱柱。首先要用对被测样品洗脱能力强的溶剂来洗脱色谱柱，以分析工作中常用的反相色谱分析法为例，因其先流出的物质是极性大的物质，此时应用100%的甲醇或使用异丙纯、四氢呋喃等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性小的物质洗脱下来，洗脱液的用量一般为柱体积的20倍即可。如果流动相是缓冲溶液，则应先用蒸馏水来冲洗色谱柱，以冲掉柱内的盐，然后再用合适的溶剂来冲洗。

凝胶滤过色谱法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝胶柱常用缓冲溶液做流动相，用完之后当然要用蒸馏水来冲洗。如果是连续操作，可以将缓冲溶液置于柱内过夜，但最好是维持小流速(＜0.5ml/min)以防止缓冲盐的析出，如果流动相中含有卤化物，即使是停一夜，也必须要用蒸馏水将色谱柱冲洗干净，以防止它们对柱体的腐蚀。

4、色谱柱的存放。

如果色谱柱暂时不用，存放时要注意以下几点：

a.几天之内的短期放置，应先用溶剂冲洗好色谱柱(如凝胶柱则用蒸馏水来冲洗)，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。

b.如果色谱柱长期不用，仅用上述方法来处理就不行了，这时应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱则可用正已烷或庚烷，而凝胶柱则不能用水了，因柱内如果有微生物的生长则会使柱效降低，此时应用0.05%的NaNs水溶液(防腐剂)来冲洗色谱柱，再将色谱柱封严。色谱柱长期放置时，一定要将色谱柱的两端封严，以防止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象，因这可导致柱效的严重降低。

c.色谱柱应贮存在室温下，如果放置于0℃以下的环境里，柱内就会结冰，这也将导致柱效的降低。

高效液相色谱仪的构造高效液相色谱仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、分离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。制备型仪器还需配有馏份收集系统。为了取得较好的分析结果，HPLC仪器对于准确度、精确度、灵敏度及结果重现性有较高的要求。

高效液相色谱仪的工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

(1)色谱分析方法及仪器校准的讨论扩展阅读：

高效液相色谱仪的构造高效液相色谱仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、分离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。制备型仪器还需配有馏份收集系统。为了取得较好的分析结果，HPLC仪器对于准确度、精确度、灵敏度及结果重现性有较高的要求。

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高压输液系统

高压输液系统包括：溶剂储液瓶、溶剂脱气装置、高压输送泵以及梯度洗脱装置。其中，高压输液泵是高效液相色谱仪的主要部件之一，输送压力达150—350×105Pa。输液系统要为HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，流量的精度和长期的重复性要好，同时还要提供精度好、准确度高、重现性好的多元溶剂梯度。因此，输液泵的好坏直接影响着整个系统的质量和分析结果的可靠性。

进样系统：进样能在试样引入色谱柱，有六个接口：1,4之间接定量环；2接高压泵；3接色谱柱；5,6接废液管。

色谱分离系统：色谱柱通常为不锈钢柱，内装各种填充剂。常用的填料为硅胶，可用于正相色谱;化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相或正相色谱。其中、最常用的是十八烷基键合硅胶，即ODS柱，可用于反相色谱或离子对色谱。

检测系统：检测系统用于连续检测色谱柱流出的物质，进行定性定量分析。要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。近年来各国都在研究开发新的检测技术，进一步扩大了HPLC的应用。

根据检测需要的不同检测器可分为紫外检测器(UVD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、红外检测器(IRD)、核磁共振检测器(NMRD)、质谱检测器(MSD)、蒸发光散射检测器(ELSD)、小角度激光散射检测器(LALLSPD)。

数据处理系统：高效液相色谱的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，还可使用微处理机和色谱数据工作站来记录和处理色谱分析的数据。

B. 仪器分析的色谱分析

色谱分析法是基于色谱现象而发展起来的一种分析方法。1906年，俄国植物学家茨维特认识到所谓色谱现象和分离方法有密切联系，而且对分离有重大意义。他用这种方法分离了植物色素，并系统地研究了上百种吸附剂，奠定了色谱分析法的基础。20世纪30年代，具有离子交换性能的合成树脂问世，解决了一系列疑难问题，提高了色谱分离技术。由于单纯的分离意义不大，20世纪50年代，人们开始将分离方法和各种检测系统联接起来，分离分析同时进行，于是人们设计和制造了大型色谱分析仪。除了上述的方法以外，现代仪器分析法还有磁共振法、射线分析法、电子能谱法、质谱法等等。

C. 关于气相色谱使用注意事项

为保证气相色谱仪能够正常运行，确保分析数据的准确性、及时性，需要对气相色谱仪进行定期维护。

1、气源检查检：查发生器或者气体钢瓶是否处于正常状态；检查脱水过滤器、活性炭以及脱氧过滤器，定期更换其中的填料。

2、管线泄漏：检查定期检查管线是否泄漏，可使用肥皂沫滴到接口处检查。

3、气化室的维护：气化室包括：进样室螺帽、隔垫吹扫出口、载气入口、分流气出口、进样衬管。不同的部件有不同的维护方式：

1）进样室螺帽、隔垫吹扫出口、载气入口及分流气出口4个部件需按厂家要求定期清洗：把这几个部件从气化室上拆卸下来，放在盛有丙酮溶液的烧杯中浸泡并超声2小时，晾干后使用；若有损坏应及时更换。

2）进样衬管必须定期进行清洗，先用洗液清洗，然后用丙酮溶液浸泡，再用电吹风吹干备用，及时添加石英棉。

4、若有损坏应及时更换。

5、检测器的维护：检测器的收集器、检测器接收塔、火焰喷嘴、检测器基部、色谱柱螺帽等处，须用丙酮溶液清洗，一般超声2小时，至清洗干净，清洗后用电吹风吹干备用。

6、柱温箱的维护：柱温箱的外壳、容积区间，可用脱脂棉蘸乙醇擦洗。

(3)色谱分析方法及仪器校准的讨论扩展阅读：

一、使用方法

气相色谱仪的一般分析流程：载气由高压钢瓶中流出，经减压阀降到所需压力后，通过净化干燥管使载气净化，再经稳压阀和转子流量计后，以稳定的压力、恒定的速度流经气化室与气化的样品混合，将样品气体代入色谱柱中进行分离。

分离后的各组分随着载气先后流入检测器，然后载气放空。检测器将物质的浓度或质量的变化转变为一定的电信号，经放大后在记录仪上记录下来，就得到色谱流出曲线。根据色谱流出曲线上得到的每个峰的保留时间，可以进行定性分析，根据峰面积或峰高的大小，可以进行定量分析

二、应用领域

气相色谱法是以气体为流动相的色谱分析方法，主要用于分离分析易挥发的物质。气相色谱法已成为极为重要的分离分析方法之一，在医药卫生、石油化工、环境监测、生物化学等领域得到广泛的应用。

通常采用的检测器有：热导检测器，火焰离子化检测器，氦离子化检测器，超声波检测器，光离子化检测器，电子捕获检测器，火焰光度检测器，电化学检测器，质谱检测器等。

D. 气相色谱分析法中,进样量是否需要非常准确为什么

得根据方法来定。如果是外标法测，自然得非常准确，内标法或者是面积归一化法，则不一定要那么准确了，当然能准确是最好了。因为进样量会影响最后的峰高，如果没法控制的话，会有很大的误差。

1、内标法：选择适当的物质作为内标物质，定量加入被测样品中，跟据被测组分和内标物质的峰面积之比，乘以校正因子，对映内标物质加入量所进行含量测定方法。

内标法的优点：色谱条件对结果影响不大，准确度、精度较高。

缺点：选择合适的内标物质比教困难。

2、外标法：又称标准曲线法，依照测量标准品所绘制的曲线来计量被测样品的含量的方法。

外标法的优点：简单，适和大量样品分析。

缺点：每次色谱条件很难相同，容易出现误差。

(4)色谱分析方法及仪器校准的讨论扩展阅读：

气相色谱分析法具体如下：

1、在石油化学工业中，采用气相色谱法来分析原料和产品，进行质量控制；

2、在电力部门中，用来检查变压器等的潜伏性故障；在环境保护工作中，用来监测空气和水的质量；

3、在农业上，用来监测农作物中残留的农药；

4、在商业部门，检验及鉴定食品质量的好坏；

5、在医学上可用来研究人体新陈代谢、生理机能，在临床上用于鉴别药物中毒或疾病类型；

6、在宇宙舱中可用来自动监测飞船密封仓内的气体。

E. 有哪些常用的色谱定量方法试比较它们的优缺点和使用范围

1、面积归一化法优点是简便、准确，当操作条件变化时对结果影响较小，宜于分析多组分试样中各组分的含量。但是试样中所有组分必须全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。 2、外标法是用纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液（或直接购买不同浓度标准溶液）分别取一定体积，注入色谱仪，根据峰面积和浓度做标准曲线。在分析未知样时按与标准曲线相同的操作条件和方法，由标准曲线查出所需组分的浓度（现在在工作站上直接就能求出浓度）。此法要求进样准确，操作条件稳定，分析样品和标准曲线条件必须一致。 3、内标法是试样中所有组分不能全部出峰或只要求测定试样中某个或某几个组分时，可采用此法。内标法是在准确称取一定量的试样中，加入一定的标准物质（内标物），根据内标物和试样的质量以及色谱图上的相应峰面积，计算待测组分的含量。内标法的关键是选择合适的内标物，内标物应是试样中不存在的纯物质，物质与被测物质相近，能溶于样品中，但不能于样品发生反应。此法比较费事，一般不使用于快速分析。

F. 气相色谱法怎样分析2.6

不同型号的和不同配备的仪器校正是有差别的，下面的这个是安捷伦仪器用的供你参考：

气相色谱仪校正规程

1. 目的

2. 为了保证分析数据的准确、可靠，必须对仪器进行校准，特制定此校正规程。

3. 2.范围

4. 本规程适用于以热导池(TCD)、火焰离子化（FID）为检测器的气相色谱仪的校准。

5. 3.管理职责

6. 3.1本规程由质检部分析工程师组织实施。

7. 3.2由质检主管负责监督检查。

8. 4.校正项目和技术要求

9. 4.4热导池(TCD) 检测器

10. 4.2基线噪声≤0.1mV ；基线漂移(30min)≤0.2 mV

11. 4.3TCD灵敏度STCD≥800Mv0ml/mg

12. 4.4火焰离子化（FID）检测器

13. 4.5FID检测限≤5×10-10g/s

14. 4.6FID基线噪声≤1×10-12A；基线漂移（30min）≤1×10-11A

15. 4.7仪器的定量重复性 RSD≤3%

16. 5.校正条件

17. 5.110μl微量进样器

18. 5.2色谱级的标准物质

19. 5.3苯-甲苯溶液

20. 5.4正十六烷-异辛烷溶液

21. 6.校正方法

22. 6.1热导池(TCD) 为检测器

23. 6.1.1校正条件

24. 6.1.1.1色谱柱：TDX-01（或性能相似的载体） 内径2-3mm,长1-2m的不锈钢柱

25. 6.1.1.2载气：氦气(纯度不低于99.99%),流速30-60ml/min

26. 6.1.1.3温度：柱箱70℃左右,检测室100℃,汽化室120℃

27. 6.1.1.4桥流或热丝温度：选择最佳值

28. 6.1.2TCD基线噪声和基线漂移测定

29. 6.1.2.1按6.1.1条件,将衰减置于最灵敏档,用零位调节器调节,使输出信号在记录器或积分仪的中间位置,加桥电流待基线稳定后,记录基线半小时,测量并计算基线噪声和基线漂移。

30. 6.1.2.2Agilent7890色谱仪的基线噪声和漂移使用工作站直接计算并打印出来。在OFFLINE中依次点击Report→System Suitability→Edit Noise Ranges,再输入计算基线噪声和漂移的时间范围,查看报告时选择Performance报告形式。

31. 6.1.2.3可接受标准：基线噪声≤0.1mV 基线漂移（30min）≤0.2mV

32. 6.1.3TCD灵敏度AFC测定

33. 6.1.3.1在6.1.1条件下，待基线稳定后，注入2μl浓度为5mg/ml的苯-甲苯溶液，连续进样6次，记录苯峰面积。

STCD：TCD灵敏度（Mv。ml/mg）； A：苯峰面积算术平均值； W——苯进样量（mg）；

Fc——校正后的载气流速（ml/min）

6.1.3.2可接受标准： STCD≥800mv.ml/mg

6.2火焰离子化（FID）检测器

6.2.1校正条件

6.2.1.1色谱柱用DB-5型或HP-5型，内径为0.25～0.32mm，膜厚为0.25～0.32μm，长为30～50m

6.2.1.2载气：氦气（纯度≥99.99%），流速1—2ml/min；氢气（纯度≥99.99%），流速50ml/min；空气，不得含有影响仪器正常工作的灰尘、水分及腐蚀性物质，流速450ml/min

6.2.1.3分流为1：50

6.2.1.4温度：柱箱150℃左右，检测室300℃，气化室260℃

6.2.1.5量程：选择最佳值

6.2.1.6液体标准物质：浓度为100ng/μl正十六烷-异辛烷溶液

6.2.2FID基线噪声和基线漂移校正测定

6.2.2.1按6.2.1的校正条件,点火并待基线稳定后,记录半小时,测定并计算基线噪声和基线漂移

6.2.2.2Agilent6890色谱仪的基线噪声和漂移计算同6.1.2

6.2.2.3可接受标准：基线噪声≤1×10-12A 基线漂移（30min）≤1×10-11A

6.2.3FID检测限测定

6.2.3.1在5.2.1的校正条件下,使仪器处于最佳运行状态.待基线稳定后,用微量器注入2μl浓度为100ng/μl的正十六烷-异辛烷溶液,连续进样6次,计算正十六烷峰面积的算术平均值.根据以下公式计算检测限:

6.2.3.2DFID=2NW/A

DFID：FID检测限( g/s)； N：基线噪声（A）； W：正十六烷的进样量（g）

正十六烷的峰面积(A.S)

6.2.3.3可接受标准：检测限≤5×10-10g/s

6.3定量重复性测定

6.3.1定量重复性以所用检测器条件、将所测组份峰面积以相对标准差RSD表示.

6.3.2按下公式计算相对标准偏差:

n 1

RSD = [∑（Ai- A ）2]/（n-1） × ×100%

I=1 A

RSD：相对标准偏差（%）； n：测量次数； Ai：第i次测量的峰面积

A ：n次进样的峰面积算术平均值； I：进样序号； 可接受标准：RSD≤3%

7.性能确认

7.1使用标准品或供试品，确认仪器性能符合使用要求；

7.2先进行色谱柱的性能确认，内容包括：分离度，对称因子，理论塔板数和峰面积标准偏差。

7.3气相色谱柱的确认

7.3.1测试标准样：己二醇、对氯苯酚、壬酸甲酯、4-丙基苯胺、正十三烷、十一烷醇、十五烷的250ppm CH2Cl2溶液。

7.3.2仪器条件：气化室温度为260℃，检测器温度为320℃，恒流速为1.0ml/min,柱恒温为130℃，进样量为：1ul,运行15min.，分流1：50。

7.3.3色谱柱：HP-1 30m×0.25mm×0.25um ；HP-5 30m×0.32mm×0.25um；TDX-01内径2-3mm,长1-2m的不锈钢柱。

7.3.4评价标准：连续进行5次分析, 分离度R＞1.5；十五烷对称因子S在0.80~1.50范围内；十五烷柱效＞3000m-1；十五烷峰面积的标准偏差≤3.0%。

7.4按照性能确认方法逐步进行，并记录谱图；根据性能测试的结果，评价仪器是否符合性能要求。

8.校正结果处理和校正周期

8.1校正结果全部项目均符合技术要求者，可继续使用。若出现某些项目达不到规格要求，关于仪器情况，仪器负责人以维修报告的形式报于QC经理，由QC经理批准维修方案。

8.2 校正周期为1年 。

9.形成的记录

G. 如何建立气相色谱分析方法

色谱分析常用的定量方法：归一化法、内标法和内加（增量）内标法、外标法。
1、面积归一化法优点是简便、准确，当操作条件变化时对结果影响较小，宜于分析多组分试样中各组分的含量。但是试样中所有组分必须全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。
2、外标法是用纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液（或直接购买不同浓度标准溶液）分别取一定体积，注入色谱仪，根据峰面积和浓度做标准曲线。在分析未知样时按与标准曲线相同的操作条件和方法，由标准曲线查出所需组分的浓度（现在在工作站上直接就能求出浓度）。此法要求进样准确，操作条件稳定，分析样品和标准曲线条件必须一致。
3、内标法是试样中所有组分不能全部出峰或只要求测定试样中某个或某几个组分时，可采用此法。内标法是在准确称取一定量的试样中，加入一定的标准物质（内标物），根据内标物和试样的质量以及色谱图上的相应峰面积，计算待测组分的含量。内标法的关键是选择合适的内标物，内标物应是试样中不存在的纯物质，物质与被测物质相近，能溶于样品中，但不能于样品发生反应。此法比较费事，一般不使用于快速分析。

H. 色谱如何分析

色谱分析是指按物质在固定相与流动相间分配系数的差别而进行分离、分析的方法。其按流动相的分子聚集状态可分为液相色谱、气相色谱及超临界流体色谱法等。按分离原理可分为吸附、分配、空间排斥、离子交换、亲合及手性色谱法等诸多类别。按操作原理可分为柱色谱法及平板色谱法等。色谱法已成为应用最广、药典收载最多的一类分析方法。色谱分析有两个要素——流动相和固定相。在流动相从固定相的一端流到另一端的过程中，加在固定相起始端的溶质随流动相流动，并在流动相和固定相之间来回转移。不同的溶质与这两相的亲和力大小不同，溶质的移动速度也不同，因而得到分离。固定相一般是固体，也可以是固体上附着液体；流动相是液体或气体。
色谱分析具有很多优点：分离效果好，设备简单，操作方便，条件较温和，方法多样，能适应不同的需要。其缺点主要是：处理量小，周期长，不能连续操作；有的层析介质价格昂贵，有时找不到合适的介质。
色谱分析（层析）有各种类型。按照固定相使用的形式，可分为柱层析、纸层析、薄层层析。按照溶质的展开方式，可分为前沿层析、置换层析、洗脱层析。按照流动相的物理状态，可分为气相层析与液相层析，以及超临界流体层析等。按照分离机理，可分为分配层析、吸附层析、离子交换层析、排阻层析、疏水层析、离子对层析、亲和层析、键合相层析。按照固定相和流动相的相对极性，可分为正相层析与反相层析。
在层操作时，单组分洗脱剂对多组分样品的洗脱效果常常不够满意。不是先洗出的组分混杂在一起，就是后洗出的组分出峰时间长，峰宽增加。为了改善分辨率、改变峰形或缩短层析时间，有时需要在层析过程中改变流动相的组成(pH、离子强度)。分阶段改变流动相的组成，流动相的组成呈阶梯状变化，称为阶段洗脱。逐渐改变流动相的组成，流动相的组成呈曲线或直线状变化，称为梯度洗脱。流动相形成梯度可用梯度洗脱仪。高效液相层析仪中常用几个泵分别输送不同的溶剂，控制各个泵的流量，就能控制洗脱剂的组成。
改善层析分离效果的方法有：改变流动相的组成或pH，改变固定相，改变温度等。在液相层析中以改变流动相的组成最重要。其余要注意的条件有：柱要细而长；分离介质填充要紧密、均匀，颗粒细密、大小分布均匀；操作温度保持恒定；样品用量少；流速慢而恒定。[

I. 气相色谱仪如何校准

不同型号的和不同配备的仪器校正是有差别的，下面的这个是安捷伦仪器用的供你参考：
气相色谱仪校正规程
1.目的
为了保证分析数据的准确、可靠，必须对仪器进行校准，特制定此校正规程。
2.范围
本规程适用于以热导池(TCD)、火焰离子化（FID）为检测器的气相色谱仪的校准。
3.管理职责
3.1本规程由质检部分析工程师组织实施。
3.2由质检主管负责监督检查。
4.校正项目和技术要求
4.4热导池(TCD) 检测器
4.2基线噪声≤0.1mV ；基线漂移(30min)≤0.2 mV
4.3TCD灵敏度STCD≥800Mv0ml/mg
4.4火焰离子化（FID）检测器
4.5FID检测限≤5×10-10g/s
4.6FID基线噪声≤1×10-12A；基线漂移（30min）≤1×10-11A
4.7仪器的定量重复性 RSD≤3%
5.校正条件
5.110μl微量进样器
5.2色谱级的标准物质
5.3苯-甲苯溶液
5.4正十六烷-异辛烷溶液
6.校正方法
6.1热导池(TCD) 为检测器
6.1.1校正条件
6.1.1.1色谱柱：TDX-01（或性能相似的载体） 内径2-3mm,长1-2m的不锈钢柱
6.1.1.2载气：氦气(纯度不低于99.99%),流速30-60ml/min
6.1.1.3温度：柱箱70℃左右,检测室100℃,汽化室120℃
6.1.1.4桥流或热丝温度：选择最佳值
6.1.2TCD基线噪声和基线漂移测定
6.1.2.1按6.1.1条件,将衰减置于最灵敏档,用零位调节器调节,使输出信号在记录器或积分仪的中间位置,加桥电流待基线稳定后,记录基线半小时,测量并计算基线噪声和基线漂移。
6.1.2.2Agilent7890色谱仪的基线噪声和漂移使用工作站软件直接计算并打印出来。在OFFLINE中依次点击Report→System Suitability→Edit Noise Ranges,再输入计算基线噪声和漂移的时间范围,查看报告时选择Performance报告形式。
6.1.2.3可接受标准：基线噪声≤0.1mV 基线漂移（30min）≤0.2mV
6.1.3TCD灵敏度AFC测定
6.1.3.1在6.1.1条件下，待基线稳定后，注入2μl浓度为5mg/ml的苯-甲苯溶液，连续进样6次，记录苯峰面积。

STCD：TCD灵敏度（Mv。ml/mg）； A：苯峰面积算术平均值； W——苯进样量（mg）；
Fc——校正后的载气流速（ml/min）
6.1.3.2可接受标准： STCD≥800mv.ml/mg
6.2火焰离子化（FID）检测器
6.2.1校正条件
6.2.1.1色谱柱用DB-5型或HP-5型，内径为0.25～0.32mm，膜厚为0.25～0.32μm，长为30～50m
6.2.1.2载气：氦气（纯度≥99.99%），流速1—2ml/min；氢气（纯度≥99.99%），流速50ml/min；空气，不得含有影响仪器正常工作的灰尘、水分及腐蚀性物质，流速450ml/min
6.2.1.3分流为1：50
6.2.1.4温度：柱箱150℃左右，检测室300℃，气化室260℃
6.2.1.5量程：选择最佳值
6.2.1.6液体标准物质：浓度为100ng/μl正十六烷-异辛烷溶液
6.2.2FID基线噪声和基线漂移校正测定
6.2.2.1按6.2.1的校正条件,点火并待基线稳定后,记录半小时,测定并计算基线噪声和基线漂移
6.2.2.2Agilent6890色谱仪的基线噪声和漂移计算同6.1.2
6.2.2.3可接受标准：基线噪声≤1×10-12A 基线漂移（30min）≤1×10-11A
6.2.3FID检测限测定
6.2.3.1在5.2.1的校正条件下,使仪器处于最佳运行状态.待基线稳定后,用微量注射器注入2μl浓度为100ng/μl的正十六烷-异辛烷溶液,连续进样6次,计算正十六烷峰面积的算术平均值.根据以下公式计算检测限:
6.2.3.2DFID=2NW/A
DFID：FID检测限( g/s)； N：基线噪声（A）； W：正十六烷的进样量（g）
正十六烷的峰面积(A.S)
6.2.3.3可接受标准：检测限≤5×10-10g/s
6.3定量重复性测定
6.3.1定量重复性以所用检测器条件、将所测组份峰面积以相对标准差RSD表示.
6.3.2按下公式计算相对标准偏差:

n 1
RSD = [∑（Ai- A ）2]/（n-1） × ×100%
I=1 A

RSD：相对标准偏差（%）； n：测量次数； Ai：第i次测量的峰面积
A ：n次进样的峰面积算术平均值； I：进样序号； 可接受标准：RSD≤3%
7.性能确认
7.1使用标准品或供试品，确认仪器性能符合使用要求；
7.2先进行色谱柱的性能确认，内容包括：分离度，对称因子，理论塔板数和峰面积标准偏差。
7.3气相色谱柱的确认
7.3.1测试标准样：己二醇、对氯苯酚、壬酸甲酯、4-丙基苯胺、正十三烷、十一烷醇、十五烷的250ppm CH2Cl2溶液。
7.3.2仪器条件：气化室温度为260℃，检测器温度为320℃，恒流速为1.0ml/min,柱恒温为130℃，进样量为：1ul,运行15min.，分流1：50。
7.3.3色谱柱：HP-1 30m×0.25mm×0.25um ；HP-5 30m×0.32mm×0.25um；TDX-01内径2-3mm,长1-2m的不锈钢柱。
7.3.4评价标准：连续进行5次分析, 分离度R＞1.5；十五烷对称因子S在0.80~1.50范围内；十五烷柱效＞3000m-1；十五烷峰面积的标准偏差≤3.0%。
7.4按照性能确认方法逐步进行，并记录谱图；根据性能测试的结果，评价仪器是否符合性能要求。
8.校正结果处理和校正周期
8.1校正结果全部项目均符合技术要求者，可继续使用。若出现某些项目达不到规格要求，关于仪器情况，仪器负责人以维修报告的形式报于QC经理，由QC经理批准维修方案。
8.2 校正周期为1年 。
9.形成的记录

J. 高效液相色谱的原理及分析方法

原理主要有这几种：
液—液分配色谱法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于高效液相色谱计算公式： 高效液相色谱计算公式
式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。 a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。
液—固色谱法
流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。 当吸附竞争反应达平衡时： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]
离子交换色谱法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流 离子交换色谱柱
动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下： X-(溶剂中) (树脂-R4N Cl-)=== (树脂-R4N X-) Cl- (溶剂中) 当交换达平衡时： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系数为： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [讨论：DX与保留值的关系] 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
离子对色谱法
(Ion Pair Chromatography) 离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原 离子色谱仪流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有机相 式中：X 水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X Y---形成的离子对化合物。 当达平衡时： KXY = [X Y-]有机相/[ X ]水相[Y-]水相 根据定义，分配系数为： DX= [X Y-]有机相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [讨论：DX与保留值的关系] 离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。
离子色谱法
(Ion Chromatography) 用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。 以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）： 担体图示
抑制柱上发生的反应： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H Br-，可用电导法灵敏的检测。 离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。
空间排阻色谱法
(Steric Exclusion Chromatography) 空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。
分析方法：
综述
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定.常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料,用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时,所用流动相应符合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进化学键合固定相反应
样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变, 以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2.系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子.
色谱柱的理论板数
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图化学键合固定相应用
，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t(R)和半高峰宽W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
分离度
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： 2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。
拖尾因子
为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子(T)是否符合各品种项下的规定,或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为： W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)为0.05峰高处的峰宽； d1为峰极大至峰前沿之间的距离。 除另有规定外，T应在0.95～1.05间。 也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80％、100％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别注样3次,计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0％。