猪瘟检疫方法的研究进展

A. 如何预防猪瘟

猪瘟目前还没有特效治疗方法，必须采取以免疫注射为主的综合性防制措施。

（1）预防接种：有条件的地区和养猪小区、猪场可采用猪瘟免疫监测手段，根据猪瘟抗体水平消长规律进行适时免疫。免疫效价监测方法，可采用猪瘟间接血凝试验或酶联免疫吸附试验。如果没有条件进行抗体监测，根据本地区有无散发猪瘟发生，可采取两种免疫程序：A.有散发仔猪猪瘟的地区、场要用乳前免疫方法，仔猪在吃初乳前进行猪瘟疫苗免疫，每头小猪注射1头份。B.在猪瘟防治工作较好、无散发仔猪猪瘟地区、场，可在20日龄、60日龄分别免疫一次猪瘟疫苗。留种用的后备猪，6月龄再注射一次。种猪群每年两次注射猪瘟疫苗。在免疫接种过程中，疫苗剂量要足，针头长短合适，不打飞针，确保免疫效果。

（2）检疫净化：定期对繁殖猪群采血监测，将带有猪瘟强毒抗体的猪和多次免疫抑制的猪查出淘汰，净化猪群，消除猪瘟发生的隐患。

（3）加强疫苗管理：做到从主渠道购进疫苗。疫苗现稀释现用，注射时要做到疫苗不离冰桶，桶不离冰，保证疫苗有效，严禁使用过期疫苗和失真空疫苗。

（4）加强免疫时用的针头、针管及注射部位的消毒，减少人为疫病传播。

（5）紧急接种：发病地区、场要采取紧急接种，并适当加大疫苗剂量（可加大1～3倍）减少发病和控制疫情扩大蔓延。

（6）加强病死猪处理：对可疑病猪予以隔离。死猪及污染物必须无害化处理，严禁出售和食用。

（7）加强场内外环境消毒：每一个月或半个月全场环境大消毒一次；每周至少1次猪舍带猪消毒一次；饲养用具每2～3天消毒一次；场门口、各栋舍门口的消毒池要经常更换药液，保持消毒药液有效。

（8）加强管理，提高猪只的个体抗病能力。提供最佳生活条件，冬季御寒，夏季防暑，舍内空气新鲜。

（9）坚持自繁自养，严禁外购商品猪，引种时要从无疫情地区引进，引进后必须隔离检疫观察1个月以上，猪瘟强毒抗体阴性，猪瘟疫苗免疫后方可进场。

B. 我国首次出现“非洲猪瘟"，面对猪瘟该如何防控

参考一下这篇文章

怕的非洲猪瘟来了，该如何防控

农业农村部新闻办公室8月3日发布，辽宁省沈阳市沈北新区发生一起生猪非洲猪瘟疫情，这是我国首次发生非洲猪瘟疫情（ASFV）。疫情发生后，农业农村部根据《非洲猪瘟疫情应急预案》启动Ⅱ级应急响应。当地按照要求，启动应急响应机制，采取封锁、扑杀、无害化处理、消毒等处置措施，禁止所有生猪及易感动物和产品运入或流出封锁区，沈阳市已暂停全市范围的生猪向外调运。目前，该起疫情已得到有效控制。

中国农业科学院兰州兽医研究所早在十年前就针对我国非洲猪瘟的防控和应急储备，OIE非洲猪瘟参考实验室建立了良好的合作关系，并在农业农村部韩长赋部长的见证下与波兰国家兽医所共建实验室，引进相关诊断技术和材料，并于2011年申请并得到农业部兽医局的许可，进行非洲猪瘟诊断技术的研究及诊断试剂盒的研发（农医药便函[2011]596号）。

六、防治方法

加强进口种猪和猪产品的检疫，坚决做好国际机场及港口的废物、垃圾的销毁处理工作。一旦有可疑非洲猪瘟发生，要采取果断的扑杀措施，严格封锁，彻底消毒。病毒对环境的抵抗力较强，在23℃经120天仍存活。在热带，猪圈内的病毒至少可存活2周。有效消毒剂的种类较少。目前，最有效的消毒剂是10%的笨及苯酚。OIE推荐使用的其他消毒剂包括0.8%的氢氧化钠、0.3％福尔马林和2.3%的次氯酸盐等。生猪养殖者要严禁从疫区调运生猪，注意做好日常消毒工作，尽可能封闭饲养生猪，采取隔离防护措施，尽量避免与野猪、钝缘软蜱接触，严禁使用未经高温处理的餐馆、食堂的泔水或餐余垃圾饲喂生猪。一旦出现不明原因死亡异常增多且有猪瘟类似症状的，应及时上报当地兽医部门。

C. 非洲猪瘟的检测方法有哪些非洲猪瘟疫情防控方法是什么

荧光定量 PCR 方法，该方法是将光谱技术引入到PCR 反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，解决了常规 PCR 方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。

等温扩增法，该方法是一种新兴的分子生物学检测方法，等温扩增方法不需要 PCR 中的变性、退火步骤，即可完成对靶序列的循环扩增，大幅缩短了时间，整个扩增反应时间一般少于 60 min，而常规PCR 方法的反应时间一般需要 2 h 以上。等温扩增试剂盒适合现场检测，灵敏度高，能够大幅提高猪瘟防控的可行性。

要减少场外人员和车辆进入猪场，要对人员和车辆入场前彻底消毒，要对猪群实施全进全出饲养管理，要对新引进生猪实施隔离，要按规定申报检疫。

非洲猪瘟防控注意事项

养殖场应该坚持全进全出，自繁自育的养殖模式，构建完善的封锁隔离措施，避免猪和野猪直接接触。养殖场在生猪调运过程中，尽量不要跨省引进种猪，必须引种时，一定要进行严格的产地检疫、疫情检测，严格执行落地报告制度和隔离观察制度。

殖场内部如果发现非洲猪瘟可疑疫情，严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》进行处置，迅速采取应急措施，预防疫情传播和蔓延。

D. 猪瘟病毒的简介

猪瘟病毒（Hogcholera virus, Swine fever virus)
猪瘟病毒是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。病毒粒子呈圆形，大小为38～44nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。猪瘟病毒在细胞质内复制,不能凝集红血球，与牛腹泻病毒有相关抗原。该病毒对乙醚敏感，对温度、紫外线、化学消毒剂等抵抗力较强。
猪瘟病毒能在猪胚或乳猪脾、肾、骨髓、淋巴结、白血球、结缔组织或者肺组织的细胞中培养，但在这些细胞上不产生明显病变。可利用鸡新城疫病毒强化试验（END试验)测定猪瘟病毒，作为诊断猪瘟的一种方法。
猪瘟发现
猪瘟于1833年首先发现于美国的俄亥俄州。1885年，Salmon和Smith等对猪瘟和沙门氏菌病及猪丹毒作了鉴别诊断。1903年，DeSchweinitz和Dorset两氏证明猪瘟的病原体是病毒。匈牙利的Hutyra Koves于1908年制成猪瘟高免血清，说明那时欧洲已存在猪瘟。日本于1909年第一次发现并开始研究猪瘟（Sasahara，1970）。中国何时发现和证明猪瘟存在，没有明确的文字记载。约于1925年，东南大学农科开始研制免疫血清防制猪瘟。

E. 猪瘟最好的防治方法有哪些

答：目前，对于该病还没有有效的治疗方法，主要靠平时的预防。具体措施有：①定期预防注射，每年春、秋两季，除对成年猪普遍进行一次猪瘟兔化弱毒疫苗注射外，对断奶仔猪及新购进的猪都要及时防疫注射。将猪瘟兔化弱毒疫苗按瓶签说明加生理盐水稀释，大、小猪一律肌内注射1毫升，注射后4天即可产生免疫力。②猪瘟常发疫区，仔猪出生后25～30日龄注射一次，55～60日龄仔猪断奶后再注射一次，保护率可达100%。③给怀孕母猪注射疫苗，能增强母子抵抗猪瘟病毒的能力。一般于母猪分娩前一个半月进行一次预防注射。④紧急免疫接种，在已发生疫情的猪群中，做紧急预防注射，能起到控制疫情和防止疫情蔓延的作用，注射时可先从周围无病区和无病猪舍的猪开始，后注射同群猪，病猪一般不注射。为加强免疫力，注射时可适当增加剂量。⑤加强饲养管理，定期进行猪圈消毒，提高猪群整体抗病力，杜绝从疫区购猪。新购入的猪应隔离观察30天，证实无病，并注射猪瘟疫苗后方可混群。⑥在猪瘟流行期间，饲养用具每隔3～5天消毒一次。病猪消毒后，彻底消除粪便、污物，铲除表土，垫上新土，猪粪应堆积发酵。

F. 非洲猪瘟疫苗将扩大试验范围，他们是否能战胜猪瘟

当去年非洲猪瘟病毒在中国出现时，大量的猪死于该病毒，所以造成了猪的短缺，引发猪的价格上涨，养殖户也因此而损失惨重。

中国农业科学院表示，将根据农业和农村事务部的工作部署，继续加快疫苗试验和研究的生产，进一步扩大黑龙江等地的临床试验范围，并努力尽快完成相关试验，并按照法律程序输入安全证书声明和疫苗注册程序。

G. 中国科学家成功解析猪瘟病毒，我们是不是可以放心吃猪肉了

近期非洲猪瘟在世界蔓延引发宽泛关注。中国科学家团队通过用时近1年合作研究攻关，即日已分离出中国国内正在发作的非洲猪瘟病毒盛行株，并胜利分析非洲猪瘟病毒颗粒精细三维布局，为开发效果佳、安全性高的新型非洲猪瘟疫苗奠定了巩固底子。

作为全世界非常大的猪肉生产和花费国，生猪产业在我国人民经济开展和人民群众生活中具有不行替代的重要作用，但是这些病毒疫苗短时间内还是不可以投入使用的，还需要时间去彻底解决他。

H. 猪瘟的治疗

简介
在欧洲称为古典猪瘟{classical swine fever．CSF），是由猪瘟病毒（HCV或CSFV)引起的一种高度接触性传染病，猪是该病毒唯一的自然宿主。于1833年首次发现于美国俄亥俄州，百余年来其流行遍及全球。国际兽疫局将其定为A类传染病，中国《动物防疫法》将其列为一类传染病．是目前危害中国养猪业发展的主要疫病之一。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防治猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来出现免疫效果不理想．应用组织培养弱毒苗也发生免疫失败，究其原因比较多。由于猪瘟造成的经济损失巨大．历来是各国研究的热点。
csFV基因结构与功能的研究
CSFV为有囊膜病毒，40--60 nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约1 2 3 kb，仅含有一个大的开放性阅读框架（ORF）．此ORF翻译成含3898个氨基酸残基．分子量约438 kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白．cSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码。ORF两侧是5’一端非翻译区（5’-UTR）和3’一端非翻译区（3’-UTR）．且5’一端无帽子结构．3’一端无poly(A）尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下．加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80），除c、E0、E1和E2为结构蛋白外．其余均为非结构蛋白。
目前已经定位的CSFV蛋白有5种，即 Npro、c、Erns(E0）、E1和E2．它们均由CSFV的 RNA-ORF5’一端所编码。在结构蛋白中，最具有免疫防制研究价值的是EO和E2。
1.1 c，是病毒的衣壳蛋白，也称p14，由病毒ORF中的Setl 69～Al a267组成．是 CSFV核衣壳蛋白其N端由CSFV非结构蛋白p23的水解作用产生，c端可能是由宿主细胞的信号肽酶作用所致。
1．2 gp44/48，是病毒的一种囊膜糖蛋白．也称Erns．旧称E0。有9个可能的糖基化位点，去糖基的蛋白骨架分子量约26KDa，由病毒ORF中Glu168-Ala494组成。在感染细胞中gp44/48在内质网内积累，并可存在于细胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中gp44/48以97KDa的同源二聚体形式存在于囊膜表面。由于其分子内缺乏疏水的膜锚定区，与病毒囊膜结合力弱．易从囊膜上游离下来。gp44/48可诱导产生猪瘟的中和抗体．免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。由于编码 gp44/48的核酸序列在属内比编码gp55的序列保守程度高，因此E rns可作为防治猪瘟的一种靶蛋白。
Erns具有RNase活性，作用于单链的 RNA．且对富含u的序列活性最高。4ng的 Ems在体外即可将CSFV基因组RNA完全降解。推测Ems没有将其自身RNA降解掉的原因可能是由于空间上的隔离。在宿主细胞中，新合成的E rns在内质网腔内．而其基因组RNA则在胞浆中：在病毒粒子中，定位于囊膜的Ems与其基因组RNA间隔着衣壳蛋白．因此E rns是不会降解其自身RNA的。编码Ems的基因是瘟病毒属病毒所特有的．黄病毒科中其他病毒基因组内无此基因．推测该基因是病毒与宿主细胞的RNase基因重组得到的。
1.3 gp33，是CSFV囊膜糖蛋白．也称E1，去糖基的蛋白骨架分子量21．8KDa．由1 95个氨基酸残基（ORF编码的Leu495至GlY68。组成，内有3个可能的糖基化位点。其蛋白骨架中有两段疏水序列（Leu548～ Pro579～Gly689）。在多聚蛋白转位过程中，前一段是E1向内质网腔转位的终止信号，后一段则充当E2转位的信号肽，除此之外，这二段疏水区还充当E1的膜锚定位点。E1在病毒囊膜内．不能诱导猪产生抗体。
1.4 gp55．为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为E2，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低．最易变异的分子。gp55常以100kDa的同源二聚体及与gp33形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。在体外gp55可诱导产生病毒的中和抗体，体内可诱导产生抗CSFV的攻击的抗体。Hulst用20μg昆曳细胞表达的E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗1 00LD50 CSFV Brescia毒株强毒的攻击。gp55的蛋白骨架由370个氨基酸（ORF编码的690-1060氨基酸残基）组成．并以其c端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同。E2的分子量可为51-58kDa。E2分子内的1 5个Cys残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，c端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。
gp55的抗原决定区在其N端部分（ORF编码的第690-866氨基酸），可分为2个独立的抗原结构单元，四个抗原结构域A．B．C，D。其中结构域A又可分为A．， A2，A3三个亚域。结构域B．c属于一个结构单元．均为中和抗体的结合位点．由 ORF编码的690～800氨基酸残基参与构成。Cys693与CYS7377形成的二硫键对结构域 B、c的空间结构至关重要。另一个结构单元含A．D抗原结构域。A1、A2亚区定位于第795-851氨基酸残基，在种内保守A1是一个抗体的中和位点。亚区A3定位于766-813氨基酸残基．而氨基酸残基766-800则参与了结构域D的构成。cys792～ Cys856及Cys818～Cys828间的二硫键对这个结构单元空问结构的形成是必需的。连接这两个结构单元的是一段属内保守的疏水序列．推测这段序列参与了病毒侵入细胞过程中的膜融合过程。
1.5 Npro，也称p23，CSFV的非结构蛋白，是ORF编码的多聚蛋白N端的第一个蛋白质。Npro由168个氨基酸组成．具有蛋白质水解酶活性，能以自催化的方式从正在翻译的多聚蛋白上断裂下来，成为成熟的病毒蛋白。序列比较发现，编码p2 3的基因在瘟病毒属中是较为保守的。它的断裂位点在Cysl 68与其下游的病毒核衣壳p1 4 N端第一个氨基酸ser。间。Npro的 cys69和His130可能位于其酶活性中心．能水解断裂Cys与Ala及Gly与Ser间的肽键，断列位点位于活性His残基下游38个氨基酸残基处。Npro不参与CSFV的结构及非结构蛋白的加工过程．其蛋白酶活性在 c S F V增殖过程中的作用还不清楚。Rumenapf等人使用定点突变技术对参与 Npro催化活性的氨基酸残基进行测定．确定了其中的GIu22、His49和Cys69是保持Npro蛋白酶活性所必需的氨基酸残基，而 His130并非必须。
实验窒诊断
目前猪瘟流行常常表现无规律的地区性散发．发病特征不典型，以发热、精神沉郁、食欲减退、咳嗽、共济失调、结膜炎以及腹泻、围产期死亡、死胎、流产。中等毒力及强毒感染有以上这些症状，并且在猪群中不分年龄快速传播。结合这些临床症状进行实验室诊断是必要的。
2.1 病毒抗原的检测猪瘟病毒抗原的快速检测对于猪瘟的诊断具有特别重要的意义。目前快速、敏感的检测方法是利用免疫组化技术检测扁桃体组织。扁桃体中猪瘟病毒抗原可早在感染后2d检测到．淋巴结、脾脏以及胰腺均可作为病毒早期检测的组织样品。Delas Mulas等及Narita等报道了一种检测猪瘟病毒抗原的免疫组化方法．即利用针对E2糖蛋白的单克隆抗体检测福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品的免疫组化方法。该方法的优点是能检测长期保存的样品，缺点是较费时．而且福尔马林固定后的组织不能再进行病毒分离。利用链酶一生物素一过氧化物酶（ABc）的免疫组化方法也能用于猪瘟病毒组织切片上抗原的检测。据报道流式细胞仪也可进行血样中猪瘟病毒的检测，但其敏感性较低。以猪瘟强毒感染仔猪，利用抗原捕获ELISA方法检测其病毒血症，结果表明该方法可用于猪群中流行病学的调查。但其敏感性以及特异性均低于传统的实验室方法。
2.2 感染性病毒的检测病毒分离是目前体外检测感染性猪瘟病毒最特异的方法。已报道有几种方法可以从组织、全血中分离病毒，白细胞是分离病毒的最佳样品。然而一些研究人员发现，白细胞以及单核细胞在动物感染后较长时间才能感染病毒。因此，对于猪瘟的早期诊断．全血或血浆可能比白细胞更为敏感。最常用于猪瘟病毒分离的细胞为猪肾细胞（PKl 5或SK6）或猪睾丸细胞（sT）。日本建立了一种猪肾由来的传代细胞系（FS-L3）．FS-L3细胞在不感染病毒的情况下呈大园球状．数倍至数十倍于普通细胞．但一旦感染了猪瘟病毒，FS-L3细胞的大园球状即消失．这一特性已被用作猪瘟病毒的中和试验等各种生物学特性的测定。经研究发现，产生细胞病变的毒株是因为它的遗传基因发生了变化。从5’末端的第一个核苷酸到4764个核苷酸均已缺失．其中包括5’末端的非编码区、自身蛋白分解酶、衣壳蛋白、糖蛋白（E0、 E1、E2）、非结构蛋白NS-1、和NS-2的基因均已缺失。
2.3 猪瘟病毒基因组检测 已报道利用RT-PCR方法检测猪瘟病毒RNA有数种程序。瘟病毒属特异的引物多选自基因组的5’端保守区．其最突出的优点是其产物能用来直接测序，直接进行病毒株的分型。一般来说套式RT-PCR方法是检测猪瘟病毒更敏感的方法，但其缺点是比较费时．不适用于大量样品的检测。McGoldrick等报道了一种检测猪瘟病毒的单管荧光RT-PCR方法。此方法可检测出仔猪血样中感染了中等毒力或高等毒力的猪瘟病毒，其敏感性高于病毒分离方法．并且简化了试验程序．减少了污染的风险．还可进行大量样品的检测。
2.4 抗体检测最常用的检测猪瘟病毒抗体的方法多以病毒中和试验为基础。目前已建立数个特异的检测血清抗体的E LlSA方法．包括检测针对粗蛋白、特异结构蛋白如E2、E rns以及非结构蛋白NS3抗体的方法。目前使用最广泛的是CSFV E2 ELISA，其敏感性与VNT相比为90%～99%．特异性为99%。Leforban等建立了一种ELISA方法，能够区分BVDV、BDV以及 CSFV抗体。这个方法对于BVDV/BDV高流行地区（如荷兰)csF的检测非常有意义。ELISA特异性与敏感性的提高是目前面临的最大的挑战。
当前，猪瘟仍是世界养猪业的一大威胁．1 997-1 999年期间在德国、荷兰、西班牙和意大利等国都曾多次暴发了猪瘟，在中国CSFV的持续性感染和疫苗保护效力下降的现象也比较普遍，这不仅给养猪业造成了严重的经济损失，而且也给猪瘟防治政策的制定带来了一定的困难。不过，相信随着CSFV分子生物学和检测方法研究的进一步深入，这些问题都会得到最终解决。