重庆肠道微生物测序分析方法

㈠ 肠道微生物基因组测序需要多少钱

肠道微生物基因组测序需要多少钱
全基因组测序，就是检测出全部30亿个碱基对是怎么排列的，从第一个到第30亿个，一个都不落下。它是检测人类所有基因组信息，不针对任何单个疾病或者因素的基因，但又囊括了之前所有单个基因检测要用到的信息。要根据基因组的大小决定的。而且选择测序的仪器也有区别。您如果自己购买仪器测序价格自然又有不同了。比如测一个5M的基因组，基本上用第二代测序仪器一个run即可完成，大概需要15万RMB（含税价格）。

㈡ 微生物群落高通量测序小白来取经求助

在人体肠道中生活着数以万亿的共生菌群，它们的种类繁多，可达上千种，数量也很惊人，是人体细胞总量的10倍以上，迄今为止，仍有80%以上的微生物不为人知。这些肠道微生物和人体存在着互利共生的关系，对于维持人类的健康发挥着重要的作用。它们在肠道中保持着一种动态的平衡，能够合成维生素、帮助人体从食物中吸收营养、维持肠道免疫系统功能、抵挡有害微生物的侵害，但是当这种平衡因某些因素被打破致使肠道菌群发生紊乱时，人体就可能患上诸如肥胖症、糖尿病、肠炎甚至癌症等疾病。为了加深对人类疾病发生原因、药物作用机理的理解，继人类基因组计划之后，科学家们又启动了人类元基因组计划，这使肠道菌群的研究迎来了一个新的浪潮。
在以往的肠道微生物群落多样性研究中，人们主要采用DGGE等分子生物学方法及生物芯片对肠道菌群进行研究，但是这些方法都存在一定的缺陷。如DGGE只能检测到环境样品中十几种优势菌，但是对痕量微生物却束手无策；电泳条带中包含不只一种16S rDNA序列，要获悉具体的菌种信息，还需进行克隆、测序，实验操作繁琐；此外，采用这种方法不能反映微生物的丰度情况。而生物芯片通过固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息，“只能验证已知，却无法探索未知”，通过信号强弱判断微生物的丰度也不是非常的准确。新一代高通量测序技术自2005年问世以来，以其数字化信号、高数据通量、高测序深度、高准确率等特点，已被广泛的应用于肠道菌群的研究中，发表的论文达60多篇，其中不乏发表于Nature、PNAS、Genome Res、Gut、Gastroenterology等国际顶尖杂志上的文章。Roche 454测序平台由于读长较长，达300～500bp，能跨越16S rDNA序列一个或几个可变区，是微生物多样性研究的最佳平台，使用该平台发表的关于肠道菌群的论文达50多篇。美吉生物拥有Roche 454测序平台，在肠道微生物群落多样性研究方面积累了大量的成功案例。
美吉生物研究人员通过大量相关文献的阅读，发现高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用主要聚焦于以下几个方面：① 饮食、能量摄取、肥胖与肠道菌群之间的关系；② 肠道菌群与疾病发生之间的关联；③ 抗生素治疗对肠道菌群的影响；④ 不同个体肠道微生物群落结构及其受其他外界因素（压力、致病菌感染、手术）的影响等。

㈢ 检测肠道微生物，样本量怎么确定

检测肠道微生物，样本量怎么确定
病原微生物种类繁多，变异迅速，快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展前进着。目前，应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因芯片、多聚酶链反应等，该文对这些检测技术进展做一综述。 对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物，又称病原体，有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊粒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强，往往造成世界性大流行，因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐，检测周期长，而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原学诊断已不再局限于病原体水平，深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室 J。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等检测方法，自动化程度高，快速省时、无污染、结果精确，可以准确灵敏地鉴定病原微生物。1 传统的病原微生物的检测方法传统的病原微生物学实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主，将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法。1．1 直接涂片镜检病原微生物体形体积微小，大多无色半透明状，将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速，对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用，例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接涂片镜检不需要特殊的仪器和设备，在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。1．2 分离培养与生化反应 分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间，检测周期较长，不能同时处理批量样本。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，传统鉴定方法也在逐步改进，大大加快了检验速度。例如Microscan WalLCAway全自动微生物分析仪，可同时做细菌鉴定和药敏试验，检验500多个菌种。苛养菌如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等对营养要求比较高，常规培养阳性率低。雍刚 等将不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生长因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌剂加入到巧克力培养基中制成了新型淋病奈瑟菌培养基，大大提高了淋病奈瑟菌的分离培养率。苏盛通等在营养琼脂中加人了中药红枣、赤小豆培养甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌等细菌，生长指数明显高于血平板。1．3 组织细胞培养 活组织细胞培养适于专营活组织细胞内生存的病原体，包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的，将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养，再将病原体接种于相应的组织细胞中后，病原体可在其中繁殖增长，引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内，引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。2 血清学与免疫学检测血清学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术，简化了鉴定步骤，常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性，不仅可检测样本中病原体抗原，也可检测机体的抗体成分。幽门螺奸菌在我国人群感染率高达50％ ～80％ ，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测唾液中抗HP抗体来诊断HP感染，其结果满意。乙型肝炎病毒(HBV)在我国人群中感染率极高，ELISA应用于乙型肝炎病人早期血清学诊断的效果最为明显。临床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来发展起来的在微生物检测领域中一种新技术。其基本原理是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上，通过抗原抗体反应形成磁珠一目标病原体复合物或磁珠一一抗一目标病原体复合物，在外部磁场磁力的作用下，将目标病原体分离出来。目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠，如大肠埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等，广泛应用到各级科研和实验室 。经IMBS分离出的白色念珠菌可直接在显微镜下检测，检测时间缩短至4 h。IM—Bs还可以和其它检测技术联合来检测病原菌，免疫磁珠分离得到的目标菌可继续用于分离培养使大肠埃希菌0157最低检测限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS结合聚合酶链反应(IMBS—PCR)可对培养条件比较特殊的细菌如苛养菌、厌氧菌进行快速检测，肉类中的产毒素型产气荚膜梭菌经IMBS．PCR检测

㈣ 大肠杆菌检测方法国标是用什么方法检测的

大肠杆菌检测方法分为三种：

1、细菌分离鉴定法

分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液先经肉汤增菌，然后转种血琼脂平板。其他标本同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。

37℃孵育18～24小时后，观察菌落涂片染色镜检。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要的时候检定肠霉毒素。

2、卫生细菌学检查法

大肠杆菌会不断随粪便排出体外，污染周围环境水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，则表示样品被粪便污染的越严重，表明样品中存在肠道致病菌的可能性也就越大。

大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。中国卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群，瓶装汽水和果汁中每100ml大肠菌群不能超过5个。

3、全自动微生物定量分析仪（TEMPO）检测法

全自动微生物定量分析（TEMPO）仪大肠杆菌群计数检测有TEMPOTC和TEMPOCC两种方法。

TEMPOTC的开发是为获得NF ISO4832标准相当性能水平。

TEMPOCC法是TEMPO仪器上根据BAM方法专门用于24h计数食品中大肠杆菌群方法。

(4)重庆肠道微生物测序分析方法扩展阅读：

大肠杆菌在生物技术中的应用

这些菌株由于失去了细胞壁等重要组分，所以在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。

生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆实验。

真核基因在大肠杆菌中表达，必须有合适的表达载体(Vector),常用载体：pBV220,pET系统。

目的基因在大肠杆菌中表达的情况：

大肠杆菌更适合原核基因的表达，外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的，外源基因拷贝数和表达 产物产量之间存在动态平衡，单个细胞的产量又与外源基因拷贝数，基因表达效率，表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。

㈤ 大肠杆菌的检测方法

多管发酵法。

多管发酵法是一种检测水体中大肠杆菌的传统方法，这种方法是在44.5℃的含有荧光底物的培养基上连续培养24h，而后能产生分解荧光底物——葡萄糖醛酸酶，从而释放出荧光产物，进而使培养基在紫外光照射下产生特征荧光。此方法可被用来对原样品中的菌落数作统计学估计。

在单料或双料乳糖胆盐发酵管内发酵，分离培养试验，利用伊红美蓝培养皿分离，接着是在乳糖发酵管中进行二次发酵，最后通过芽孢染色、革兰氏染色、显微镜观察等来完成。多管发酵法对试验条件要求不高，成本低，但是检测时间较长，容易受其他条件干扰，进而影响到测定结果的精确度。

(5)重庆肠道微生物测序分析方法扩展阅读：

注意事项：

1、检样时注意无菌操作。

2、稀释时采用的稀释液可以用磷酸盐缓冲液或生理盐水，接种时可采用九管法，设置三个梯度，分别为0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一个稀释度的试管应充分混匀。

3、每次实验需要有阴性对照。

4、使用小倒管培养基配制时，为排净气泡，灭菌时不要把试管的盖子盖的太紧，灭菌后注意观察一下倒管中的气体是否排完全、

5、高压灭菌后等高压灭菌锅的压力表达到0，取出培养基放到冰箱冷却，效果会比较好。

㈥ 肠道菌群检测是什么如何检测

肠道菌群检测是通过对人体粪便的提取物检测肠道菌群状况，比例是否正常，存在哪些问题和风险。对于前述适应症疑似患者，治疗前均需进行肠道菌群进行多项常规生物指标检测，以初步判断患者肠道菌群状况。

在进行此基础上，进一步对疑似患者进行肠道菌群基因检测，并对结果进行详尽解读，以便给患者菌群移植治疗制定个性化精准菌群移植治疗方案。

㈦ 粪便DNA检测是真的吗可信吗

01
可以
粪便中有肠道的脱落细胞，可以用来检测DNA并鉴定身份，不过需要对照样本才能确定DNA属于谁。

理论上，此举可行。
人类粪便中有肠道脱落细胞还有肠道菌群。用肠道菌群DNA做个体鉴别在人类身上有没有实践尚不清楚（这么做的一般是用在小鼠身上），但是肠道脱落细胞的DNA肯定是可以检测出来并且用来鉴别身份的。对于流言中提到的事件，检出那坨粪便中的DNA，测找几个不同人之间突变比较多的位点测一下；再和丁女士家11楼-24楼之间的所有住户的DNA检测结果对比一下，应该可以找到完全相同的那一位。

不过如果对方拒绝提供DNA样本的话也就没法比较了，光靠一份DNA是无法完整的还原出个体的外貌特征的。目前这个技术也只是能获取一些粗略的特征，比如肤色、发色、眼睛颜色、性别、族裔之类，脸部特征也只是能估计一下脸型（长和宽）以及“雀斑量”；更精细一点的特征，比如年龄和身高等，DNA就提供不出了，五官长相更别提了。

㈧ 如何采用宏基因组进行水产动物肠道微生物的研究

1，宏基因组提取；提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，除需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样本的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作，谨防污染，并且保持DNA 片段的完整和纯度。为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集，常用的富集方法有稳定同位素探针、抑制性消减杂交、差异显示、噬菌体展示、 亲和捕获及DNA微阵列等技术。
2，测序分析：
采用Solexa进行宏基因组 DNA测序，首先对特定环境微生物种群全基因组DNA进行提取。在提取微生物种群的DNA后制备DNA文库，具体步骤如下：

（1）将DNA随机打断成200-500bp的片段；

（2）对DNA末端进行修复；

（3）将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；

（4）在DNA片段的末端加上接头；

（5）纯化连接产物；

（6）PCR扩增连上接头的DNA片段；

（7）检测测序文库。