微生物研究方法

A. 微生物的培养方法有哪些

微生物培养法是在人为条件下繁殖微生物的方法。根据微生物的种类以及对养料、温度、氧气、水分、酸碱度等环境条件的要求不同，并联系生产和实验上的具体要求，可有不同的培养方法。可分好气培养法和厌气培养法两类。中海生物技术的培养基一是好气微生物培养法，常用：
①摇床培养法，即将微生物接种于盛有液体培养基的三角瓶后，放在恒温培养室中的摇床上作有节奏的振荡，使空气不断进入培养液中，促其良好生长;
②浅盘培养法，又称表面培养法，在盘内放一浅层培养基，使微生物能够充分接触空气，而有利于生长繁殖，但此法所需空间大，并且容易污染杂菌;
③深层培养法，适用于好气微生物的大规模发酵培养，在大容积的液体培养基中，通入无菌空气，并不断搅拌，可使微生物充分接触空气，迅速繁殖并积累代谢产物。二是厌气微生物培养法，实验室常用化学还原剂或抽气机吸除培养基中的分子氧，也有用静止状态的深层培养法。在生产中常用密封式发酵罐或不通风的固体发酵法。

B. 微生物测定法的方法分类

液体稀释法
在一组试管中分别加入一定的培养基，然后加入不等量的被测物质，再将已培养好的、用于测定的微生物接种进去,在规定的条件下培养一定时间,观察其消长情况并与标准曲线对比，计算出被测物质的含量。
固体平板扩散法
将溶化的固体培养基与被测定微生物混合做成平板，把含不等量被测物质的液体滴入置于平板上(直接滴样法)；或注入平板上的牛津杯内（管碟法）；或吸入圆形滤纸片后，再置于平板上(纸片法)；也可以在平板上挖一定大小的圆孔，然后把被测物滴入孔内（打孔法）；经培养后在物质扩散所及的范围内出现抑菌法（或生长圈）,测量圈的直径,并与标准曲线对比,计算出被测物质的含量（见图[固体平板扩散法 1、3、7 打孔法2、8纸片法4、6管碟法5直接滴样法][]）。
1932年，A.弗莱明在研究溶菌酶和青霉素时，开始使用微生物法测定抗生素的活性。1940年，E.B.钱恩等根据平板上抑菌圈的大小测定青霉素的活性含量。后又经E.P.亚伯拉罕等进一步将上述测定方法予以完善。测定抗生素时常用的微生物有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉等。1935年，W.H.肖普费最先用微生物测定维生素B。1939年,E.E.斯内尔和F.M.斯特朗用乳杆菌测定维生素的含量。1934年，K.A.凯肯等用阿拉伯聚糖乳杆菌测定9种氨基酸。此后,乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属的成员及某些微生物的变异株，逐渐成为最常使用的对象。

C. 不可培养微生物的研究方法和研究意义

稀释培养法和高通量培养法 d.pp3D 9/
在地球环境中，海洋环境中迄今可培养微生物的比例最低，仅为0.001% ～ 0.1%，这是由于海洋环境中主要是寡营养微生物，它们在人工培养时往往受到少数优势生长的微生物的竞争作用而不能生长。为了克服该缺陷，1993 年Button从概率论的角度提出一个崭新的方法，即稀释培养法（Dilution culture）。该方法认为，当把海水中微生物群体稀释至痕量时，在海水中主要存在的寡营养微生物可以不受少数几种优势微生物的竞争作用的干扰，因而主体寡营养微生物被培养的可能性会大大提高。随后，Schut等的实际操作验证了该理论的正确性。 ';/84j-3F
2002 年Connon在稀释培养法的基础上提出高通量培养法（High-throughput culturing，HTC）。将样品稀释至痕量后，采用小体积48 孔细胞培养板分离培养微生物。该方法不仅有效提高微生物的可培养性，还可在短期内监测大量的培养物，大大提高工作效率。Cho等利用该方法从太平洋近海和远洋海水中也分离出多种新菌。Rappé 和Connon结合荧光原位杂交技术（FISH），对高通量培养法进行了改进，根据从培养板各孔中针对性地检测SAR11 进化分支的海洋细菌的存在，在较短时间内对目标微生物进行了大量的培养。但是，稀释培养法和高通量培养法成功的原因恰恰又是制约其进一步发展的障碍。在样品稀释、微生物间的不利作用被削弱的同时，有利作用也被削弱。例如，当微生物被极度稀释、初始接种量很小时，一些微生物分泌的代谢产物也被稀释，其他关联微生物细胞由于缺乏这些必须的代谢产物，生长就会受到抑制；另外，缺少种间的共生关系和群体效应，很多微生物仍然不可培养。 O3!d(dY=_
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3.2 扩散盒培养法 GOW"o"S
Kaeberlein〔2〕等在分离培养潮间带底泥中的微生物时使用一种新颖的自制培养仪器，为其起名为扩散盒（Diffusiongrowth chamber）。扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的0.1μm 滤膜组成，滤膜只能允许培养环境中的化学物质通过而不能让细胞通过。将底泥样品置于扩散盒内的半固体培养基中，扩散盒置于鱼缸底部的天然海洋底泥上，往鱼缸内加入天然海水并保证扩散盒内存有一定空气供微生物生长。培养时，使天然海水循环流动，并不断注入新鲜的海水。培养1 周后培养基上产生大量的微型菌落，数目高达接种微生物的40%。这种培养方法能较大程度地模拟微生物所处的自然环境，由于化学物质可以自由穿过薄膜，可保证微生物群落间作用的存在，提高微生物可培养性。扩散盒法的主要不足是操作比较繁琐。 b%nkIPA
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3.3 细胞包囊法 hNO )~rt
Zengler 等将海水和土壤样品中的微生物先进行类似稀释培养法的稀释过程，然后乳化，部分微生物形成了仅含单个细胞的胶状微滴。然后将胶状微滴装入层析柱内，使培养液连续通过层析柱进行流态培养。层析柱进口端用0.1μm 滤膜封住，防止细菌的进入而污染层析柱；出口端用8μm 滤膜封住，允许培养产生的细胞随培养液流出。该方法的特点是让微生物在开放式培养液中生长，使培养环境接近于微生物的自然生长环境，能够很好地提高微生物可培养性，但成本较高，不利于普及使用。 & zgPN8u
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3.4 序列引导分离技术 _:5=| 2-E
序列引导分离技术（Sequence-guiding isolation）是根据微生物基因组中特定基因的特异性序列，设计引物或杂交探针，以培养物中目标序列存在和变化情况为标准，来指导对微生物最优培养条件的选择，培养出新的微生物。Stevenson在细菌培养过程中采用了多种培养条件的组合，导致培养方案繁多复杂。为了减少分离细菌的工作量、节省时间，用PCR 作为监测手段来确定目标细菌是否得到培养。当细菌在固体培养基上长出菌落后，用缓冲液冲洗培养基表面，提取冲洗液中细菌的DNA，根据目标细菌的16S rDNA扩增情况判断目标细菌的存在与否。继续用PCR方法监测目标细菌直至分离得到纯菌株。Béjà 等通过对尚未培养的海洋变形细菌的BAC 基因文库进行研究，发现该类菌具有编码视紫红质的基因片段。视紫红质是光营养过程中不可或缺的化学物质。据此设想增加光照可提高该菌的可培养性，而进一步的实验结果验证了该假设的正确性。此外，Breznak指出，分子原位杂交技术可以对推断目标微生物的代谢方式和营养需求提供帮助，极大地节省工作时间，操作也很简便，仅需要一种特异性的探针，显示了在微生物培养时引入分子生物学技术作为引导的优势和力量。