糖分析方法

‘壹’ 可溶性糖含量的测定方法有哪些

测定方法有以下几种：
1.蒽酮法测定可溶性糖
2.苯酚法测定可溶性糖
3.3 ,5 –二硝基水杨酸比色法测定还原糖
4.斐林试剂比色法测定还原糖

斐林试剂比色法测定还原糖步骤

一、原理
植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的 Cu 2+ 还原成 Cu + ，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比，在 590 nm 波长下比色测定吸光度，查标准曲线，即可计算出所测样品中还原糖的含量。本方法也可用于测定蔗糖及总糖含量。

二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。

（二）试剂
1. 斐林试剂 A 液： 40 g CuSO 4 · 5H 2 O 溶解于蒸馏水定容至 1000 mL 。
2. 斐林试剂 B 液： 200g 酒石酸钾钠（ KNaC 4 H 4 O 6 · 5H 2 O ）与 150g NaOH 溶于蒸馏水中，并定容至 1000 mL 。
A 、 B 两液分别贮存，使用前等体积混合。
3. 0.1 ％葡萄糖标准液：取 80 ℃下烘至恒重的葡萄糖 0.1000 g ，加蒸馏水溶解，定容至 100 mL 。
4. 0.1mol/LNaOH 。
5. 甲基红指示剂： 0.1 g 甲基红溶于 250 mL 60 ％乙醇中。 6. 10 ％ Pb(Ac) 2 。 7. 饱和 Na 2 SO 4 。

（三）仪器设备
分光光度计，分析天平，离心机，水浴锅，具塞刻度试管，刻度吸管，容量瓶，研钵。

三、实验步骤
1 . 标准曲线的制作 取 7 支试管，按表 24 – 4 分别加入各溶液。 将以上各管混合后加塞，于沸水浴中加热 15 min 。取出后自来水冷却， 1500 r/min 离心 15 min 。取上清液，用分光光度计在 590 nm 波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度。用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品中还原糖的提取 取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取 3.00 g ，放入研钵中研磨至糊状，用水洗入大试管中。体积为 10 ～ 15 mL 时，加 2 ～ 3 滴甲基红指示剂，如呈红色，可用 0.1 mol/L 的 NaOH 中和至微黄色。若用风干样品，可称取干粉 3.00 g ，先在烧杯中用少量水湿润，然后用水洗入 250 mL 容量瓶中，如显酸性，可用上法中和。 将大试管置于 80 ℃的恒温水浴中保温 30 min ，其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品，此间可加 10 ％ Pb(Ac) 2 ，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和 Na 2 SO 4 除去多余的铅离子。 30 min 后取出冷却，将提取液全部转入 100 mL 容量瓶中。定容至刻度，摇匀后过滤待测。
3. 样品测定 吸取 6 mL 待测液，加 4 mL 斐林试剂，其他操作与标准曲线相同，在 590 nm 波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量。

‘贰’ 糖链分析有哪些常规方法和步骤

蛋白质糖基化是人体中最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,人体中超过50%的蛋白质是糖基化的。研究发现,寡糖在蛋白质结构构造、生物活性中起着至关重要的作用,人类许多疾病的发生和发展都与蛋白上N-糖链的结构和表达量的改变有关。因此,发展和建立分析N-糖链的方法,对生物和病理学研究具有积极现实意义。目前的研究方法主要是化学衍生法,其缺点是需要引入额外的化学试剂、操作步骤繁琐以及有副反应发生。化学酶标记法由于没有化学衍生法的特点,为研究糖蛋白中的N-糖链,提供了新的思路。首先,在本实验室前人工作的基础上,以Boc-Asn-GlcNAc为基础结构单元物质合成了同位素标记糖基受体d0/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc,优化了受体合成方法：以DMT-MM作为反应缩合剂,探索温度、时间、反应物比例对受体产率的影响,合成受体反应产率达到95-98%。随后,我们以标准糖肽SGP为反应底物,对比Endo-M酶、(?)Endo-M-N175Q酶的转糖基活性和水解活性,结果表明Endo-M-N175Q酶的转糖基活性几乎是Endo-M酶的2倍,且Endo-M-N175Q酶几乎丧失对转糖基产物的水解能力。紧接着我们以标准糖蛋白牛胰核糖核酸酶B为研究对象,对比丙酮富集N-糖链和N-糖苷酶F释放N-糖链两种方法检测糖链的效率,结果表明N-糖苷酶F释放N-糖链简便、高效。为了检验该方法的实用性,我们以卵清蛋白为实际样品,成功、高效地检测出一系列N-糖链(M5N2、M6N2、M7N2、M4N3、M5N3、M3N4、 M3N5、M4N4、M3N6),和文献己报到的寡糖数量一致,正离子模式下这些寡糖都是以二价或三价的形式出现。相比于传统的化学衍生化法,Endo-M-N175Q酶可以一步完成酶解和转移两个过程,避免了繁琐的步骤以及副反应的发生。因此,我们提出的以含有Boc-Asn-G1cNAc结构单元的化学物质作为糖基受体、结合Endo-M-N-175Q酶的特性、以HPLC/ESI-MS为检测手段,这一全新的分析方法,对分析糖蛋白中的N-糖链切实高效可行。…

‘叁’ 多糖类的分析方法

下面将简单介绍化学方法和物理分析方法。⑴化学方法测定多糖结构还是目前最常用的方法，测定的手段很多，其中经典而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解以及乙酰解和甲醇解等。① 乙酰解：多糖的乙酰解反应是在由乙酸酐、乙酸和硫酸组成的混合液中加热进行的，在一定的糖苷键处裂解。研究表明，相同糖苷键在酸水解和乙酰解中的速度是不同的。乙酰解是酸水解的一种有用的补充，多糖可从这两种不同的方法中获得不同的片段，从不同的角度获得多糖的结构信息。甲醇解：多糖在80-100℃条件下与无水甲醇氯化氢反应能将多糖变成组成单糖的甲基糖苷，这些甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，然后进行GC分析并与标准单糖对照，可得到组成多糖的各单糖的定量数据。⑵物理分析法 ①IR法：IR在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型，以及常规观察其他官能团。一般主要观察730-960cm-1的范围，如对于α-吡喃糖，δC1-H在 845 cm-1，而β-吡喃糖，δC1-H在890cm-1有最大吸收峰。②MS、GC-MS：GC分析多糖虽受样品挥发性和热稳定性的限制，但GC-MS是多糖结构分析不可缺少的工具，特别是对水解单糖、甲基化单糖及甲基化寡糖的分析，而且能鉴别出糖的异构体。MS在多糖结构分析中不仅在鉴别各种甲基衍生物的碎片，确定各种单糖残基的连接位置时必不可少，而且由于FAB-MS、ESI-MS和 MALDI-MS等技术的出现，利用质谱还可以测定多糖的分子量及一级结构。③NMR：用NMR技术研究多糖结构的一个特点是不破坏样品，对多糖的结构特征可通过化学位移、偶合常数、积分面积、NOE及驰豫时间等参数来表达。一维、二维图谱 NMR在分析糖的构型、相互连接的位置及顺序等方面具有广阔的应用前景。2、分子量及分子量分布多糖具有分子大小不均一的特点，近年来发现这些生物大分子的某一分子量范围成分具有药理活性，而另一分子量范围的成分不具有药理活性或具有一定的毒副作用，因此分子量及其分布既是这类药物的有效性控制的指标又是安全性控制的指标，质量标准中制订该项检查十分必要，这也是近年来大分子聚合物药物质量标准发展的一个明显的特点。多糖分子量只是代表相似链长的平均配布，不同方法所测得的分子量不同，即使是同一多糖，其重均分子量与数均分子量也相差较大，通常采用凝胶色谱法控制这类药物的分子量及其分布，应经研究选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂；使用的流动相通常为水或缓冲液，其pH值不应超过填充剂的耐受范围，可加入适量的有机溶剂，但浓度不应超过30%，流速以 0.5-1.0ml/min为宜，因这类分子多无紫外吸收，一般采用示差折光检测器，选用对照品的分子量范围及颗粒形状应与供试品匹配，测定数据经适宜的GPC软件处理求得相关参数。3、含量测定一般来讲，多糖不含蛋白和氨基酸，蛋白或氨基酸检测应呈阴性或符合限度检查要求，如为糖蛋白或糖肽，应提供其证据，以保证产品不是多糖与蛋白的混合物；并提供其氨基酸构成及蛋白含量范围，以保证质量稳定可控。对从天然植物中得到的多糖，在结构研究中尤其对糖组成分析，确定其中是否含有糖醛酸残基具有很重要的意义。糖醛酸的含量测定目前较常用的是硫酸咔唑法，但容易受中性糖残基的干扰。为了消除测定的干扰，可先测定样品中中性糖的吸收度，然后从样品的吸收度减去中性糖的吸收度，即为样品中糖醛酸的吸收度值。间羟基联苯法也是一种常用的多糖中糖醛酸含量测定方法，该法较硫酸咔唑法受中性糖残基的干扰更小。多糖的含量测定可分为两大类：一类是直接测定多糖本身，如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。前者需要多糖的纯品和特定的酶，后者测定时方法学干扰较大，现有的比色重现性差，受影响因素多。但由于目前国内的实验条件，多糖的含量仍然主要采用这种方法，其原理为：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量，所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的值较准确。需要强调的是，这种方法所测定的是总糖的含量而不是总多糖的含量，因此首先应测定样品中游离的单糖含量，然后将总糖的含量减去游离单糖的含量，即为总多糖的含量。另外还可以采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法），它是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。

‘肆’ 植物组织中糖的测定方法有很多种,举例说明他们的原理和优缺点

有许多不同的分析技术用于糖的分离和测定,包括化学分析、比色分析、纸色谱、薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱等。本文总结了近十年植物组织中糖类化合物的研究进展，为其含量测定提供理论依据。

1 分光光度分析法

分光光度法是基于长链多糖在水溶液中离解后可与染料等阳离子相互结合发生反应，从而引起染料吸收光谱的变化进行测定。这种方法具有较好的选择性，可以用于实际样品的测定，通常有两种常见方法。

1.1 蒽酮 - 硫酸比色法

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为 630 nm，可在此波长下进行比色。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖和己糖而且可以测寡糖和多糖，在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量。蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，但测定结果误差较大，只能测定样品中可溶性糖总量。陈鸿英等人用蒽酮硫酸法测定淫羊藿多糖的含量，得到的结果较稳定。

1.2 苯酚 - 硫酸比色法

植物体内的糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定糖的原理是在浓硫酸作用下，糖脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10mg～100 mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485 nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定 160 min 以上。

2 气相色谱法

气相色谱法是以气体作为流动相的一种色谱分析方法气相色谱法测定糖类，具有选择性好、样品用量少、分辨率高、快速准确、灵敏等优点。曾昭睿采用三 - 端烯丙基 - 不对称二苯并 14- 冠 - 4- 二羟基冠醚做固定相分离了鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的乙酸酯衍生物。吴建元等人利用气相色谱法分析茯苓多糖的单糖组成结果 6 种标准单糖的衍生物实现了良好的分离并具有良好的峰形。胡磊等人用 1 一甲基咪唑为溶剂和催化剂、盐酸羟胺和乙酸酐为肟化和乙酰化试剂，对植物样品中糖与糖醇进行乙酰化衍生化利用气相色谱分离和质谱鉴定的分析方法。

3 高效毛细管电泳法

除了少数带有羧基和磺酸基的糖类化合物，绝大多数糖类化合物不带电荷，极性很大且没有发色基团。所以用一般的高效毛细管电泳系统无法得到分离和检测。为了使糖类化合物能产生电迁移而得以相互分离，可采用的方法有：（1）衍生化使之带上发色、荧光基团或电荷；（2）与硼酸盐等络合；（3）与缓冲液中的添加剂形成包合配合物；（4）高 pH缓冲条件下使之电离；（5）加入表面活性剂使形成胶束。20世纪 90 年代以来毛细管电泳因具备分离快速，所需样品量少和自动化程度高的特点，已广泛应用于糖化合物的分析。

4 高效液相色谱法

HPLC 用于糖的定性和定量分析具有快速、灵敏、样品处理简单等优点。从大量的文献报道和综述中可以看出，由于糖的特殊结构及它本身不含强紫外和荧光吸收的官能团，到目前为止还没有建立一个统一的方法来分析所有的单糖和低聚糖。分析糖的色谱柱有化合键合烷基柱、阴阳离子交换柱、氨基键合硅胶柱和硅胶柱等。

文献来源：孙艳涛，由欣. 植物组织中糖化合物测定方法的研究进展.科教文汇(上旬刊). 2011,10(上旬刊) ：134-135.网页链接

‘伍’ 求教对于单抗糖型分析的具体纯化和分析方法

单抗糖型分析方法步骤主要是
PNGase F酶切，收集寡糖，2-AB荧光标记，除去多余标记，最后过HILIC分析。
酶切可以按买到的试剂说明书进行操作
酶切后的纯化，有两种方法：一种是萃取柱；还有一种是加热使蛋白析出，再离心去除蛋白。也可以采取有机溶剂沉淀蛋白的方法来除去蛋白
收集寡糖，可以用HILIC SPE萃取收集
2-AB荧光标记可以按买到的试剂说明书进行操作
除去多余标记可以用超滤管去除

‘陆’ 糖类分析的方法有哪些

可查药典

‘柒’ 测定糖的含量的方法有哪些

糖的测定方法
一般有四种方法：
1、 直接滴定法。

原理为 糖还原天蓝色的氢氧化铜为红色的氧化亚铜。缺点：水样中的还原性物质能对糖的测定造成影响。

2、 高锰酸钾滴定法。

所用原理同直接滴定法。缺点：水样中的还原性物质能对糖的测定造成影响，过程较为复杂，误差大。

3、硫酸苯酚法。

糖在浓硫酸作用下，脱水形成的糠醛和羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

缺点：如果水样呈橙红色（大部分水样为黄色），会对比色法造成较大的干扰。

4、蒽酮法

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛和羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的测定。

缺点：，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅。

综合比较；采用蒽酮法能将最为准确地测定尾水中糖的含量。

（一） 直接滴定法

Ⅰ、原理

v 一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用标液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。根据样液消耗量可计算出还原糖含量。
样品经除去蛋白质后，在加热条件下，以次甲基蓝做指示剂，滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液（用还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液），根据样品溶液消耗体积计算还原糖量。

Ⅱ、仪器和试剂
1．仪器
酸式滴定管，可调电炉（带石棉板），250ml容量瓶。
2．试剂

1. 盐酸。

2. 碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000mL。

3. 碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠与75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000 ml，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

4. 乙酸锌溶液：称取21.9 g乙酸锌，加3ml冰乙酸，加水溶解并稀释至100ml。

5. 亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至100ml。

6. 葡萄糖标准溶液：准确称取1.0000g经过96℃±2℃干燥2h的纯葡萄糖，加水溶解后加入5ml盐酸，并以水稀释至1000L。此溶液相当于1mg/ml葡萄糖（注：加盐酸的目的是防腐，标准溶液也可用饱和苯甲酸溶液配制）。

7. 果糖标准溶液：按⑹操作，配制每毫升标准溶液相当于1mg的果糖。

8. 乳糖标准溶液：按⑹操作，配制每毫升标准溶液相当于1mg的乳糖。

9. 转化糖标准溶液：准确称取1.0526g纯蔗糖，用100ml水溶解，置于具塞三角瓶中加5ml盐酸（1+1），在68℃~70℃水浴中加热15min，放置至室温定容至1000ml，每ml标准溶液相当于1.0mg转化糖。

Ⅲ、实验步骤
1．样品处理
⑴ 乳类、乳制品及含蛋白质的食品：称取约2.50～5.00g固体样品（吸取25～50ml液体样品），置于250 ml容量瓶中，加50 ml水，摇匀。边摇边慢慢加入5ml乙酸锌溶液及5ml亚铁氢化钾溶液，加水至刻度，混匀。静置30 min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。（注意：乙酸锌可去除蛋白质、鞣质、树脂等，使它们形成沉淀，经过滤除去。如果钙离子过多时，易与葡萄糖、果糖生成络合物，使滴定速度缓慢；从而结果偏低，可向样品中加入草酸粉，与钙结合，形成沉淀并过滤。）

⑵ 酒精性饮料：吸取100ml样品，置于蒸发皿中，用1 mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积1/4后，移入250ml容量瓶中，加水至刻度。

⑶ 含多量淀粉的食品：称取10.00～20.00g样品，置于250ml容量瓶中，加200ml水，在45℃水浴中加热1h，并时时振摇（注意：此步骤是使还原糖溶于水中，切忌温度过高，因为淀粉在高温条件下可糊化、水解，影响检测结果。）。冷后加水至刻度，混匀，静置，沉淀。吸取200ml上清液于另一250ml容量瓶中，慢慢加入5ml乙酸锌溶液及5ml亚铁氢化钾溶液，加水至刻度，混匀，沉淀，静置30 min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。

⑷ 汽水等含有二氧化碳的饮料：吸取100ml样品置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250ml容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后备用。（注意：样品中稀释的还原糖最终浓度应接近于葡萄糖标准液的浓度。）

2. 标定碱性酒石酸铜溶液：吸取5.0ml碱性酒石酸铜甲液及5.0ml乙液，置于150ml锥形瓶中（注意：甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀，应将甲液加入乙液，使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶），加水10 ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约9 ml葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液，直至溶液兰色刚好褪去为终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液总体积，平行操作三份，取其平均值，计算每10 ml（甲、乙液各5 ml）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量或其他还原糖的质量（mg）。（注意：还原的次甲基蓝易被空气中的氧氧化，恢复成原来的蓝色，所以滴定过程中必须保持溶液成沸腾状态，并且避免滴定时间过长。）

3. 样品溶液预测：吸取5.0 ml碱性酒石酸铜甲液及5.0 ml乙液，置于150 ml锥形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，控制在2 min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色褪去，出现亮黄色为终点。如果样品液颜色较深，滴定终点则为兰色褪去出现明亮颜色（如亮红），记录消耗样液的总体积。（注意：如果滴定液的颜色变浅后复又变深，说明滴定过量，需重新滴定。） 当试样溶液中还原糖浓度过高时应适当稀释，再进行正式测定，使每次滴定消耗试样溶液的体积控制在与标定碱性酒石酸酮溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约在10ml左右。当浓度过低时则采取直接加入10ml样品溶液，免去加水10ml，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于10ml试样溶液中所含还原糖的量。

4. 样品溶液测定：吸取5.0 ml碱性酒石酸铜甲液及5.0 ml乙液，置于150 ml锥形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，在2 min内加热至沸，快速从滴定管中滴加比预测体积少1 ml的样品溶液，然后趁沸继续以每两秒1滴的速度滴定直至终点。记录消耗样液的总体积，同法平行操作两至三份，得出平均消耗体积。

5. 计算
样品中还原糖的含量（以某种还原糖计）按下式计算。
X=〔A/(m×V/250×1000)〕×100
式中：X--样品中还原糖的含量(以某种还原糖计)，单位 g/100g；
A—碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）相当于某种还原糖的质量，单位 mg；
m--样品质量，单位 g；
V--测定时平均消耗样品溶液的体积，单位 ml；
计算结果保留小数点后一位。

注意：

滴定结束，锥形瓶离开热源后，由于空气中氧的氧化，使溶液又重新变蓝，此时不应再滴定。

（二）高锰酸钾滴定法

v 原理 将样液与一定量过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖将二价铜还原为氧化亚铜，经过滤，得到氧化亚铜沉淀，加入过量的酸性硫酸铁溶液将其氧化溶解，而三价铁盐被定量地还原为亚铁盐，用高锰酸钾标准溶液滴定所生成的亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出氧化亚铜的量，再从检索表中查出氧化亚铜量相当的还原糖量，即可计算出样品中还原糖含量。

（三）硫酸苯酚法

Ⅰ、原理

糖在浓硫酸作用下，脱水形成的糠醛和羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。

多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

Ⅱ、试剂

1． 浓硫酸：分析纯，95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

4． 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8． 6mol/L 盐酸

Ⅲ、操作。

1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：

①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。）

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

④定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。

Ⅳ、注意

（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。

（4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。

（四）蒽酮法

Ⅰ、实验原理

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛和羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖和己糖，而且可以测所有的寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应。所以，用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅。故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

Ⅱ、试剂：

蒽酮试剂，0.20 g蒽酮溶入100 mL 95%浓硫酸中，冰箱保存；

Ⅲ、方法：

样品2.0 mL加5.0 mL蒽酮试剂，混匀，然后水浴煮沸10 min，取出冷却至室温，在620 nm处测定其吸光度，根据标准曲线计算水样中糖的浓度。（标线以葡萄糖为标样）

‘捌’ 用什么方法鉴定糖

鉴定糖是一个很严谨的过程，这并不是什么简单的方法就能鉴定的。糖为多羟基醇与多羟基醛类化合物，由于化学结构随便变动一个氢就可以变成另外一种物质，所以这里给出具体的测定流程。
在有标准品的情况下：
首先，通过纸层析法、凝胶柱色谱法进行分离，得到单个化合物（多糖化合物）。之后，将此化合物通过一定的试剂水解成众多单糖化合物。用气相色谱和凝胶柱层析分析，与众多标准品进行比较如：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等。采用三种以上的不同展开剂展开，对比比移值，如果比移值三次以上都是同样的数字，那么可以说是同一种物质。从而，确定此为什么物质。在通过气象色谱法-质谱法连用，进行官能团的结构内连接、排列与数量的分析。
在没有标准品的情况下：
如果是未知物质，没有标准品的话。可采用四大光谱联合应用并与仪器分析进行联合分析。
四大光谱：紫外光谱，核磁共振，红外光谱，质谱。
将四大广谱数据汇总，进行大量计算。如还不能判断是什么物质的不话。如果物质结晶，则可考虑用X射线单晶衍射（X射线单晶衍射，是世界上最先进的检测结构的方法了）。
相关知识拓展：随着科技的发展，鉴定物质的方法已经不仅仅局限于上述方法。网传的什么“鉴定还原糖”的方法。这里说一句：这种方法不过是利用了某些糖的性质而已，并不代表所有糖都有。鉴定不是鉴别，需要说出具体结构以及内部分子链接方式，这些不可能是一个简单的化学反应就可以鉴定出来的。如果本体题目说的是“鉴别”，那么方法会简单很多，可以把糖分成还原糖与非还原糖两种进行分别鉴别。但是本题说的是鉴定，那么就不能通过简单的方法进行测定。

‘玖’ 黑糖有分析方法吗

冰度黑糖，使用古法配制新鲜甘蔗原汁，不添加任何防腐剂、色素、抗结剂等，不经过高度精炼、脱色，物理方法将糖分结晶，最大程度保留甘蔗里的钙、钾、铁、镁、尼克酸等微量元素，配以桂圆红枣、玫瑰四物、红枣、老姜等，成为补气补血的温补佳品。

‘拾’ 有几种方法测定葡萄糖含量各自的原理是什么

有两种方法来测定。

第一种用菲林试剂来测定，原理为：

CH2OH（CHOH）4CHO+2[Ag(NH3）2OH]（水浴加热）→CH2OH（CHOH）4COONH4+2Ag↓+3NH3+H2O

注意事项：⑴ 试管内壁必须洁净

⑵ 银氨溶液随用随配不可久置；

⑶ 水浴加热，不可用酒精灯直接加热；

⑷ 可加入氢氧化钠，以促进反应进行；

⑸ 银镜可用稀HNO3浸泡洗涤除去。

加热还原生成的银附着在试管壁上，形成银镜，所以，这个反应也叫银镜反应。

第二种用新制的氢氧化铜溶液来测定，原理为：

葡萄糖溶液与新制氢氧化铜悬浊液反应生成砖红色沉淀。（浓度高时生成黄色沉淀）

CH2OH（CHOH）4CHO+2Cu(OH)2---加热→CH2OH（CHOH）4COOH+Cu2O↓+2H2O

注意事项：⑴ 新制2Cu(OH)2悬浊液要随用随配、不可久置。

⑵ 配制新制Cu(OH)2悬浊液时，所用NaOH溶液必须过量。

⑶ 反应液必须直接加热至沸腾。

⑷ 葡萄糖分子中虽然含有醛基，但是d-葡萄糖中不含有醛基。

葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛。

纯净的葡萄糖为无色晶体，有甜味但甜味不如蔗糖（一般人无法尝到甜味），易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。天然葡萄糖水溶液旋光向右，故属于“右旋糖”。

葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。植物可通过光合作用产生葡萄糖。在糖果制造业和医药领域有着广泛应用。

化学性质

它是自然界分布最广泛的单糖。葡萄糖含五个羟基，一个醛基，具有多元醇和醛的性质。

用途：

生物培养基。金属还原剂。滴定硼酸的络合物形成剂。微量分析。测定全血葡萄糖。可直接被人体吸收。

正常人体每分钟利用葡萄糖的能力为每公斤体重6毫克。是一种能直接吸收利用，补充热能的碳水化合物，是人体所需能量的主要来源，在体内被氧化成二氧化碳和水，并同时供给热量，或以糖原形式贮存。能促进肝脏的解毒功能，对肝脏有保护作用。是生物体内最为常见的能源物资。