㈠ 细菌内毒素中什么是定量法
目前,国内外广泛应用且检测技术比较成熟的细菌内毒素定量检查法主要有以下四种。
1. 1凝胶法是目前最常用的细菌内毒素检查法。即在10mm×75mm的小试管内,加入待检样品和鲎试剂各0. 1ml混合, 37℃、60 min保温反应后, 180°倒转,根据凝胶形成的情况(凝胶是否坚实)作为判定指标的一种半定量法。此法操作简单,经济而且不需要专用仪器。凝胶法既可限量检测内毒素,也可在0. 03 EU•ml-1以上进行半定量测定。
1. 2显色基质法(合成基质法、显色合成基质法, Chromoge-nic Technique)系根据细菌内毒素与LAL(或TAL)试剂中的C系反应所激活的凝固酶,使用人工合成的鲎三肽(即与PNA相连的显色基质如BOC-LEU-GLY-ARG-PNA等)作为显色基质,水解鲎三肽中的精氨酸肽链,通过测量反应液中释放出游离的对硝基苯胺(PNA)的吸光值而进行定量的一种检测方法。该法需要专用仪器。目前主要用于微量血浆、血清、全血、骨髓液及尿、乳汁等的临床检验以及家禽、实验动物、人工脏器的安全性评估等方面。根据测定原理的不同分为终点显色法和动态显色法。
1.2.1终点显色法(EndopointColorimetric Assay)系根据在一定时间内游离出的PNA的量与细菌内毒素浓度成正比例关系进行测定的一种分析方法。PNA(黄色)的吸光度值可使用单波长405 nm或双波长(测定波长405 nm、参照波长492 nm)测量,或利用游离的PNA与红色偶氮试剂发生反应所形成的红色偶氮蓝复合物在545nm单波长或双波长(测定波长545 nm、参照波长630 nm)进行检测。一般可在0. 006~15 EU/ml范围内进行定量。
1.2.2动态显色法(Kinetic Colorimetric Assay)系根据游离的PNA的吸光度变化率(mAbs/min)与细菌内毒素浓度成正比例关系(比色反应速度法Pate Assay)或到达事先设定的反应吸光度变化值所需要的时间Ta的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系(比色反应时间法OD-Time As-say)进行测定的一种分析方法。一般可在0. 006~50 EU/ml范围内进行定量。
1. 3酶联免疫测定法(ELISA法)基于抗原抗体的酶联免疫测定法,目前在国外应用十分普遍。主要由外加热原质刺激巨嗜细胞后产生的内热原物质(如TNF, TL-1等),而进行的定量测定方法。体外人全血热原检测方法是近年来国内外正在兴起的一种研究热原检测的新方法,具有检测范围广,灵敏度高,不同个体血液的结果差异小等优点[2, 3]。国内一些学者,已采用酶联免疫测定法对体外人全血热原检测方法的可行性进行研究和优化,取得了可喜的进展[4]。1. 4浊度法(Turbidim etrc Technique)系微量的内毒素与TAL(LAL)试剂中的C因子发生反应,由内毒素引发激活的凝固酶,切断凝固蛋白特定位置的精氨酸肽键,形成凝固蛋白从而产生凝胶过程中的浊度变化,采用适当的光学仪器测量的一种分析方法。此法操作比较简单、经济、灵敏度高,检测范围广。通常在0. 006~300 EU/ml的范围内进行定量,但需要专用仪器。根据测定原理的不同又可分为终点浊度法和动态浊度法。
1.4.1终点浊度法(EndopintTurbidimetric Technique)即根据到达规定点上反应液的最终浊度值(吸光度或透过光亮值)与细菌内毒素浓度成正比例或反比例的关系而进行测量的一种检测方法。由于未形成标准化,目前国内外都很少使用,也未见有专门仪器使用。
1.4.2动态浊度法(Kinetic Turbidimetric Technique)即根据测定到达事先设定反应液的浊度变化(吸光度变化)值所需要的时间(Ta比浊反应法)或浊度变化(透过光量比)值所需要的时间(Tg:比浊时间分析法)的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系或浊度的(吸光度值)每分钟变化(吸光度变化mAbs/min)与细菌内毒素浓度成正比例关系(比浊反应速度法)而进行测量的一种分析方法。通常,浊度法一般是指动态浊度法,而且在日、美、欧等国有专用仪器,并通过美国FDA认可,其中作为动态比浊仪一般要求为:恒温槽(37±1℃)、光源、检测器及内置数据分析等。其中检测波长从80~660 nm,主要根据仪器的不同而各异,检测时间为60~90 min之间。由于国内对细菌内毒素定量检查法的研究起步较晚,专门用于定量的高灵敏度TAL(最低检测限是0. 006EU/ml)还未研制开发出来,还受细菌内毒素检查用水(内毒素的含量小于0. 005 EU/ml)、内毒素标准品质量不高等因素的制约,对仪器定量法研究较多且检测技术较为成熟的就是动态浊度法。本法收载于2000年版《中国药典》二部附录中,在2005年版《中国药典》二部附录中,将浊度法和显色基质法修订为光度测定法,作为测定内毒素含量的方法。
㈡ 有什么比较便捷的方法可以检测血液细菌内毒素
楼主，目前检测细菌内毒素的方法就是动态浊度法。建议使用“血液细菌内毒素检测试剂盒”，操作简便、快速，仅1小时可出检测报告。
㈢ 如何建立新药的细菌内毒素检查方法
[摘要] 目的：建立新药的细菌内毒素检查方法。方法：采用鲎试验检查法对新药中的细菌内毒素进行检查。结果：介绍了如何建立新药的细菌内毒素检查方法，重点是细菌内毒素检查限值的确认以及如何进行干扰试验。结论：细菌内毒素检查法为新药的质量控制以及应急检验提供了有益的基础。
[关键词] 新药；细菌内毒素检查法；干扰试验
[中图分类号] R927.12 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2011）11（b）-159-03
How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test
新药以细菌内毒素检查方法代替既往的家兔热原检查法是一个趋势，在药害事件的应急处理中有一定的应用价值，这也符合国际上对动物实验的“3R”原则（优化、减少、替代）的要求。现行细菌内毒素检查方法是1968年美国科学家Levin和Bang所建立的鲎试验法[1]。从开展内毒素检查的现状来看，部分单位未能参照《中国药典》2010年版二部的要求进行实验和设计，本文着重介绍在建立新药细菌内毒素检查法中容易出现问题的细菌内毒素限值的确定及干扰试验这两个环节，力图为新药的质量控制以及应急检验提供有益的参考依据。
1 新药细菌内毒素检查限值的确认
1.1 细菌内毒素检查限值的计算公式
新药细菌内毒素检查限值（L）的确定是整个方法学建立的前提和基础，现在一般按照《中国药典》2010版二部附录XI E进行确定[2]。计算公式为L=K/M，K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg・h）表示，非放射性注射剂K=5 EU/（kg・h），放射性注射剂K=2.5 EU/（kg・h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg・h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，成人体重按60 kg计算，体表面积为1.62 m2。部分抗肿瘤药物及抗生素的使用剂量以体表面积描述时，可将每平方米体表面积剂量乘以0.027，即可转换为每千克体重剂量。
1.2 细菌内毒素检查限值的确认程序
首先根据所研究的新药品种说明书，通过查阅最新版《临床用药须知》等相关权威资料，得到人用每千克体重每小时的最大供试品剂量（M值）并求出L值，将所求得的L值与相关的质量标准（《美国药典》、《英国药典》、《日本药局方》、《欧洲药典》）以及国家食品药品监督管理局颁布的转正标准或注册标准散件中关于该品种的细菌内毒素限值进行参考对比。
还有一种方法是参考该品种的热原检查剂量（可视为M值），因为热原剂量的设置一般为成人临床用量的1～3倍，与常用的安全系数3～10倍较为接近，这种参考热原检查剂量的做法在以前颇为盛行，现在已逐渐少用。
1.3 细菌内毒素限值计算的常见误区
1.3.1 将成人日均用量误作最大用量 大多数情况下，说明书或资料往往只提供了某药的单次或每日用量，实践中不少人往往将单次用量误作最大用量进行限值计算，所得限值明显偏宽。众所周知，除极少数情况（急性、重症患者用药）下的单次用量可作为最大用量外，多数情况的日常用量换算成最大用量，还需考虑一定的安全系数（一般取3～10倍）。
1.3.2 误将每日总用量当成每次最大用量 只根据说明书或资料提供的某药的每日总用量，未考虑该药品总量的静脉滴注时间已经远不止1 h，这样求得的限值难于真实反映实际限值，因为M值是反映人用每千克体重每小时能接受的最大供试品剂量，而非全日的总用量。
1.3.3 对于大输液的细菌内毒素限值确定过于按部就班 没有考虑大输液的特殊要求，大输液的主药成分只占其中很少的一部分，实际多为葡萄糖注射液或生理盐水注射液，如果按主药成分计算细菌内毒素限值的话，容易偏宽，因而如无特殊情况一般将热原检查剂量10 ml/kg视为最大临床用量，将大输液细菌内毒素限值定为0.5 EU/ml。
1.3.4 忽视滴注时带入的外源性细菌内毒素 某些新药在临床使用时是溶于大输液进行滴注的。假设某抗生素药品的规格是1 g/支，其使用方法是溶于5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h内滴注完毕。可参照下述方法计算该抗生素细菌内毒素限值，此时K=5 EU/（kg・h），因而60 kg的成人每小时体内可以接受细菌内毒素的最大量为300 EU，而在1 h内250 ml的5%葡萄糖注射液最大可带来125 EU的细菌内毒素，1 g的该药最多只能带入175 EU（125～300 EU）的细菌内毒素，因而该抗生素其细菌内毒素限值可定为0.175 EU/mg。如果按常规计算的话，求得限值为0.300 EU/mg。
1.3.5 没有考虑到主药外的其他成分 在细菌内毒素限值的确定过程中，特别是原料，要注意扣除主药外的其他成分（如金属离子：头孢噻肟钠中的钠，西司他丁钠中的钠），因为标准一般规定为每毫克中头孢噻肟或西司他丁所含的细菌内毒素量不得过多少EU，而制成的原料往往是含钠等其他成分的。
2 鲎试剂灵敏度复核试验
2.1 前期准备工作
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法（如强酸强碱浸泡法），但需经过确证不干扰鲎试验检查。
2.2 灵敏度复核试验
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。需要注意的是，当实测灵敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试剂灵敏度的标示值）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度，日常检验中部分检验者误将实测的灵敏度作为批鲎试剂的灵敏度来进行常规检查或干扰试验。
3 鲎试验检查的干扰试验
3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的确认
MVD是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，计算公式为MVD=C・L/λ，式中L为供试品的内毒素限值，λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度；C为供试品液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。
此处往往根据市售主要的鲎试剂灵敏度范围（0.03～1.00 EU/ml）来计算干扰试验中的有效浓度稀释范围。
3.2 干扰预试验
取本品1支（原料精密称取不低于10 mg的量），按照拟定内毒素限值，原料或注射用粉针加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD规定的系列浓度，注射液直接稀释至不超过最小有效稀释浓度的系列浓度，预试验时一般可取一个厂家灵敏度为0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鲎试剂，对供试品原液及其系列稀释液（供试品阴性对照，NPC）进行干扰检验，另外设立阳性对照（PC）、阴性对照（NC）、供试品阳性对照（PPC），每个浓度平行做两管，最终得出供试品（批号：20100802）在某浓度及以下浓度对鲎试验检查不产生干扰作用（PPC首次出现“++”的浓度）的结论。供试液的干扰预试验结果，见表1。
由表1可以看出，供试品在不高于20 mg/ml的浓度下不干扰鲎试验的检查。
3.3 正式干扰试验
按表2制备各系列溶液，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD的溶液，参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。
只有当供试品溶液和阴性对照溶液的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。当Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
4 排除供试液干扰的方法[3]
4.1 样品稀释法
选用较高灵敏度的鲎试剂，将供试品进一步稀释（低于最大有效稀释倍数）后进行干扰试验，一般情况下大部分的干扰作用均能得到有效控制。
4.2 调节pH法
测定供试液的pH值，若不在鲎试剂的有效缓冲pH范围（6.0～8.0），可选用一定浓度的HCl或NaOH将pH值调节至6.0～8.0，但要注意应进行方法学验证（干扰试验），确保不干扰鲎试验检查，且对内毒素检查结果无影响。
4.3 超滤法
通过专用超滤系统，将影响内毒素检查的药物小分子杂质滤除，内毒素则留存于滤器内，滤器内加入相应的内毒素检查用水进行检查，可在几乎不影响内毒素浓度的前提下尽量避免小分子药物的干扰作用。
4.4 其他方法
微温保持加热法；使用去G因子鲎试剂或厂家提供的专用抗增液对样品进行稀释（此时须进行干扰试验）。
5 常规检查
使用最大有效稀释倍数（MVD） 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液供试品溶液和供试品阳性对照溶液，进行细菌内毒素的常规检测。
6 讨论
建立新药品种的细菌内毒素检查法，首先要结合临床最大用量确定其细菌内毒素限值，应用两个厂家的鲎试剂对3批样品进行鲎试验检查（普通凝胶法或动态浊度法定量试验），如结果能证实样品在不低于最大有效稀释浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用，且样品的细菌内毒素常规检查结果为阴性，此时方可建立该品种的细菌内毒素检查法[4-7]。
根据临床最大用量规定及实验结果，将所研究的新药细菌内毒素限值定为每毫克主药（或每毫升）中含内毒素的量应小于若干EU。经干扰实验确证，该新药在某个浓度或低于该浓度时（但不低于最大有效稀释浓度MVC）对细菌内毒素检查无干扰作用。取本品3批，按拟定的标准检验，其内毒素检查结果均符合规定。
㈣ 细菌内毒素国家药典是怎么检测的
10版国家药典
检测内毒素可以用凝胶法
凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验
在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
以上摘自2010版中国药典《细菌内毒素检查法》
㈤ 细菌内毒素的检验方式有什么
细菌内毒素检查法是判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。 内毒素(Endotoxin)即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A。菌体死亡崩解后释放出来。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
㈥ 内毒素的检测方法和原理
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法
细菌内毒素检查包括浊度法和显色基质法 供试品检测时 可使用其中任何一种方法进行试验 当测定结果有争议的时候 除另有规定外 以凝胶法结果为准
本实验操作过程硬防止微生物和内毒素的污染
凝胶法鲎试剂原理 鲎试剂为鲎科动物东方鲎变形细胞溶解物的冷冻干燥品 内含能被微量细菌内毒素激活的凝胶酶原和凝固蛋白源 在适宜的条件下（温度、pH值及无干扰物质）细菌内毒素能激活鲎试剂中的凝固酶原 使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶 凝胶法鲎试剂是根据凝集反应所形成凝胶的坚实程度来限量检测细菌内毒素