荧光研究方法

A. 什么是生物荧光标记法荧光标记法在制药领域又有什么应用

荧光标记法（Fluorescent Labeling）是利用荧光蛋白或荧光蛋白基因作为标志物对研究对象进行标记的分析方法。常用的荧光蛋白为绿色和红色两种，绿色荧光蛋白（GFP）常用的是来源于发光水母的一种功能独特的蛋白质，分子量为27kD，具有238个氨基酸，蓝光或近紫外光照射，发射绿色荧光。红色荧光蛋白来源于珊瑚虫，是一种与绿色荧光蛋白同源的荧光蛋白，在紫外光的照射下可发射红色荧光，有着广泛的应用前景。其中应用比较广泛的还是绿色荧光蛋白。2008年，美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士钱学森堂侄钱永健，美国哥伦比亚大学生物学教授马丁·沙尔菲，日本有机化学家兼海洋生物学家下村修三人由于在绿色荧光蛋白上的贡献而获得化学诺贝尔奖，充分肯定了绿色荧光蛋白在生物研究中的重要地位。但如果应该标记的对象是，则常常是在5’-或3’-端标记荧光素（6-FAM），在荧光显微镜就能观察到现象。

荧光标记法作为探究生物不同生理过程的方法，与同位素示踪法的作用相似，但它有其后者所不能企及的优点。荧光标记法常用绿色荧光蛋白（GFP）为目标蛋白，通过转基因技术一起构建到载体上，可跟踪和判断生物细胞的分子变化。GFP相对较小，与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能；基因序列比较短，可以进行高效转化；GFP基因没有物种特异性，在原核、酵母、植物以及动物细胞中都获得了成功表达，大量表达对细胞没有毒性；GFP发光是蛋白质本身发光，无需底物，且荧光稳定，适用于定量测定与分析。在科学研究中利用这些特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等。绿色荧光蛋白不仅在细胞生物学与分子生物学领域得到广泛的关注和应用，而且经过修饰的绿色荧光蛋白基因还可作为生物探针，对哺乳动物细胞、酵母菌细胞及细菌进行活细胞的基因定位[1]。

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B. 生物荧光标记法是什么

荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当从激发态恢复基态时，发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染，操作简便等优点，使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。

荧光标记物质在蛋白的功能研究、药物筛选等领域也有着广泛的应用。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激酶、磷酸酶、肽酶等）。因此，多肽的荧光修饰，同样是多肽合成领域的重要内容。

下面是一些常用的多肽修饰荧光物质：

C. 紫外可见分光光度法与荧光光度法的区别

一、指代不同

1、可见分光光度法：通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

2、荧光光度法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。

二、特性不同

1、可见分光光度法：具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测定都采用分光光度法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。

2、荧光光度法：由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收的紫外-可见光波长和发射光的波长也不同，同一种物质应具有相同的激发光谱和荧光光谱，将未知物的激发光谱和荧光光谱图的形状、位置与标准物质的光谱图进行比较，即可对其进行定性分析。

三、作用不同

1、可见分光光度法：在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长 ，然后以此波长 的光为光源（单色光），进行吸光度A的测定，是朗伯比尔定律用于定量分析的首要条件。

2、荧光光度法：测量物质的荧光强度可对其进行定量测定。荧光分析法的特点是灵敏度高、选择性好、样品用量少和操作简便。

D. 荧光技术的应用

荧光技术在生物化学及分子生物学研究中应用主要包括以下几个方面：
1、物质的定性：不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。与吸收光谱法相比，荧光法具有更高的选择性。
2、定量测定：利用在较低浓度下荧光强度与样品浓度成正比这一关系可以定量分析样品中荧光组分的含量，常用于测定氨基酸、蛋白质、核酸的含量。荧光定量测定的一个优点是灵敏度高，例如维生素B2的测定限量可达1毫微克/毫升，这一优点使测定时所需要样品量大大减少。
这种定量测定方法还可应用于酶催化的反应，只要反应前后有荧光强度的变化，就可用来测定酶的含量及酶反应的速率等。
3、研究生物大分子的物理化学特性及其分子的结构和构象：荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的荧光发色团（如色氨酸、酪氨酸、鸟苷酸等，此类荧光称为内源荧光）以外，可将一些特殊的荧光染料分子共价地结合或吸附在生物大分子的某一部位，通过测定该染料分子的荧光特性变化来研究生物大分子，这种染料分子被称为“荧光探针”，它们发出的荧光一般称为外源荧光。荧光探针的应用，大大地开拓了荧光技术在分子生物学中的应用范围。
4、利用荧光寿命、量子产率等参数可以研究生物大分子中的能量转移现象：通过该现象的研究，可以获得生物大分子内部的许多信息，如分子内两荧光基团D, A之间的临界距离可根据弗尔斯特公式来测定，弗尔斯特(Förster)公式如（6）式所示：
即是两荧光发色团之间的能量传递的速率KDA和它们之间的临界距离Ro的六次方成反比。式中的KDA、K、J等均可由荧光寿命、量子产率及荧光强度的测定来推算，从而可以得知两基团之间的距离。
以往人们常用荧光偏振做指标来研究生物大分子动力学。近年来人们趋于用荧光偏振随时间的衰减来研究这些问题。在这种方法中，激发光不是一连续的面偏振光，而是一偏振的光脉冲，因此测得的F∥和F是在两个不同方向上偏振的荧光随时间的衰减，它既和荧光寿命τ有关，又与分子在溶液中的运动有关，因此常表示为F∥（t）和 F⊥（t）。由它们可得一相当重要的物理量——各向异性参数A（t）。
由A（t）可推测生物大分子的形状、分子转动弛豫时间（即从一个定向的状态到一个无定向状态所要的时间），进而可以推知生物大分子的大小、分子在溶液中的转动角度和时间之间的函数关系。由这些结果可以研究分子之间的相互作用、分子间结合的紧密程度、蛋白质、核酸分子的解聚程度等等。
另外，荧光技术在免疫学中亦有广泛的应用。最重要的就是荧光抗体法。将某些荧光染料与血清抗体相结合，这种标记的抗体仍可专一地与相应抗原发生结合，形成的复合体具有荧光特性，从而可以确定抗原或抗体的存在及其含量。
5、在医疗诊断中的应用之DNA测序荧光染料： DNA序列的破译是新世纪基因工程研究的重要前提。近年来，DNA测序的新技术、新方法不断涌现，荧光染料标记DNA的基因芯片技术使其中最引人注目的。在荧光染料标记DNA测序技术中所用的荧光染料要求是：吸收光谱应在可见光区发射，光谱尽量靠近红光区，以避免DNA自身的蓝色荧光干扰；能发射足够强度的荧光；不影响DNA片段在电场中的泳动；染料本身无毒害。
目前用于DNA序列的荧光染料主要是咕吨类化合物、菁类化合物、1,8-萘酰亚胺类染料以及二吡咯烷硼二氟类染料，荧光多为黄、绿、红色，荧光量子产率较高。
6、荧光技术在医疗诊断中的应用之光动力治疗用色素： 将特定的光敏感材料注入体内，它富集在肿瘤组织内，在正常细胞组织被代谢排除体外。用适当的光激发，可以检测出癌症病处，再用特定波长的激光激发，产生能破坏肿瘤组织的自由基物质或引发氧分子转变为能杀灭癌细胞的单线态氧，达到治疗的目的。
光动力疗法是除手术、化疗和放射疗法之外的第四种治疗肿瘤的方法。它副作用小，不会引起外貌损伤。由于光动力疗法具有高度的选择性，破坏肿瘤组织目前临床使用的光敏化材料多为卟啉类化合物。由于光动力疗法的优异性能，目前已成为世界各国的研究热点。

E. 紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点

1、原理不同：

（1）紫外分光光度计，就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。

（2）荧光分光光度法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定。可根据不同的物质其组成与结构调整所吸收的紫外-可见光波长和发射光的波长。

2、应用范围不同：

（1）紫外分光光度计主要用于实验室。例如：鉴定物质：根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长λmax和摩尔吸收系数ε是检定物质的常用物理参数。这在药物分析上就有着很广泛的应用。与标准物及标准图谱对照等。

（2）荧光分光光度法的灵敏度通常比分光光度法高2〜3个数量级。在卫生检验、环境及食品分析、药物分析、生化和临床检测等方面有着广泛的应用。

3、所用灯不同：

（1）紫外光区通常用氢灯或氘灯。

（2）荧光分光光度法通常用钨灯或卤钨灯。

4、优缺点：

（1）紫外分光光度计高自动化程度，维护方便、操作简便、效率高。

（2）荧光分光光度法具有检测灵敏度高、专属性较强和使用简便等特点，常用于微量甚至痕量毒物的定量分析。

(5)荧光研究方法扩展阅读

紫外-可见分光光度计的结构与功能：

由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示系统五大部分组成。

（1）光源：是提供符合要求的入射光的装置，有热辐射光源和气体放电光源两类。热辐射光源用于可见光区，一般为钨灯和卤钨灯，波长范围是350~1000nm；气体放电光源用于紫外光区，一般为氢灯和氘灯，连续波长范围是180~360nm。

（2）单色器：功能是将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束，它是分光光度计的心脏部分。

（3）吸收池：又称比色皿，供盛放试液进行吸光度测量之用，其底及两侧为毛玻璃，另两面为光学透光面，为减少光的反射损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。根据材质可分为玻璃池和石英池两种，前者用于可见光光区测定，后者用于紫外光区。

（4）检测器：是将光信号转变为电信号的装置，测量吸光度时，并非直接测量透过吸收池的光强度，而是将光强度转换为电流信号进行测试，这种光电转换器件称为检测器。

（5）信号显示系统：是将检测器输出的信号放大，并显示出来的装置。

F. 什么是荧光标记法

荧光物标记法，神经纤维的末梢可以吸收很多荧光化合物或荧光染料,经轴突逆向运输到细胞体内,从而建立逆行荧光标记法。例如:Kuypers等(1977)用这种方法在荧光显微镜下根据所用荧光物标记物特有的波长显示吸收荧光物的神经细胞。

目前用于神经元标定的荧光物质有十多种。可以根据实验的要求进行单荧光物、双标定和三标定。后者可以用来做神经元轴突侧枝投射的追踪。

(6)荧光研究方法扩展阅读

1. SYBR green I染料

反应体系中，加入过量SYBR

荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的扩增完全同步。

其优点是对模板没有选择性，使用方便，非常方便，但也易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，可以通过溶解曲线的分析，优化反应条件。

2. Taqman 探针

目前在Real-time

Q-PCR中最广泛使用的Tagman系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶（例如Taq酶）的5'-3'活性所降解，探针的5'端有一荧光报告基团，3'端有一荧光淬灭基团。

当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5'端得报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。

3. Scorpions

它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不发荧光。

变性阶段，探针的发夹结构会解开，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。在探针的设计上，要求绝对保守，长度为25-32bp，Tm在68-70度之间，探针的5'端不能为G，避免多个碱基同时出现，尤其要避免4个G同时出现，另外，探针应靠近上游引物。

4. 分子信标

分子信标是（Molecular

beacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。

荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外光而不是可见光形式释放出来。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构。

当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹装，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激光分子。

G. 荧光分析法为什么比紫外-可见分光光度法有更高的灵敏度

荧光分析法的最大特点是灵敏度高，对某些物质的微量分析可以检测到10⁻¹⁰克数量级，如污水中的银含量用荧光分析法可以检测到10⁻¹⁰克，汞可以检测到10⁻¹⁰克。对一些激素亦可检测到10⁻¹⁰克。

荧光分析的灵敏度比分光光度法的灵敏度高2~3个数量级，这是由于荧光分析的荧光和入射光之间成直角，而不在一条直线上，所以是在黑背景下检测荧光。而分光光度法的接收器与入射光在一条直线上，所以它是在亮背景下检测。因此荧光分析法比分光光谱法灵敏度高。

分光光谱法的灵敏度一般只能检测到10⁻⁸克，两者相差三个数量级。当然荧光分析法比起带电子显微镜的电子探针法灵敏度又低一些，然而电子探针仪器价格昂贵，使用不方便。

(7)荧光研究方法扩展阅读

荧光分析法

由于有些物质本身不发射荧光（或荧光很弱），这就需要把不发射荧光的物质转化成能发射荧光的物质。例如用某些试剂（如荧光染料），使其与不发射荧光的物质生成络合物，各种络合物能发射荧光，再进行测定。因此荧光试剂的使用，对一些原来不发荧光的无机物质和有机物质进行荧光分析打开了大门，扩展了分析的范围。

紫外-可见分光光度法应用范围包括：

1、定量分析，广泛用于各种物料中微量、超微量和常量的无机和有机物质的测定。

2、定性和结构分析，紫外吸收光谱还可用于推断空间阻碍效应、氢键的强度、互变异构、几何异构现象等。

3、反应动力学研究，即研究反应物浓度随时间而变化的函数关系，测定反应速度和反应级数，探讨反应机理。

4、研究溶液平衡，如测定络合物的组成，稳定常数、酸碱离解常数等。

H. 荧光标记法是什么

荧光物标记法，神经纤维的末梢可以吸收很多荧光化合物或荧光染料,经轴突逆向运输到细胞体内,从而建立逆行荧光标记法。

例如：Kuypers等(1977)用这种方法在荧光显微镜下根据所用荧光物标记物特有的波长显示吸收荧光物的神经细胞。

相关信息：

荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当从激发态恢复基态时，发出荧光。

荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染，操作简便等优点，使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。