‘壹’ 对药产生抗体怎么办啊
是对药产生抗药性吧？通常细菌对药产生抗药性和细菌耐药有关，有两种情况：1.未做培养盲目用药，细菌对所用药物耐药；2.未规范服药体内药物量达不到应有的药效浓度（当然质量不合格的药物也会出现此种问题）。
解决：停药后3-5天做做培养，了解细菌的耐药性，针对用药；无条件培养的话找有经验的医生分析以前的用药后换药治疗。
‘贰’ 什么是耐药性
耐药性又称抗药性，一般是指病原体对药物反应降低的一种状态。是由于长期使用抗菌药物，应用剂量不足时，病原体通过产生使药物失活的酶、改变膜通透性阻滞药物进入、改变靶结构或改变原有代谢过程而产生的。耐药性严重者可使多种抗菌药物失效。
‘叁’ 怎样监测病原物抗药性
因为大多数植物病原菌的致病阶段处于单倍体时期，且繁殖系数大、周期短，所以植物病原菌抗药性是发生速度最快、为害最严重的农业有害生物。同时，病原菌抗药性不容易被农民肉眼识别，必须通过实验室精密测定才能鉴别和诊断，因此，世界各国投入杀菌剂抗性监测研究的人力和财力也最多。
病原物抗药性监测是指测定自然界病原物群体对使用药剂敏感性的变化。包括在各地定点连年系统测定和对有抗药性怀疑的地方临时采集标本测定。最常用的监测方法是测定病原物生长量与药剂的效应关系。常见方法有菌落直径法，即在含有系列浓度杀菌剂培养基上测量药剂对菌落线性增长速率的抑制效应。采用干重法测量在含药的液体培养基中培养的菌体干重增长速率与药剂的效应，更能够准确反映杀菌剂对菌体生长的抑制作用。不过这种方法比较繁琐，工作量大。当病菌以孢子繁殖生长时，亦可采用浊度法测定细胞生长量与药剂的效应。
采用临界剂量或鉴别剂量是检测和测量抗药性广度的常用方法。如在含有完全能抑制野生敏感菌生长的杀菌剂浓度的培养基平板上，涂抹病原物混合孢子或其他繁殖体，进行适当培养后，检查病菌的生长情况，计算抗药性菌株的出现频率。
采用孢子萌发法也可测定药剂对不同菌株孢子萌发的抑制来鉴别抗药性。但是，许多内吸性杀菌剂并不阻止孢子萌发，这时应该考虑对芽管形态和菌体发育的作用。
活体测定法是指把病菌接种到经杀菌剂处理过的植株或部分组织上，评估药剂处理剂量与发病程度间的效应关系。这种活体测定方法不仅是测定专性寄生菌抗药性的唯一方法，而且是验证病菌在培养基上对药剂敏感性差异是否与在寄主上的反应差异一致必不可少的方法。例如，麦角甾醇生物合成抑制剂和二甲酰亚胺类杀菌剂在离体条件下，很容易引起真菌的抗性突变，但是，这些突变体对寄主的致病性也常随之降低。此外，在培养基上能对叶枯唑表现抗药性的稻白叶枯病菌，则失去了致病能力，而在经叶枯唑、敌枯唑等处理的水稻上表现抗性的菌株，在培养基上反而不表现抗性。
已知有些杀菌剂对菌体的呼吸作用或生物合成过程等生命过程有显着抑制作用，可以用生化测定法，测定不同杀菌剂浓度对这些过程影响程度的差异来比较不同菌株的敏感性。或者基于靶标蛋白三维结构变化而丧失与药剂的亲和性抗药性机制，制备和利用单克隆抗体进行免疫检测。最近，也有根据单核苷酸变异而产生抗药性的机制使用DNA探针杂交和PCR指纹图谱等分子生物技术进行病原物抗药性监测的成功例子。定量PCR检测技术的开发和应用，使病原菌的抗药性早期监测和预警成为可能。
一种病原物对某一农药的敏感性还常随着个体的遗传差异、培养基组分、琼脂的质量、温度、pH、测试环境和方法的不一致而有变化。如在含乙磷铝的PDA培养基上，疫霉的生长不受影响，但是在不含磷酸盐的合成培养基上，这种真菌对药剂则变得敏感。因此，某种药剂—病原物组合的抗药性测定，不但要选用适当的方法和条件进行，而且被怀疑有抗药性的菌株也必须用测得敏感基线同样的方法和条件进行各种测试，最好在所有抗药性测定中均包含有一个已知敏感的参考系。
在测定某种病原物各个个体对农药不同浓度的效应后，如何进一步鉴别和评估它们的抗药性，常用的标准有3种：第一种是用同一浓度测定各个体对药剂的反应；第二种是测定最低抑制浓度；第三种是测定产生相同效应的浓度，如抑制菌体生长发育或致病50%的有效浓度（EC50）。
第一种标准常会过高地评估抗药性水平或抗性程度。因为病菌对同一剂量的效应有时差异很大。第二种标准也有缺陷。因为有的菌株抗药性水平很高，如灰霉菌（Botrytiscinerea）对多菌灵的抗药性，难以用最低抑制浓度来评估抗药性水平，有些杀菌剂即使在很高浓度下也不能完全抑制菌体生长，同样不能采用这种分析标准。但灰霉野生敏感菌株对多菌灵特别敏感，亦可用最低抑制浓度作为鉴别抗性和敏感菌株的标准。采用第三种分析标准，根据杀菌剂的剂量与抑制菌体生长发育的效应关系，得出剂量与生长抑制率之间的回归方程，然后根据对测定菌株和标准野生敏感菌株的相同抑制生长发育百分率的药剂浓度的比较，鉴别抗性菌株并分析抗性水平。有些病菌对某些药剂的敏感性是由多个微效基因决定的，表现出数量遗传性状，虽很难评估某一菌株的抗性水平，但可以通过测定某地区用药前病原群体（一般需测100个菌株）对药剂的敏感性分布，用药后再测定病原群体的敏感性，由此可根据平均EC50之比来评估某一地区病原群体的抗性水平。
‘肆’ 指出ELISA有哪几种常用方法各种方法在操作上有什么异同
也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，操作步骤如下：
1） 将特异性抗体与固相载体联结。RF是一种自身抗体，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇。
2;夹心复合物"，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去，以提高试验的特异性.间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，测知标本中抗原的量，直接包被不易成功，可采用捕获包被法、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体。
4.竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质;（conjugate）：
1）将特异性抗原与固相载体联结，故称为间接法。操作步骤如下，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。此法中受检标本不需稀释。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
5.竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，应注意可测范围的最高值，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质;（immunosorbent）、ayr，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
1.双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果、adw，固相载体上只留下特异性抗体；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"：（1）固相的抗菌素原或抗体，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，在检测过程中标本须先行稀释（1。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，可直接用于测定，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3） 加酶标抗体。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，已被列为这类试剂的一项考核指标。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。
3。
4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色、AFP。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，寻找合适的标记方法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，试验中也发生假阳性反应:40~1:200）。IgG的吸附性很强，即"免疫吸附剂"，例如HBsAg，但应尽可能予以纯化。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E，从而消除RF的干扰。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。竞争法测抗体有多种模式，因此其敏感度相对高于间接法；（3）酶反应的底物、ayw4个亚型，因其不能形成两位点夹心，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清、HBeAg，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，以避免过高的阴性本底影响结果的判断，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2） 加受检标本、药物等ELISA测定多用此法。
6.捕获包被法测抗体
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式。
类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
7.ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性
‘伍’ 抗体药物的作用过程及特点是什么
特异性结合是抗体药物的作用的特点，相应的抗原表面均含有抗原表位，也就是抗原决定基，这个表位含有和抗体结合的对应基因位点，当抗原和抗体结合时，就会紧密连接并将抗原吞噬直至崩解或与抗原结合成大分子物质，被免疫系统视为大分子异物排出体内。
机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它（免疫球蛋白不仅仅只是抗体）是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。
‘陆’ 抗体怎么和另外的一个蛋白质偶联
我曾经做过小分子和蛋白质的偶联，有一些自己总结的综述，你可以参考以下：
人工抗原合成常用的载体
载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素(antibiotic)或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提；其次，载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子；载体还应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能；而且载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。
常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4，大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下，一部分成为质子，另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性，可与半抗原中的对应基团结合。当然，这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境。牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸，故有许多自由氨基存在，且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度。此外，这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时，其活性基团仍呈可溶状态，因此，这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质[30]。近年来，有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体，表现出能增加半抗原的免疫原性，从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加，被广泛应用[31，32]。
1.2.2人工抗原合成方法
小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响。通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合，不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法，常用的方法如下：
1.2.2.1分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联
1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐的中间体，再与蛋白质的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物
2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物，然后再与蛋白质上的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物（见图1.5）。EDC被称作零长度交联剂之一，因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子。
此连接方法十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中，然后加入水溶性碳化二亚胺，搅拌1～2h，置室温24h，再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基，可通过某些化学反应引入羧基。在引入羧基后，也可用上述方法进行偶联。
1.2.2.2含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及pH6.0～8.0内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。
2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物（见图1.6）。
1.3.2.3含羟基半抗原的偶联
1）琥珀酸酐法：半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯(带有羧基的中间体)，再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合，在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基（图1.7）。
2）羰基二咪唑法：N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂，在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33]。含羟基的分子同羰基二咪唑反应，形成中间体咪唑基甲酸酯，它能和N-亲核试剂反应，得到N-烷基化的甲酸酯键，通常蛋白质通过N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物，具有极好的化学稳定性。
1.2.3影响人工抗原质量的因素
人工抗原免疫原性的好坏，与多种因素有关。对不同的物质，影响免疫原性的因素并不完全相同，常常需要在得到抗体后对免疫偶合物的具体合成方法进行重新调整。但总的说来，影响人工抗原质量的因素主要有：
1) 偶联比
偶联比过去人们认为，联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多。但实验证明，过多的半抗原并不能得到预期的结果，这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多时，可能不利于载体与淋巴细胞表面结合，不能使载体引起免疫反应。实际上，每个载体分子连接上一个半抗原分子就足以产生抗体。有人认为，以BSA为例，连接到蛋白分子上的半抗原数以5～20为宜。而荣康泰等用不同的载体制备对氧磷的人工抗原时，却发现各种载体的分子量不论是否接近，最佳结合比都不尽相同，并建议为了取得最佳免疫效果，应逐个确定各种载体的最佳结合比。
2) 偶联桥
有研究者认为，一定长度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所产生抗体专一性的增强，如吴颂如等［34］发现，通常愈远离载体蛋白的基团，其特征反应愈明显。但也有一些研究者发现，手臂结构对免疫检测经常有不利的影响，有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强，对待测小分子亲和力却很弱，因此造成对特异性抗体检测的干扰。Sionf等［35］认为可以采取两种方法来避免因偶联桥而造成的不足：一是半抗原上相同位点结合蛋白质，但免疫原和包被抗原用不同的偶联桥；二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥，但与不同半抗原位点结合。Frieia［36］研究农药酶免疫分析多年，他认为最好的偶联桥是3～6个直链的碳原子结构。
3）半抗原的分子空间结构
用来作半抗原的分子最好有分支结构，直链分子难以产生抗体。此外，有些抗生素(antibiotic)或农药有多个可供蛋白质偶联的位点，但据研究报道，不同位点与蛋白质结合制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别，这可能是因为不同位点结合导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因。如合成灭草松和吡虫啉人工抗原时，当利用半抗原不同位点与载体结合时产生的抗体效价和亲合力明显不一样[37、38]。因此，如果一个分子内有多个不同的结合位点时，最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后，通过比较，筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。
1.2.4人工抗原的质量评定
1.2.4.1浓度测定
人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）。因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含量（mg/ml）是一致的（这里也反映出人工抗原越纯，检出的浓度值愈准确）。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法等。这里就不一一介绍了。
1.2.4.2纯度鉴定和结构分析
鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法，如果人工抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，则可初步证明人工抗原合成成功。
半抗原与载体分子反应后是否真正的连接在一起，如果发生连接，它们的连接基团又在哪里。这些问题可以通过红外吸收光谱图或质谱分析得到解决。
利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。前者适应范围广，但鉴别的灵敏度较低。后者是用于大分子大分子酶标记物和某些半抗原偶联物的纯度鉴定。如果电泳图谱上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达到电泳纯，否则说明人工抗原中含有有利的未偶联的物质。
1.2.4.3偶联比的测定
1）分光光度法
根据赵肃清等人的说法［39］，如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收，如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm，则与蛋白质肽的吸收发生重叠)，则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数，计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数（可以参考文献[30]中的279-283页计算）。
2）标记抗原示踪法
在制备半抗原-蛋白质结合物时，向反应液中同时加入一定量的标记半抗原，反应完成后，未结合的半抗原经透析除去，测定透析前后的放射性强度，就可以计算出结合百分比。再依反应时加入的蛋白质摩尔数即可知半抗原结合到蛋白质上的分子数。如果不用透析，也可取一定量反应后的溶液，加入蛋白质沉淀剂或有机溶剂以提取结合的半抗原，测定半抗原-蛋白质结合物的放射性。同样可以计算出半抗原与蛋白质的偶联比。
还有不明白的地方吗？↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓
‘柒’ 可用于elisa的抗体有哪些类型
ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原
或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情
况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要
有以下几种类型：
2.2.1 双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合
的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合
物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动
物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相
载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标
抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标
抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应
后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的
吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现
象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重
时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常
增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用
高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可
用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗
体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含
有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用
F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体
夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小
分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2.2.2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应
的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需
稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采
用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
2.2.3 间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗
体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗
体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程
中被洗去。
3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗
体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，
固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包
被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结
果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发
生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过
E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物
质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反
应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的
特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体
上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质
（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检
测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
2.2.4 竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特
异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体
量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯
度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被
法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的
杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本
和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本
与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的
抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法
进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相
抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
2.2.6 捕获包被法测抗体
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断(early diagnosis)中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或
IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的
IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人
IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的
干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕
获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入
抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作
用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
（HAV）抗体的检测模式见图2-7。
类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和
IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
2.2.7 ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子
量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量
244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分
子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，
其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生
物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲
和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系
统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶
标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性
糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的
链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通
ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。