噬菌体研究方法是什么

‘壹’ 如何测定烈性噬菌体的一步生长曲线

一步生长曲线
定量描述毒性噬菌体生长规律的实验曲线称为一步生长曲线。是研究病毒复制的一个实验，最初为研究噬菌体复制而建立，现已推广到动物病毒及植物病毒复制的研究中。具体操作是将适量病毒接种于高浓度敏感细胞培养物，或高倍稀释病毒细胞培养物，或以抗毒血清处理病毒细胞培养物以建立同步感染，以感染时间为横坐标，病毒的效价为纵坐标绘制出的病毒特征曲线，即为一步生长曲线。一步生长曲线分为潜伏期、裂解期和平稳期。
一步生长曲线不同阶段。
潜伏期：
指噬菌体的核酸侵入宿主细胞以后至第一个成熟噬菌体粒子
装配前的一段时间。它又可以分为两个阶段：
1、隐晦期：指在潜伏期前期认为的（用氯仿等）裂解宿主细胞以后，此裂解液仍无侵性的一段时间，这时细胞正处于复制噬菌体核酸和合成蛋白质衣壳的阶段；
2、胞内累积期：即潜伏期的后期，指在隐晦期后，若认为的裂解细胞，其裂解液已呈侵染性的一段时间，这意味着细胞内已经开始装配噬菌体粒子，此时电镜可以观察到。
裂解期：
紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急
速增加的一个阶段。噬菌体或者其它病毒粒因只有个体装配而不能存在个体生长，再加上若宿主细胞裂解的突发性，因此，从理论上来说，其裂解是瞬间出现的。但是事实上因为宿主群体中各个细胞的裂解不可能是同步的，故出现较长的裂解期。
平稳期：
指感染后的宿主细胞已经全部裂解，溶液中噬菌体的数目达
到最高峰，在这个时期，每一个宿主细胞释放的平均噬菌体粒子数即为裂
解量。
实验方法
一步生长曲线的实验方法如下：先把在对数期生长的敏感细菌悬浮液与适量的噬菌体混合，通常噬菌体和细菌的混合比例为1:10，避免几个噬菌体同时侵染一个细菌细胞。经数分钟吸附后，混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清，以中和尚未吸附的噬菌体。然后再用培养液进行高倍稀释，以免发生第二次吸附和感染。培养后定时取样，将含噬菌体的样品与敏感细菌混合，在平板上培养，计算噬菌斑数。结果可见，在吸附后的开始一段时间内（5～10min），噬菌斑数不见增加，说明噬菌体尚未完成复制和组装，这段时间称为噬菌体的潜伏期。紧接着在潜伏期后的一段时间（感染后20～30min），平板中的噬菌斑数突然直线上升，表示噬菌体已从寄主细胞中裂解释放出来，这段时间称为裂解期。每个被感染的细菌释放新的噬菌体的平均数称为裂解量。当宿主全部裂解，溶液中的噬菌体的效价达到最高点时称为平稳期。
结论
通过一步生长曲线可以得出病毒的潜伏期和裂解量。潜伏期是毒粒吸
附细胞受到感染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间。裂解量是每个受染
细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目，其值等于稳定期受染细胞所释放
的全部子代病毒数目除以潜伏期受染细胞的数目，即等于稳定期病毒效价
与潜伏期病毒效价之比。single burst curve 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线
。其基本步骤是用噬菌体的稀悬液感染高浓度的宿主细胞，以保证每个细胞
至多不超过一个噬菌体吸附。数分钟后中止吸附并稀释后置于该细菌最适生长温度下培养。在一定时间内，每隔数分钟取样作效价测定。以效价为纵坐标，培养时间为横坐标所绘成的曲线即为一步生长曲线，它可以反映每种噬菌体的三个最重要的特性参数：潜伏期、裂解期、裂解量。
双层平板法
又叫双层琼脂平板法
先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定
稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。
方法:
双层琼脂平板法
1、 倒下层琼脂融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
2 、倒上层琼脂融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
3、 恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
4 、观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑——噬菌斑。

‘贰’ 什么是噬菌体

噬菌体是感染细菌、真菌、藻类 、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。本世纪初在葡萄球菌和志贺菌中首先发现。作为病毒的一种，噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小、不具有完整细胞结构、只含有单一核酸。

可视为一种“捕食”细菌的生物。噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖。

一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制 。噬菌体是病毒的一种，其特别之处是专以细菌为宿主，较为人知的噬菌体是以大肠杆菌为寄主的T2噬菌体。

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噬菌体的发现历史：

1915年，弗德里克· 特沃特担任伦敦布朗研究所所长。特沃特在研究中力图寻找用于天花疫苗的痘苗病毒的变异株，这种变异株可能在活细胞外介质中复制。他在一项试验中将一部分天花疫苗接种给一个含营养琼脂的培养盘。

虽然这种病毒未能复制，但是细菌污染物在琼脂盘中生长很快。特沃特继续进行他的培养并注意到，一些细菌菌落显示出“带水的样子”。

这样的菌落做进一步培养时也不再能复制。特沃特把这种现象称为透明转化。他接着证明用透明转化原理感染一个正常的细菌菌落会把这种细菌杀死。这种透明实体很容易通过一个陶瓷过滤器，可被稀释一百万倍，当放在新鲜细菌上的时候就会恢复它的实力，或者说滴度。

‘叁’ 噬菌体侵染细菌实验步骤

有四个步骤，分别是：

1、培养用p32和s35 标记的大肠杆菌，再用此大肠杆菌培养噬菌体。p32用于标记噬菌体蛋白质，s35 用于标记噬菌体DNA。

2、用培养后的p32和s35噬菌体侵染未被标记的的大肠杆菌。

3、培养物离心，分离。

4 、分别对上清液和沉淀物的放射性进行检测。上清液中有S35，而沉淀中几乎没有；沉淀中有P32而上清液中几乎没有。

Alfed Hershey和Martha Chase（1952）将宿主大肠杆菌细胞分别放在含放射性同位素35S或32P的培养基中，用35S标记蛋白质，32P标记蛋DNA。宿主细胞在生长过程中就被35S或32P标记上了。然后用T2噬菌体分别感染被35S或32P标记的细菌，并在这些细菌中复制增殖。

宿主菌裂解释放出很多子代噬菌体，这些子代噬菌体也被标记上35S或32P。然后用分别被35S，或32P标记的噬菌体去感染没有被放射性同位素标记的宿主菌，然后测定宿主菌细胞带有的同位素。被35S标记的噬菌体所感染的宿主菌细胞内很少有35S，而大多数35S出现在宿主菌细胞的外面。

也就是说，35S标记的噬菌体蛋白质外壳在感染宿主菌细胞后，并未进入宿主菌细胞内部而是留在细胞外面。被32P标记的噬菌体感染宿主菌细胞后，测定宿主菌的同位素，发现32P主要集中在宿主菌细胞内。所以噬菌体感染宿主菌细胞时进入细胞内的主要是DNA。

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一、噬菌体核酸特点：

ss RNA：噬菌体中所含的核酸是单链RNA。

ds RNA：噬菌体中所含的核酸是双链RNA。

ss DNA：噬菌体中所含的核酸是单链DNA。

ds DNA：噬菌体中所含的核酸是双链DNA。

二、噬菌体繁殖特点

1、毒性噬菌体

指在宿主菌体内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。毒性噬菌体的增殖方式是复制，其增殖过程经历吸附穿入、生物合成和成熟释放3个阶段。

进入菌细胞内的噬菌体核酸首先经早期转录产生早期蛋白质，并复制子代核酸，再进行晚期转录产生噬菌体的结构蛋白。子代噬菌体达到一定数量时，由于噬菌体合成酶类的溶解，菌细胞突然裂解，释放出的噬菌体再感染其他敏感细菌。

2、温和噬菌体

感染宿主菌后并不增殖。其基因整合于细菌染色体上，即前噬菌体，随细菌染色体的复制而复制，并随细菌分裂而分配至子代细菌的染色体中。温和噬菌体有溶原性周期和溶菌性周期，可偶尔自发地或在某些理化或生物因素地影响下，整合的前噬菌体脱离宿主菌染色体，进入溶菌性周期导致细菌裂解，并产生新的成熟噬菌体。

‘肆’ 检测噬菌体存在的方法

1、将细菌培养液涂平板，如果有噬菌斑说明有噬菌体。如果提取噬菌体的核酸物质，应该大量培养噬菌体，然后离心去除细菌碎片，转移上清后用氯仿-乙醇法即可。
2、有的噬菌体可能是溶源性的，已经整合到细菌染色体上了，可以试试不同的条件把它诱导出来，像是UV照射，高温之类的。
3、如果噬菌体的背景清楚的话，可以设计引物用分子生物学的方法来检测噬菌体核酸。
4、“针对于溶源性的噬菌体有没有相关的文献介绍把它诱导出来的方法。”用丝裂霉素也可以诱导出来

‘伍’ 在赫尔希和蔡斯的噬菌体实验中采用的实验方法是 在理论上，上清液放射性该为0，其原因是

在赫尔希和蔡斯的噬菌体实验中采用的实验方法是同位素标记法。
在理论上，上清液放射性该为0，其原因是：在DNA中含有P元素，蛋白质中没有，故 32 P只能进入噬菌体的DNA中。在侵染过程中， 由于噬菌体的DNA全部注入大肠杆菌，离心后，上清 液中是噬菌体蛋白质外壳，沉淀物中是被侵染的大 肠杆菌，因此上清液中没有放射性。

‘陆’ 噬菌体滴度的测定的方法具体操作步骤是什么

操作步骤 1. 在5~10ml LB培养基中接种单个ER2537克隆，振摇孵育直至对数生长中期(OD600~0.5) 2. 在细胞生长时，微波融化顶层琼脂糖凝胶，分装至无菌培养管内，每管3ml。维持在45℃备用。 3. 37℃预热LB/IPTG/Xgal培养板，备用。 4. 以LB培养基10倍比稀释噬菌体。 建议稀释范围：对扩增的噬菌体培养上清，108-1011;对未扩增的筛选洗脱液，101-104。每次稀释都换用新的加样枪头，最好使用气溶胶阻隔枪头以避免交叉污染。 5. 一旦ER2537培养物长至对数生长中期，分装至微量离心管中，每管200ml。 6. 将倍比稀释的噬菌体上清加入含细菌培养物的微量离心管中，一支微量离心管中仅加入一种稀释液10ml，快速涡旋，室温孵育1-5min。 7. 转移至含有45℃顶层琼脂糖凝胶的管中，快速涡旋混匀，立即倾倒至预热的LB/IPTG/Xgal平板上，轻缓摇动平板使顶层胶均匀分布。 8. 冷却平板5min，37℃倒置培养过夜。 9. 噬斑计数以噬斑数为100左右的平皿为准，噬斑数乘以稀释度即可获得每10ml噬菌体的滴度-噬斑形成单位(pfu)。 生物帮上面有详细的步骤， http://www.bio1000.com/experiment/microbiology/ 微生物学实验技术,医学微生物学实验技术,微生物学检验,现代微生物学及实验实训技术,微生物学实验思考题。
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