Ⅰ 简述酶法分析生物药物和基因工程药物的原理，主要有哪些方法
酶分析法在生物药物分析中的应用主要有两个方面：第一，以酶为分析对象，根据需要对生物药物生产过程中所使用的酶和生物药物样品所含的酶进行酶的含量或酶活力的测定，称为酶分析法；第二，利用酶的特点，以酶作为分析工具或分析试剂，用于测定生物药物样品中用一般化学方法难于俭测的物质，如底物、辅酶、抑制剂和激动剂(活化剂)或辅助因子含量的方法称为酶法分析。
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特定及优势
而如果有仅作用于被测物质的酶，利用酶的特异性，不需要分离就能辨别试样中的被测组分，从而对被测物质进行定性和定量分析。所以，酶法分析常用于复杂组分中结构和物理化学性质比较相近的同类物质的分离签定和分析，而且样品一般不需要进行很复杂的预处理。酶法分析具有特异性强，干扰少，操作简便，样品和试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等特点。通过了解酶对底物的特异性。可以预料可能发生的干扰反应并设法纠正。在以酶作分析试剂测定非酶物质时，也可用偶联反应；而且偶联反应的特异性，可以增加反应全过程的持异性。此外，由于酶反应一般在温和的条件下进行，不需使用强酸强碱，它还是一种无污染或污染很少的分析方法。很多需红使用气相色谱仪、高压液相色谱仪等贵重的大型精密分析仪器才能完成的分析检验工作，应用酶法分析方法即可简便快速地进行。酶法分析目前主要广泛应用于医药、临床、食品和生化分析检测中，如尿素、各种糖类、氨基酸类、有机酸类、维生素类、毒素等物质的定性和定量分析。
Ⅱ 典型生物药物的一般制造流程是什么
一般生物制药的主要流程如下：1. 上游阶段
1.1 目的基因的制备
目的工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中,创造出具有高度应用价值的新物种. 为此必须从现有生物群体中,根据需要分离出用于克隆的次类基因,这样的基因称之为目的基因. 基因工程中获得的目的基因主要用于: (1).研究该基因,分析其结构,功能和表达的调空机制 (2).和正常基因比较,找出基因的异常点,探索疾病发生的分子生物学基础. (3).研究生物种系的进化 (4).建立基因疗法,将正常基因引入病人体内,治疗遗传性疾病(5).大量表达某种基因,生产出需要的蛋白和多肽 (6).对某些基因进行改选,改良动植物品种.
不同基因组类型的基因组大小不同,基因组和基因排列也各不相同,因此,分离目的基因应采用不同的途径和方法
1.1.1 构建cDNA基因文库分离法
cDNA文库是以真核细胞中分离纯化出所有的mRNA,在以mRNA为模板合成cDNA与适当的载体重组转入宿主细胞,这样建立起来的cDNA重组分子集合体称为cDNA文库.而cDNA文库中插入片段的总和可代表某一种生物全部的mRNA序列.
1.1.1.1 cDNA文库的构建
构建cDNA文库主要包括以下步骤: (1).细胞总RNA的制备及mRNA的分离 (2).以mRNA为模板,合成cDNA第一条链 (3).双链cDNA的合成,而将mRNA—DNA杂交分子转变为双链cDNA分子 (4). CDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及传染或质粒的转化等
1.1.1.2 cDNA克隆的优越性
自20世纪70年代初说创cDNA克隆问世以来,以采用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了许多目的基因的cDN**段.在基因工程操作中,也长以cDNA为探针从基因文库中分离相应的基因克隆.因此, cDNA克隆常常以基因分离和结构分析的着手点,在分子生物学研究和基因工程应用等方面具有十分重要的意义.
1.1.2 构建基因组文库分离法
1.1.2.1 基因组文库的概念
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,分别与适合的载体重组后导入宿主细胞,这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列.这种通过重组,克隆方法保存在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组文库.
1.1.2.2 基因组文库的大小
克隆片段的平均大小/bp 基因组的大小/bp
2×10^6(细菌) 2×10^7（真菌） 3×10^9（动物）
LN SJ LN SJ LN SJ
5×10^3 400 1831 4000 18418 600000 2736110
10×10^3 200 919 2000 9208 300000 1381550
20×10^3 100 458 1000 4603 150000 690774
40×10^3 50 278 500 2300 75000 345386
一个理想的基因组文库因该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列.这就要求在打断基因组DNA时尽可能做到随机切割,实际上,无论采用什么方法的不能达到理论上的切割.应此构建的基因组文库应包含的克隆子数理论值和经验值之间相差比较大.几类基因组文库的大小见下表: “2”
1.1.2.3 构建基因组文库的类型
通过克隆，重组方法构建的基因组文库主要有：
(1)构建λ噬菌体基因组文库；（2）构建考斯质粒基因组文库
(3) 构建YAC基因组文库
1.1.3 直接分离法
1.1.3.1 限制性核酸内切酶酶切分离法
限制性核酸内切酶酶切分离法适于简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几万碱基，编码的基因较少，获得的目的基因方法比较简单。
1.1.3.2 基因分离的物理化学法
这是基因工程在发展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的，但目前很少采用。次方法主要有：密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等。1.1.3.3 双抗体免疫法分离编码蛋白的基因
双抗体免疫法分离编码蛋白的基因适于某一真核细胞的蛋白质已被分离纯化，且足以产生抗体。
1.1.3.4 利用酶促反转录发直接从特定mRNA分离基因
酶促反转录主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离目的基因。
目的基因的mRNA为模板 逆转录酶 cDNA DNA聚合酶双链 双链cDN**段
与合适载体重组并转入受体菌 cDNA克隆
1.2 目的基因的分离
通过适当的方法构建上一个完整的基因组DNA文库或CDNA文库，意味着包含目的基因在内的所有基因都得以克隆，但并不等于完成了目的基因的分离。因为在基因文库中，不论是CDNA文库还是基因组文库，含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一个，其中究竟哪个克隆子含有我们所需要的目的基因序列还不清楚。因此，还需要下一个步骤要进行的就是目的基因的分离，主要方法有：
（1）目的基因的功能克隆 （2）序列克隆法
（3）利用差示分析法分离目的基因克隆 （4）功能结合法筛选目的基因
（5）DNA插入诱变法分离目的基因（6）应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因
（7）基因的定位侯选克隆法（8）染色体显微切割与微克隆法
（9）根据生物大分子内的相互作用分离目的的CDNA克隆
（10）筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术
1.3 基因克隆载体
载体是携带目的基因的DN**段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。常用的载体是经过改造的细菌质粒，噬菌体，黏粒和病毒
1.3.1 质粒克隆载体
质粒是细菌染色体外的双链环状的能自我复制的小分子DNA，其对细胞本身的生长繁殖不是必需的，但可以赋予细菌一定的类型，如耐热型等。
与构建克隆载体相关的质粒性质有：
（1） 粒的复（2） 制型（2）质粒的不（3） 相容性
（3）质粒的接合性
（4）质粒作为基因工程载体需要具备的条件：作为基因工程载体的质粒都是经过人工改造过的质粒，具备以下特点：
a, 相对分子质量小3—10kb b, 是松弛型复制质粒
c, 是非接合型质粒 c, 质粒上有多个限制酶的单一切点
d, 带有双选择标记
1.3.2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制的壳蛋白质的合成，实现病毒颗粒的增殖。人们利用这些性质构建了一小列分别适用于不同生物的病毒克隆载体。通过此种方法构建成的基因克隆载体主要有：
（1） 噬菌体克隆载体cosmid克隆技术（黏粒）（2）Μ13噬菌体克隆载体
（2） aMV克隆载体（4）烟草花叶病毒（ TMV）载体克隆
（5）SVCO克隆载体（6）反转录病毒克隆载体
（7）腺病毒克隆载体（8）痘苗病毒克隆载体
（9）杆状病毒表达克隆载体
1.3.3 其他类型的克隆载体
（1）染色体定位整合克隆载体（2）人工染色体克隆载体
（3） 特殊用途克隆载体：如启动子探针型，（4） 诱导型，（5） 反义表达组织特异表达，（6） 分泌型表达，（7） 双启动子，（8） 串族启动子和含增强子表达克隆载体等等
1.4 目的基因和载体的连接（重组）
目的基因和载体连接前要先用同一种限制酶将目的基因和载体切割成黏性端或平端，也可以用物理方法切割后再用酶补成平端
体外连接是基因工程的重要环节，体外连接要减少载体的自身环化，提高重但子阳性率。主要的连接方法有：黏性末端连接、平端连接、定向插入和同源多聚尾。
1.5 重组体导入受体细胞
外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组的DNA分子。该重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞在中才能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步达到结构复杂的高等动，植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。选择适宜的受体细胞已经成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一
1.5.1 受体细胞的选择要求
目的基因获得后,必须在合适的宿主细胞中才能进行表达,才能获得目的产物.应此,宿主细胞必须满足:容易获得较高浓度的细胞;能利用易得廉价的材料;不致病、不产生内毒素;发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;容易进行代谢调控;容易进行DNA重组技术操作技术;产物的产量、产率高,产物容易提取纯化.
1.5.2 受体细胞的类型
人们通过研究,根据需要获得了一定的目的产物,而目的基因能否的到有效的表达,关键在与受体细胞的选择.
1.5.2.1 原核生物细胞
由于原核生物作为基因工程受体具有其他生物所没有的优点,而且人们对其遗传背景清楚,所以早期开展的基因工程操作,都是以原核生物为受体细胞.目前研究比较多的有:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等.
1.5.2.2 真核生物细胞
由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂,适用于原核生物的转基因方法大多数难以有效地用于真核生物.近年来经过探索,发现它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程,有利于保持天然结构和生物活性.并用这些方法有效的获得了转基因真核生物.研究较多的有:酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等等.
1.5.3 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染和转导过程中,并非所有的的受体细胞 都能被导入重组DNA分子.一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞,同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖.因此,如何将被转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来,然后进一步检测到含有期待重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和工程操作红极为重要的环节.
重组子的筛选可以根据载体的类型、受体细胞种类以及外源DNA分子导入受体细胞的手段等采用不同的方法,一般包括以方面:
(1).遗传直接筛选法; (2),核算分子杂交检测法; (3)依赖于重组子结构特征分析的筛选法;
(4)免疫化学检测法; (5)转译筛选法; (6)亚克隆法; (7)插入失活法;
(8)电子显微镜作图检测法; (9)基因表达产物分析法; (10)DNA序列分析法.
1.6、外源基因的表达
基因工程技术的核心是基因表达技术。迄今为止，已构建了多种基因表达系统，包括原核生物和真核生物基因表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。
1.6.1 基因表达的机制（过程）
1.6.1.1 外源基因的起始转录
外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题，而外源基因的起始转录又是基因表达的关键。
1.6.1.2 mRNA的延伸与稳定性
外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。
mRNA的稳定性直接导致决定翻译产物的多少，对原核细胞来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失受体前。对真核细胞来说则需考虑增加mRNA的正确加工，提高成熟mRNA的稳定性。
1.6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
翻译是mRNA指导多肽链生成的过程，翻译的起始是多种因子协同作用的过程，其中包括mRNA,16SrRNA,fMet-tRNA之间的碱基配对，还有mRNA序列上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响。
1.6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性
外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素，因此，为了避免此现象的发生可从以下几个方面考虑：
（一）构建融合蛋白表达系统; （二）构建分子体蛋白表达系统;
（三）构建包涵体表达系统; （四）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统.
1.6.1.5 目的基因沉默
基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素。它的作用机制主要有三种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。基因沉默现象主要表现在转基因动物和植物中。
目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA,DNA与RNA,RNA与RNA相互作用的结果。由于重复序列或同源系列是基因沉默的普通原因之一，因而在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列具有较高的同源性。此外，可以通过选择甲几基化酶活性较弱的受体细胞或以化学物质处理受体细胞抑制甲基化作用。
1.6.2 基因表达的调控元件
通过研究发现主要的基因表达调控元件有：启动子、增强子、终止子、衰减子、绝缘子和反义子
1.6.3 外源基因表达系统
外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效的表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。由此可知，外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。基因表达系统有原核生物表达系统和真核生物表达系统。目前，利用较多的是原核生物表达系统，因其遗传背景清楚，繁殖快，表达率高等特点。近年来，真核生物基因表达系统发展很快，因其可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程，有利于保持天然结构和生物活性等优点。目前主要应用的表达系统有：大肠杆菌基因表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞基因表达系统、植物细胞基因表达系统；还有最新研究的两个新的表达系统[3]：巴斯德毕赤酵母表达系统和动物乳腺生物反应器——全新的生产模式。
2、下游阶段
基因工程只要的过程关键在于上游阶段，因它可以获得有效的工程菌，但下游纯化阶段也必不可少。因此为了获得合格的目的产物，必须建立相应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。
2.1、基因工程菌发酵：
良好的发酵工艺对表达外源蛋白至关重要，直接影响下游纯化工艺，形象到产品的质量和生产成本，决定产品在市场上的竞争力。目前，基因工程菌培养常用方法有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定培养。近年来，生物药品已进入生物技术时代，对基因工程菌的培养设备要求十分严格，主要采用新型自动化发酵罐。
2.2、分离纯化的基本过程：
分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的
一环,这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的
有效成分含量低，杂质含量高；另外由于基因工
程药物是从转化细胞，而不是从正常细胞生产的，
所以对产品的纯度要求也高于传统产品，主要的
步骤如右表：[4]
2.2.1、建立分离纯化工艺根据
主要根据：（1）含目的产物的起始物料特点;
（2）物料中杂志的种类和性质;
（3）目的产物特性;
（4）产品质量的要求.
2.2.2、选择分离纯化方法的依据：
主要依据：
(1) 根据产物表达形式来选择;
(2) 根据分离单元之间的衔接选择;
(3) 根据分离纯化工艺的要求来选择.
2.2.3、常用的分离纯化方法（见下表）[5]
方法 目的
离心/过滤 去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质(如病毒)
阴离子交换层析 去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等
阳离子交换层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等
超滤 去除沉淀物及病毒
疏水层析 去除残余的杂蛋白
凝胶过滤 与多聚体分离
0.22μm微孔滤膜过滤 除菌
3、基因工程药物：
自20世纪80年代初第一种基因工程产品——人胰岛素投放市场以来，以基因工程药物为主导的基因工程应用已成为全球发展最快的产业之一。随着生物技术的快速发展，基因工程药物将拥有越来越广阔的发展前景。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核苷酸药物等，它对预防和治疗人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿疾病等有重要作用。
3.1、基因工程激素类药物
激素是一类由生物体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机物，通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效应。基因工程的激素类主要指通过基因工程方法合成的蛋白多肽类激素。目前被批准上市的激素类药物有胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素等。
3.2、基因工程细胞因子类药物
细胞因子是由细胞分泌的能够调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖，分化和凋亡的小分子多肽类物质。目前被批准上市的产品有十多种。主要有：干扰素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF），趋化因子和生长因子（GF）等。它们的生物学功能主要表现为：调节免疫应答、抗病毒、抗肿瘤、调节机体造血功能和促进炎症反应等。
3.3、基因工程疫苗：
直接利用微生物制备疫苗来治疗疾病取得了巨大的成就，但由于各种传染病在世界范围内广泛存在，并不断有新的致病微生物被发现，它们对人类的健康造成巨大威胁。利用基因工程方法制备疫苗对控制传染病的复发和治疗新的传染病有重要意义。目前研究的基因工程疫苗包括：痢疾菌苗、霍乱菌苗、结核菌苗、流感菌苗、狂犬病疫苗、疟疾疫苗、口蹄疫疫苗。
3.4 特殊基因工程药物—防御素
防御素是一类在生物界广泛存在的、富含半胱氨酸,具有微生物和一些恶性细胞抗性的小分子短肽.它的抗性谱十分广泛,目前以发现它不但对细菌、真菌和被膜病毒(如爱滋病病毒)有广泛的毒杀效应,对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用.最近,对一些长期存活的爱滋病感染者的研究发现,他们体内的爱滋病抑制因子就是一类防御素.这一研究发现给人们战胜爱滋病带来希望.
4. 基因工程研究发展前景
基因工程问世以来短短的二十几年,显示出了巨大的活力,使传统的生产方式和产业结构发生了变化.特别是在医药行业,利用人工的方法合成了许多有用的药物及人体器官等,取得了很大的经济效益.今后,基因工程将重点开展基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面的研究.通过这方面的研究、开发,对人类的生活、生存环境从根本上优化做出巨大的贡献.因此,我们相信基因工程的前景将是更加灿烂辉煌.
Ⅲ 关于生物制药的工艺流程论文
【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留量的测定方法。方法 色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：292nm；进样量：40μl。结果 样品的室内加标平均回收率为86.7％～91.8％，室内相对标准偏差为4.5％～6.0％，室间加标平均回收率为81.4％～95.0％，室间相对标准偏差3.7％～7.1％，定量测定低限（LOQ）为10μg/kg。结论 本方法简便，准确，可用于脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留含量的测定。
【关键词】 高效液相色谱法;脂肪;醋酸美仑孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮
醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮为合成的孕激素类药物，有明显的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用，动物实验表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)恶心、头晕、倦怠；(2)突破性出血；(3)孕期服用，会增加女性后代的男性化作用。孕激素类药物能增强体内物质沉积和改善生产性能，可以很快产生显着和直接的经济效益，因此，对生产者有很大的吸引力。畜牧业中使用孕激素类药物(非治疗用途)已有很长的历史，但人类长期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦会明显影响机体的激素平衡，而且有致癌危险，对幼儿造成发育异常等危害。因此，开发一种能检测孕酮残留量的方法是十分必要的。
检测孕激素类药物的方法有很多，如液相色谱/质谱法（LC/MS）〔1〕、气相色谱/质谱法（GC/MS）〔2，3〕和液相色谱法〔4～6〕等。本文采用高效液相色谱法对牛和猪脂肪样品中的孕酮进行检测。
1 试剂与仪器
1.1 试剂 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品（Sigama公司），乙腈（HPLC级），甲醇（HPLC级），乙酸乙酯（HPLC级），其他试剂为分析纯。水由Milli-Q净化系统（Millipore公司）制得。
（1）标准储备液：1000μg/ml，分别准确称取0.050g醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品于50ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。
（2）混合中间溶液I：100μg/ml，分别吸取10.0ml醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。
（3）混合中间溶液II：1.0μg/ml，取1.00ml混合中间溶液I于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用半年。
（4）混合标准工作液：分别吸取10、20、40、80、100μl混合中间溶液II添加到980、970、950、910、890μl的乙腈-水（65:35）中，再加入10μl 0.2%盐酸溶液，混匀，得到浓度为0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml和0.10μg/ml混合标准工作液，供液相色谱测定，当日使用。
1.2 仪器 Waters液相色谱系统，510泵体，486紫外-可见光检测器，Emprower pro色谱软件。氮气吹干仪（Organomation Associates，Jnc.公司）；固相萃取装置（Supelco公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；涡旋混匀器（XW-80A型，上海医大仪器厂）；CN固相萃取柱（3ml，Waters公司）。
2 测定步骤
2.1 试样的制备与保存
2.1.1 试样的制备 把大约5g的猪或牛脂肪组织切成小块，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml的烧杯中，将烧杯置于微波炉内。根据所熬制脂肪量，使用最大功率，加热30～60s，如果脂肪没有融化，可在间隔30～60s以后重复加热30～60s，直到有液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中。把熬制好的脂肪油放入样品瓶中，密封，并做上标记。
2.1.2 样品的保存 把熬制好的脂肪油样品置于-18℃中，冷冻保存。
2.2 提取 称取熬制好的脂肪油2.00±0.01g，置于50ml具塞离心管中，加入5ml乙腈，于60℃水浴中保温3min以使固体脂肪溶化，涡旋振摇1min，在-5℃下离心7min（离心力1160g），吸取上清液至15ml带塞聚丙烯离心管，再在沉淀物中加入5ml乙腈重复提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷，涡旋振摇1min，于-5℃中离心5min（离心力1160g），弃去正己烷层。乙腈提取液于60℃中用氮气吹干仪吹干，残渣待皂化。
2.3 皂化 在残渣（2.2项）中依次加入4ml正己烷、1ml 0.1mol/L 氢氧化钠溶液和0.5ml1.0mol/L氯化镁溶液，于涡旋混匀器上快速混匀10s，在60℃水浴中保温15min，于-5℃中离心5min（离心力1160g），吸取上清液至15ml玻璃试管。在沉淀物中再加入4ml正己烷混匀后，在60℃水浴中加热15min后，在-5℃中离心5min（离心力1160g），合并上清液。于60℃中用氮气吹干仪吹干，用1.0ml正己烷溶解残渣，待净化。
2.4 净化 将皂化后的样液（2.3项）倒入经5ml乙酸乙酯和6ml正己烷预处理过的CN柱中，用2×1ml正己烷润洗玻璃试管，洗液倒入到CN柱中。待样液流过后，依次用5ml正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，随后打开真空泵将小柱中液体抽干，保持抽气2min。最后用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，洗脱液收集于15ml玻璃试管中，于60℃中用氮气吹干仪吹干。残余物用990μl乙腈-水（65:35）涡旋溶解，静止15min后，加入10μl 0.2%盐酸溶液，混匀，供液相色谱测定。
2.5 测定
2.5.1 液相色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；预柱：C18柱（12.5mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：292nm；进样量：40μl。
2.5.2 液相色谱测定 根据样液中3种孕酮的含量情况，选定浓度相近的标准工作液，标准工作液和样液中3种孕酮的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，标准品的色谱图见图1。
图1 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色谱图（100ng/ml）1-醋酸甲地孕酮，2-醋酸氯地孕酮，3-醋酸美仑孕酮
液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 来自: 免费论文网
3 结果与讨论
3.1 线性范围 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮浓度在0.010～0.10μg/ml范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数（γ2）均大于0.998。
3.2 回收率、精密度和定量检测限 本实验以2种脂肪（牛脂肪和猪脂肪）作为样本。取适量标准品加入到2.0g样品中，使添加量相当于10、20和50μg/kg，每个添加水平各取24份试样（每种脂肪各12份）。图2为空白脂肪样品和添加样品（10μg/kg）的色谱图。表1为醋酸美仑孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度。表2为8家实验室的室间回收率和精确度结果。根据回收率试验，能可靠测得的最低浓度确定定量检测限（LOQ），LOQ为10μg/kg，满足残留限量的检测要求。
（A）
（B）
（C）
（D）
图2 空白脂肪样品和添加样品（10g/kg）的色谱图A：牛脂肪空白样；B：猪脂肪空白样；C:牛脂肪添加样；D:猪脂肪添加样
表1 室内回收率和精确度的结果 (每一添加量，n=24)
表2 8家实验室室间回收率和精确度的结果 (每一添加量，n=32)
Ⅳ 如何对一种分析方法做验证试验
1. 绪论
本指南旨在为申请者提供建议，以帮助其提交分析方法，方法验证资料和样品用于支持原料药和制剂的认定，剂量，质量，纯度和效力方面的文件。
本指南旨在帮助申请者收集资料，递交样品并资料以支持分析方法。这些建议适用于NDA，ANDA，BLA，PLA及其它们的补充中所涉及的原料药和制剂。
这些原则同样适用于二类DMF所涉及的原料药和制剂。如果使用了其它方法，鼓励申请者事先和FDA药品评审中心的官员进行讨论，以免出现这种情况，那就是花了人力物力所准备起来的递交资料后来发现是不可用的。
本指南中所述的分析方法验证的原则适用于各种类型的分析方法。但是，本指南中特定的建议可能不适用于有些产品所用的特殊分析方法，如生物药，生物技术药，植物药或放射性药物等。
比如说，许多生物分析是建立在动物挑战模式，免疫原性评估或其它有着独特特性的免疫分析基础上的，在递交分析方法和分析方法验证资料时需考虑这些独特的性质。
而且，许多原料药和制剂的界定和质量控制所需的生物和免疫化学检测并不在本指南的范围之内。
尽管本指南并不专门叙述原料，中间体，赋形剂，包装材料及原料药和制剂生产中所用的其它物料的分析方法及分析方法验证资料的递交，但是应该应用验证过的分析方法来分析检测这些物质。
对于本指南中未提及的关于分析方法验证和资料提交方面的问题，请向FDA相关的化学评审人员咨询。
本指南，一旦定稿，将取代FDA于1987年2月份发布的工业指南：分析方法验证所需提交的样品和分析资料。
II. 背景
每个NDA和ANDA都必需包括必要的分析方法以确保原料药和制剂的认定，剂量，质量，纯度和效力，还包括制剂的生物利用度(21 CFR 314.50(d)(1) 和314.94(a)(9)(i))。
FDA验证文件现场备查，可以不与DMF一起交。
必须要有资料来论证所用的分析方法是符合一定的准确度和可靠性标准的。
分析方法验证是论证某一分析方法适用于其用途的过程。分析方法的验证过程是从申请者有计划地系统性收集验证资料以支持分析方法开始的。
审评化学家会对NDA或ANDA中的分析方法和验证资料进行评审。
一旦FDA有要求，则NDA或ANDA的申请者必须提交制剂，原料药，非药典对照品和空白以使FDA实验室能对申请者所用分析方法进行评审(21 CFR 314.50(e) and 314.94(a)(10))。
FDA实验室的分析会论证该分析方法在实验室内是可以重现的。审评化学家和实验室分析家会从法规的角度确定该分析方法的适用性。
FDA检查官会对分析实验室进行检查确保用于放行和稳定性实验的分析方法符合现行的GMP（21CFR part 211)和GLP (21 CFR part 58)。
每个BLA和PLA都必须要有详细的生产工艺描述，包括分析方法，以说明所生产的产品是符合规定睥安全，纯充和效力标准的(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(iv))。
必须要有资料证明所用的分析方法是符合一定的准确度和可靠性要求的(21 CFR 81211.194(a)(2))。对于BLA，PLA及它们的补充，在所提交的许可证申请中应当要有分析方法和方法验证这部分的资料，审评委员会会对这部分资料进行评审。
需提供代表性样品及该样品所代表批号的检测结果总结(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(vi))。评审委员会主席会要求CBER实验室的分析人员进行分析实验对申请者的分析方法进行评估，并确认其分析结果。
从验证的角度来看，所有的分析方法有着同样的重要性。一般来说，应当要应用已验证过的分析方法，而不论其是被用于过程控制，放行，合格或稳定性实验。高等每个定量分析方法时都应当要减少其分析误差。
分析方法和验证资料应当摆在申请的分析方法和控制章节中提交。本指南的第III到IX章和XI章给出了所需提供资料方面的建议。向FDA实验室提供样品和递交NDA和ANDA中的分析方法验证资料的信息见第X章。
III分析方法的类型
A. 法定分析方法
法定分析方法是被用来评估原料药或制剂的特定性质的。USP/NF中的分析方法是法定的用于药典项目检测的分析方法。为了确认符合法规，需使用法定分析方法。
B. 替代分析方法
替代分析方法是申请者提出用于代替法定分析方法的分析方法。只有当一替代分析方法相当于或优于法定分析方法时，才可以应用验证过的替代分析方法。
I如果提交了替代分析方法，申请者还应当提供其理由，并标明其用途（如，放行，稳定性实验），验证资料及其与法定分析方法的对比资料。
C. 稳定性指示分析
稳定性指示分析是能检测出原料药或制剂的某些性质随着时间的延长而出现的变化的定量分析方法。
稳定性指示分析能不受降解产物，工艺杂质，赋形剂或其它潜在杂质的影响而准确测定其中的活性成分。
如果申请者递交了用于放行检测的非稳定性指示分析方法，则应当要有能定性和定量地监测杂质，包括降解产物，的分析方法对其进行补充。稳定性试验中所用的含量分析方法应当要有稳定性指示能力，除非有科学的理由能证明其合理性。
IV 标准品
A．标准品的类型
可以从USP/NF处或其它官方(比如说，CBER，21CFR 610.20)获得标准品 (也就是一级对照品)。如果不能确定一标准品的来源是否会被FDA认为是官方来源，申请者应当要向适当的化学评审人员咨询。如果没有官方来源，则被用来作标准品的物质应当要有尽可能高的纯度，并得到充分界定。
工作对照品 (也就是内部标准品或二级标准品)是根据一级对照品标定的，并用来代替一级对照品的。
B．分析报告单
对于非官方标准品，在申请的分析方法和控制章节中应当要提供该标准品的分析报告单。对于从官方获得的标准品，用户应当要确保标准品的适用性。应当正确储存标准品并在已确定的时间段内使用该标准品。
C．标准品的界定
从USP/NF及其它官方来源获得的标准品是不需要进一步界定的。非官方对照品要有尽可能高的纯度，并进行充分地界定以确保其结构，剂量，质量，纯度和效力。
T用于界定标准品的定性和定量分析方法应当要不同于用于控制原料药或制剂的结构，剂量，质量，纯度和效力的分析方法，要比它们更深入。用于标准品界定的分析方法不应仅仅是和先前的指定标准品进行比较实验。
一般来说，界定资料应当要包括：
标准品的简单工艺描述，如果其生产工艺是否于其相应的原料药的话。应当要叙述制备标准品时所用的补充精制过程。
相关光谱图，色谱图，TLC照片及其它仪器输出的清晰复印件。建立纯度的资料。应当要应用适当的检测方法来获得这些资料，比如说TLC，GC，HPLC，相溶解分析，适当的热分析方法及其它必要的分析方法。
适当的化学性质资料，比如结构式，经验式和分子量等。结构确证资料应当要包括适当的分析测试，比如元素分析，IR，UV,NMR和MS，及适用的官能团分析。还应当要提供具体的结构解析资料。
物理性质的描述，包括颜色和物理形态。 适当的物理常数，比如说熔程，沸程，折射率，离解常数(pK值)和旋光度。用于界定标准品的分析程序的详细叙述。
至于生物技术/生物产品的标准品，应当要考虑上述建议，可能可以应用。然而，其它确定物理化学性质，结构特性，生物活性和/或免疫化学活性的补充检测和/或其它检测将是非常重要的。
物理化学性质包括异构体，电泳和液相色谱行为及光谱性质等。结构界定可能包括氨基酸序列，氨基酸组成，缩氨酸图和碳水结构。确定生物和/或免疫化学活性的分析方法应当要和用来确定产品效力的分析方法一样。
Th这些分析方法可以包括基于动物的，细胞培养的，生物化学的或配位体/接受体螯合的分析方法。如果这些检测需用于某些标准品的界定，生物和免疫化学检测的分析方法验证方面的特殊建议并不在本指南的范围之内。
V．IND中的分析方法验证
对于IND而言，每个阶段的研究都需要有足够的资料以确保合适的认定，质量，纯度，剂量和/或效力。所需的分析方法和方法验证方面的资料会随着研究的阶段变化而变化(21CFR312.23(a)(7))。
N关于在第1阶段研究所需提交的分析方法和方法验证资料方面的指南，发起人可以参考FDA的指南：药品（包括结构确定的，有疗效的，生物技术产品）第1阶段研究的IND申请的内容和格式（1995年11月）。
第2和第3阶段研究所需提交的分析方法和方法验证资料方面的指南，发起人将可以参考FDA的指南：药品（包括结构确定的，有疗效的，生物技术产品）第1阶段研究的IND申请的CMC内容和格式（草案，1999年4月）。
在递交NDA，ANDA，BLA或PLA时，所有的分析方法都应当要开发出来，并得到验证。
VI．NDA，ANDA，BLA和PLA中分析方法的内容和格式
NDA，ANDA，BLA和PLA中所提交的任一分析方法都应当要有详细的描述，以使合格的分析人员能重现出所需的实验条件并获得和申请者相当的实验结果。应当要叙述分析方法中需要特殊注意的地方。
如果所用的分析方法是USP/NF或其它FDA认可参考文献（如，<>）中且所参考的分析方法未经过修改的话，则需提供该分析方法的参引，而不用提供该分析方法的描述（21 CFR 211.194）。
对于从其它公开发表的文献上获得的分析方法，应当要对其进行叙述，因为评审官可能并不能很方便的获得这些文献。
分析方法描述中需要包括的典型内容如下所示：
A．基本方法
HPLC进行分离的，检测器为UV检测器。
B．取样
需要叙述的有：所选样品的数目（比如，瓶，片等），它们是如何使用的（也就是，单独的或是混合样品），每个样品分析的重复次数。
C．仪器和仪器参数
需要叙述的有：仪器列表（比如，仪器类型，检测器，柱子类型，尺寸等）和仪器参数（比如，流速，温度，运行时间和设定波长等）。如果必要的话，还要提供实验结构示意图（比如，阐述喷洒式分析方法的位置）。
D．试剂
需要叙述的有：试剂列表及其相应的规格（比如：USP/NF，美国化学社（ACS）分析试剂）。如果使用的是自制试剂或更改过的商业试剂，则应当要有其制备方法。对于不稳定的或有潜在危险的试剂，应标明其储存条件，安全使用说明和使用周期。
E．系统适应性实验
系统适应性实验参数和合格标准是建立基础是：仪器，电子元件，分析操作和待测样品是个不可分割的整体。系统适应性实验确保系统在样品分析的时候能很好地运行。在分析方法中应当要包括适当的系统适应性合格标准。
所有的色谱分析方法都应当要有系统适应性实验及相应的合格标准。CDER评审官指南<<色谱分析方法的验证>>（1994年11月）对用于评估系统适应性的典型参数进行了定义和讨论。
建议系统适应性实验应成为所有分析方法的一部分，而不仅仅是色谱分析方法。无论是哪类分析方法，都要采用实验来证实该系统能不受环境条件的影响而正确地运行。比如说，滴定法一般来说需要进行空白实验。
F．标准品的制备
要有所有标准品溶液（比如，储备液，工作对照品溶液，内部对照品溶液）的配制方法。
G.操作过程
应当要按操作步骤对操作过程进行逐步叙述。叙述应当要适当包括如下信息：平衡时间，样品进样顺序和系统适应性或启动参数。需标明不常见的危险。
Ⅳ 求 生物制药工艺流程
微生物制药技术
工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。
微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素一般定义为：是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。(有人曾建议将动植物来源的具有同样生理活性的这类物质如鱼素、蒜素、黄连素等也归于抗生素的范畴，但多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。)近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物。微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容：
第一方面 菌种的获得
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。具体分离操作从以下几个方面展开。
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。
采样：有针对性地采集样品。
增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。
分离：利用分离技术得到纯种。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
第二方面 高产菌株的选育
工业上生产用菌株都是经过选育过的。工业菌种的育种是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。
工业菌种育种的方法：诱变、基因转移、基因重组。
育种过程包括下列3个步骤： (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。
选择育种方法时需综合考虑的因素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(例如分批或者连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术；如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。
工业菌种具体改良思路：(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤（通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。） (2)增加前体物的浓度。 (3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。
Ⅵ 生物制药工艺流程分析题怎么分析
生物技术制药包括基因工程制药,细胞工程制药,酶工程制药和发酵工程制药.基因工程制药的工艺流程可分为以下几步:1.目的基因的获得 这可通过多种方法获得,如反转录法,鸟枪法,化学合成或由已有基因来改造 2.目的基因与载体的结合,构建工程菌 这时要注意载体必须符合以下要求:有多个克隆位点.有较强的启动子和终止子,能够独立复制 俯偿碘锻鄢蹬碉拳冬哗 3.发酵培养 即在发酵罐中培养 4.外源目的基因的表达 5.外源表达产物的纯化分离 分离一般也要以下步骤:细胞破碎,固液分离,浓缩,初步提纯和高度提纯. 细胞工程制药,分动物细胞制药和植物细胞制药.目前动物细胞制药主要制取单抗,疫苗.植物细胞制药主要是为获得植物细胞的此生代谢产物.此种方法的有点是条件容易控制,产量大.缺点是遗传不够稳定. 酶工程制药 它是利用酶工程和原生质体融合,诱导和基因重组等技术相结合,不仅可使微生物转化的效率成倍增加,而且可以使整个生产过程连续,自动化. 发酵工程制药 此法又称微生物工程. 它在原有的发酵技术的基础上又采用了新技术使工艺水平大大提高.可以看成是基因工程制药的一部分,这两种方法都是经过细胞大规模培养来获得大量目标产品.此法要先找到菌种,在放大培养即可.
Ⅶ 生物制药技术包括哪些方法
生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。生物药物，包括生物技术药物和原生物制药。
指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品本专业培养具备扎实的生物技术和药学基础理论、基本知识，熟练掌握现代生物技术和制药技术的常用实验流程，初步了解生物技术制药企业生产和销售环节的流程，能够胜任现代生物技术实验室和生物技术制药企业岗位基本要求的德、智、体、美全面发展的技术应用型高级实用人才。
本专业学生应掌握生物化学、生化分离分析技术、生物技术及工业药剂学等方面的基本理论知识和专业技能，受到生物制药研究和生产技术的基本训练，毕业后能从事生物药物的资源开发、产品研制、生产、技术管理、质量控制等工作。
Ⅷ 如何应用微生物与免疫学的理论指导开发新药
现在已经有生物药（疫苗）和抗体药（抗体耦合小分子）这种超越了传统教科书上内容的药物上市了。下面我们以传统的小分子化合物药（比如青霉素，比如对乙酰氨基酚）为例，大致说一下药物研发从无到有到最后上市的流程。
i. 临床前研究。
1.药物靶点的确认。
这个是所有工作的开始。只有确定了靶点，后续所有的工作才有展开的依据。
2.化合物的合成。
这个阶段的工作主要负责新化合物的合成，现有化合物的结构改造和优化。
3.活性化合物的筛选
不是所有合成出来的化合物都能有理想的活性，在这个阶段需要通过生物实验手段筛选出初步有活性的化合物用作备选。这些化合物叫先导化合物（lead）。得到的活性数据可以结合化合物结构得到初步的构效关系分析。构效关系可以有效的指导后续的化合物结构优化。这一步工作主要在细胞实验层面展开。
同时也存在一个化合物对目标A靶点没有作用，却有可能对其他的B靶点C靶点有非常好的活性的情况，暂且不表。
4.返回到2进行下一步的化合物结构修饰得到活性更好的化合物。
2到4这是一个循环，直到我们得到了活性足够理想的化合物。
上面的内容也就是药物化学领域的大致工作范围了。
5.评估药物的药理作用，安全性与毒性，药物的吸收、分布、代谢和排泄情况（ADME）。
这部分的实验需要在动物层面展开。细胞实验的结果和活体动物实验的结果有时候会有很大的差异。这一步的目的是确定药物的有效性与安全性。
6.制剂的开发。
总不能弄点化合物就直接往嘴里倒吧。制剂开发是药物应用的一个重要环节。比如有的药胃肠吸收很差，就需要开发为注射剂。有的药对在胃酸里面会失去活性，就需要开发为肠溶制剂。有的化合物溶解性不好，这也可以通过制剂来部分解决这个问题。
前面这些内容都统称为临床前研究。是药物研发的最开端的内容。各个实验的步骤并不一定严格按照这个顺序展开，也没有1、2、3这样一个明显的分界线。各个步骤是一个相互包容协调的关系。
ii.临床研究。
1. 临床I期。
2.临床II期。
3.临床III期。
这部分的具体内容不怎么了解。我从网络知道上找了个回答。可以参考。
http://..com/question/52182460.html
Ⅰ期临床试验
在新药开发过程中,将新药第一次用于人体以研究新药的性质的试验,称之为Ⅰ期临床试验.即在严格控制的条件下,给少量试验药物于少数经过谨慎选择和筛选出的健康志愿者(对肿瘤药物而言通常为肿瘤病人),然后仔细监测药物的血液浓度\排泄性质和任何有益反应或不良作用,以评价药物在人体内的性质.Ⅰ期临床试验通常要求健康志愿者住院以进行24小时的密切监护.随着对新药的安全性了解的增加,给药的剂量可逐渐提高,并可以多剂量给药.通过Ⅰ期临床试验,还可以得到一些药物最高和最低剂量的信息,以便确定将来在病人身上使用的合适剂量.可见,Ⅰ期临床试验是初步的临床药理学及人体安全性评价试验,目的在于观测人体对新药的耐受程度和药代动力学,为制定给药方案提供依据.
Ⅱ期临床试验
通过Ⅰ期临床研究,在健康人身上得到了为达到合理的血药浓度所需要的药品的剂理的信息,即药代动力学数据.但是,通常在健康的人体上是不可能证实药品的治疗作用的.在临床研究的第二阶段即Ⅱ期临床试验,将给药于少数病人志愿者,然后重新评价药物的药代动力学和排泄情况.这是因为药物在患病状态的人体内的作用方式常常是不同的,对那些影响肠、胃、肝、和肾的药物尤其如此。以一个新的治疗关节炎的止通药的开发为例。Ⅱ期临床研究将确定该药缓解关节炎病人的疼通效果如何，还要确定在不同剂量时不良反应的发生率的高低，以确定疼痛得到充分缓解但不良反应最小的剂量。可以说，Ⅱ期临床试验是对治疗作用的初步评价阶段。Ⅱ期临床试验一般通过随机盲法对照试验（根据具体目的也可以采取其他设计形式），对新药的有效性和安全性作出初步评价，并为设计Ⅲ期临床试验和确定给药剂量方案提供依据。
Ⅲ期临床试验
在Ⅰ，Ⅱ期临床研究的基础上，将试验药物用于更大范围的病人志愿者身上，进行扩大的多中心临床试验，进一步评价药物的有效性和耐受性（或安全性），称之为Ⅲ期临床试验。Ⅲ期临床试验可以说是治疗作用的确证阶段，也是为药品注册申请获得批准提供依据的关键阶段，该期试验一般为具有足够样本量的随机化盲法对照试验。临床试验将对试验药物和安慰剂（不含活性物质）或已上市药品的有关参数进行比较。试验结果应当具有可重复性。可以说，该阶段是临床研究项目的最繁忙和任务最集中的部分。除了对成年病人研究外，还要特别研究药物对老年病人，有时还要包括儿童的安全性。一般来讲，老年病人和危重病人所要求的剂量要低一些，因为他们的身体不能有产地清除药物，使得他们对不良反应的耐受性更差，所以应当进行特别的研究来确定剂量。而儿童人群具有突变敏感性、迟发毒性和不同的药
Ⅸ 新药的开发研制过程是怎样进行的
新药研制主要分新药临床前研
究和新药临床研究两个过程。
l新药临床前研究内容
药学研究
药理学研究
毒理学研究
一、药学研究主要内容
⑴ 原料药生产工艺研究
⑵ 制剂处方及工艺研究
⑶ 确证化学结构或组分研究
⑷ 质量研究：包括理化性质、纯
度检查、溶出度、含量测定等
⑸ 质量标准草案及起草说明
⑹ 稳定性研究
⑺ 临床研究用样品及其检验
报告
⑻ 产品包装材料及其选择依据
二、新药药理毒理学研究
1．药理学内容：
①药效学试验：
主要药效学试验
一般药理学试验；
②药动学试验。
2．主要药效学研究
1） 药效学试验：应以动物体内试验
为主，必要时配合体外试验，从
不同层次证实其药效。
2） 观测指标：应选用特异性强、敏
感性高、重现性好、客观、定量
或半定量的指标进行观测。
3）实验动物：根据各种试验的
具体要求，合理选择动物，对
其种属、性别、年龄、体重、
健康状态、饲养条件、动物来
源及合格证号等，应有详细记
录。
5） 给药剂量及途径
⑴ 试验分组：各种试验至少应设
三个剂量组，剂量选择应合理，尽
量反映量效和／或时效关系，大动
物（猴、狗等）试验或在特殊情况
下，可适当减少剂量组。
⑵ 给药途径：应与临床相同，如
确有困难，也可选用其他给药途径
进行试验，但应说明原因。
6）对照：主要药效学研究应设对照
组，包括：
⑴ 正常动物空白对照组；
⑵ 模型动物对照组；
⑶ 阳性药物对照组（必要时增设
溶媒或赋形剂对照组）。阳性对照药
应选用正式批准生产的药品，根据需
要设一个或多个剂量组。
3．一般药理学研究
主要观察给药后对动物以下三个系统的影响：
⒈）神经系统：活动情况、行为变化
及对中枢神经系统的影响。
⒉）心血管系统：对心电图及血压等
的影响。
⒊）呼吸系统：对呼吸频率、节律及
幅度的影响。
须设2～3个剂量组，低剂量
应相当于药效学的有效剂量；给
药途径应与主要药效学试验相同，
4．药动学研究
对有效成分明确的第一类新药，
可参照化学药品的药动学方法，研
究其在动物体内的吸收、分布、代
谢及排泄，并计算各项参数。
5．毒理学研究 Toxicology Study
1）急性毒性（Acute toxicology）
2）慢性毒性（Chronic toxicology）
3）特殊毒性（Special Test）
半数致死量
Lethal Dose 50 (LD50)
最大耐受量
Maximal Resistance Experiment
1）急性毒性试验
(1）LD50测定选用拟推荐临床试验
的给药途径，观察一次给药
后动物的毒性反应并测定其
LD50。
水溶性好的一、二类新药应测定
二种给药途径的LD50。给药后至少
观察7天，记录动物毒性反应情况、
体重变化及动物死亡时间分布。对
死亡动物应及时进行肉眼尸检，当
尸检发现病变时应对该组织进行镜
检。
2）最大给药量试验
如因受试药物的浓度或体积限制，
无法测出半数致死量（LD50）时，可
做最大给药量试验。试验应选用拟推
荐临床试验的给药途径，以动物能耐
受的最大浓度、最大体积的药量一次
或一日内2～3次给予动物。
（如用小白鼠，动物数不得少于
20只，雌雄各半），连续观察7天，
详细记录动物反应情况，计算出
总给药量（折合生药量g/kg）。
3）长期毒性试验
长期毒性试验是观察动物因连
续用药而产生的毒性反应及其严重
程度，以及停药后的发展和恢复情
况，为临床研究提供依据。
长期毒性实验条件 Conditions for Chronic Experiment
⑴ 动物 （Animals）
⑵ 剂量 （Dosage）
⑶方法与给药途径
（Methods and route of administration）
⑷ 实验周期（Experimental cycle）
治疗局部应用的药物 Drugs for local application
治疗局部疾患且方中不含毒性药
材或有毒成分的第三、第四类外用药，
一般可不做长期毒性试验。
但需做局部刺激试验、过敏试验，
必要时需做光敏试验。
可能影响胎儿或子代发育的药物，
除按一般毒理学要求进行试验外，
还应增做相应的生殖毒性试验
(reproctive experiment) 。
特殊毒性实验（Special Test）
致癌实验（Carcinogenesis test）
genetic mutation
致突变实验（Mutagenesis test）
cancer inction
致畸癌实验（Teratogenesis test）
congenitally deformed baby or
congenital malformation
Drug dependence Test: addiction
进行临床研究应具备的条件
申报临床研究并获得国家食品药品监督
管理（SFDA)局批准
Application for Clinical Study
Approval by CDA
获得伦理委员会批准
Supervised by Ethic Council
新药临床实验 Clinical Study of New Drugs
临床试验（Clinical Trials)
生物等效性试验
（Bio-equivalent Study）
临床试验分期 Clinical trials
I 期
II期
III期
IV期
I期临床试验
为初步的临床药理学及人体安全性评价试验，主要观察人体对新药的耐受性（tolerance）和药动学规律，为制定给药方案提供依据。
Biological equipotent
experiment 生物等效性试验
II 期临床试验
为随机盲法对照临床试验，主要对新药有效性及安全性作出初步评价，并推荐临床给药剂量。
III期临床试验
为扩大的多中心临床试验，
应遵循随机对照原则，进一步评
价新药的有效性和安全性。
IV期临床试验
为新药上市后的监测，在广
泛使用条件下进一步考察新药的
疗效和不良反应（尤其注意罕见
的不良反应）。
临床研究要求Principle Require
⒈获得国家食品药品监督管理（SFDA)
局批准
⒉符合国家药品监督管理局《药品临
床试验管理规范》的有关规定。
⒊临床研究的病例数应符合统计学要
求。
4．在SDA确定的药品临床研究基地中
选择临床研究负责和承担单位
⒌ 临床研究单位应了解和熟悉试验用
药的作用和安全性，按GCP要求制
定临床研究方案。
⒍ 应指定具有一定专业知识的人员遵
循GCP的有关要求，监督临床研究
的进行。
⒎ 不良事件（Adverse events ）
临床研究期间若发生严重不
良事件，须立即采取必要措施
保护受试者安全，并在24小时
内向当地省级药品监督管理部
门和国家药品监督管理局报告。
⒏ 临床研究完成后，临床研究单
位须写出总结报告，负责单位
汇总，交研制单位。
有关试验和具体要求
⒈ 耐受性试验
受试对象、受试例数、分组、
确定初试剂量
⒈ 耐受性试验
⑴ 受试对象：应选择健康志愿者，
特殊病证可选轻型患者。健康状况
须经健康检查，除一般体格检查外，
尚要做血、尿、粪便常规化验和心、
肝、肾功能检查，并应均属正常。
要注意排除有药物、食物过敏史者。
对妊娠期、哺乳期、月经期及嗜烟、
嗜酒者亦应除外。还应排除可能影响
试验结果和试验对象健康的隐性传染
病等。
受试例数20～30例，以18～50岁为宜，
男女例数最好相等。
⑵ 分组：在最小初试剂量与最大初试
剂量之间分若干组。
⑶ 确定初试剂量：最小初试剂量一般
可从同类药物临床治疗量的1/10开
始。
⒉ 药动学研究
⑴ 可与耐受性试验结合进行
⑵ 质控要求：检测方法应灵敏度
精、专属性强、回收率高和重
现性好。
药品不良反应
（adverse drug reaction，ADR）
不良事件
（adverse event）
药品不良反应和不良事件 的判断与处理
⑴ 药品不良反应
（adverse drug reaction，ADR）
指在规定剂量正常用药过程中所产
生的有害而非期望的、与药品应用有
因果关系的反应。
在一种新药或药品新用途的
临床试验中，如治疗剂量尚未确
定时，所有的有害而非期望的、
与药品应用有因果关系的反应，
也应视为药品不良反应。
⑵ 不良事件（adverse event）：
病人或临床试验受试者接受一种药
品后出现的不良医学事件，但并不
一定与治疗有因果关系。
⑶ 严重不良事件
（serious adverse event）：
临床试验过程中发生需住院治疗、
延长住院时间、伤残、影响工作能
力、危及生命或死亡、导致先天畸
形等不良事件。
⑷ 药品不良反应分类
临床试验中药品不良反应分临
床反应和化验异常两部分。
临床反应常分为A、B、C三型。
① A型反应：由药物药理作用过强或
与其他药物出现相互作用所引起。
临床试验中观察、检查和评价的主
要是A型反应，其评价方法与上市
后监测药物不良反应的方法相似，
都是通过所发现的反应与所用药物
之间的因果分析来评定反应与药物
是否有关。
②B型反应：又称特异反应，可危
及生命且不能预测，一旦发生，
需立即向主办单位与药政管理
部门报告。
③C型反应：常以疾病形式出现，在
新药试验中不易被察觉，常通过流
行学研究发现。
药品不良反应的评价标准
①五级标准：
有关 / 很可能有关 / 可能有关 /
可能无关 / 无关
用前二种相加来统计不良反应发生率。
② 七级标准：
有关/很可能有关/可能有关/不大可能有关/可能无关/无关/无法评价。
如何确定不良事件与药物存在因果关系
①用药与出现不良事件的时间关系以
及是否具有量效关系
②停药后不良事件是否有所缓解
③在严密观察并确保安全的情况下，
观察重复给药时不良事件是否再次
出现等。
⒋临床试验设计原则Principle of clinical trials
随机性（randomization）
合理性（rationality）
重复性（replication）
代表性（representativeness）
⑴ 随机性：两组病人的分配均匀，不
随主观意志为转移。
⑵ 合理性：既要符合专业要求与统计
学要求，又要切实可行。
⑶ 代表性：受试对象的确定应符合样
本抽样符合总体的原则。
⑷ 重复性：经得起重复验证。排除系
统误差。
⒌ 对照试验
⑴ 平行对照试验：
随机分组对照试验，最常用的是试
验药A与对照药B（或安慰剂）进行
随机对照比较。
⑵ 交叉对照试验：
拉丁方设计（latin square design）。
⒍ 设盲（blinding／masking）：
使一方或多方不知道受试者治疗分配的一种程序。
双盲法试验（double blind technique）
⒎ 安慰剂（placebo）
安慰剂是指没有药理活性的物质如乳
糖、淀粉等，常用作临床对照试验中
的阴性对照。
安慰剂可引起疗效（正效应）和不良
反应（负效应）。镇痛、镇静止咳等
的有效率平均可达35.2％土2.2％。
分类：
纯安慰剂:无药理活性
不纯安慰剂:指作用不强的药物，
有时起安慰剂的作用。
安慰剂效应（placebo effect）
⒏ 疗效判断
临床疗效评价（response assessment）
公认标准采用四级评定。
痊愈（cure）
显效（excellence）
好转（improvement）
无效（failure）
痊愈率+显效率=有效率（％）。
⒈ 药品临床前试验管理规范 （good laboratory practice，GLP）
GLP是对从事实验研究的规划设计、执行实施、管理监督和记录报告等实验室组织管理、工作方法和有关条件所提出的法规性文件。它主要是针对有关药品、食品添加剂、农药、化学试剂、化妆品及其他医用物品的动物
毒性评价而制定的法规，目的在
于严格控制药品安全性评价的各
个环节，包括严格控制可能影响
实验结果准确性的各种主、客观
因素，如保证实验研究人员具备
一定素质、实验设计慎密合理、
各种实验条件合格、数据完整准
确以及总结资料科学真实等。
2. 药品临床试验管理规范
（good clinicaI practice，GCP）
GCP的核心是保障受试者与患者的权利，保证临床试验的科学性。这些规范规定了临床试验的有关各方，即申办者、研究者及管理当局在临床试验中的职责、相互关系和工作方式。
3. 药品生产质量管理规范
（good manufacture practice, GMP）
GMP是为生产出全面符合质量标准的药品而制定的生产规范，它由硬件和软件组成，其实施包括药品生产的全过程，从对原料、制剂一直到销售、退货以及药品管理部门
全体人员应具备的条件等都做了详细的规定。原料药的制作与制剂在实质上有一定差别，但GMP要求基本精神要一致。
⒋ 药品供应质量管理规范
（good supply practice,GSP）:
GSP是为保证药品在运输、贮存
和销售过程中的质量和效力所
制定的管理规范。
⒌ 道地药材生产规范
（good organic practice，GOP）
GOP是关于大宗药材基地化和集约化的
生产管理规范，目前正进行GOP基础研究，
争取到2010年，使100种最常用道地药材
的质量稳定在高标准水平上，基本消灭
次、劣品；使出口值排在前10位的药材
达到国际无公害药材（Organic）水平。
国家基本药物 Essential Drugs in China
1985年，WHO在内罗毕会议上扩展
了基本药物的概念，使其包括了高度重
视合理用药的内容，同时，在推荐基本
药物目录遴选程序时，还把基本药物的
遴选过程与标准治疗指南以及国家处方
集结起来，也就是使基本药物与合理用
药相结合。
我国的国家基本药物是从我国临床应用
的各类药物中，经科学评价而遴选出的
具有代表性的药品，无论从疗效、不良
反应、价格和质量，还是从稳定性、使
用方便性和可获得性等方面，都是同类
药物中最佳的；是在经济条件允许的情
况下，治疗某种病症的首选药品，它必
须能满足大部分人口卫生保健的需要。
处方药与非处方药
⒈ 处方药(prescription drug)
⑴ 刚上市的新药：对其活性和副作用
还需进一步观察；
⑵ 可产生依赖性的药品：如吗啡类镇
痛药及某些催眠安定药；
⑶ 本身毒性较大的药品，如抗癌药等；
⑷ 用药时要经医生开处方并在其指
导下使用，或治疗需实验室确诊
的某些疾病的药品，如治疗心血
管疾病的药品。
国家非处方药遴选原则
应用安全、疗效确切、
质量稳定，使用方便。
⒉ 非处方药(Over the counter, OTC)
OTC多治疗诸如感冒、发烧、咳
嗽、消化系统疾病、头痛、关节疾
病、过敏症（如鼻炎）等疾病；它
还包括营养补剂如维生素、中药补
剂等药品，大多安全而有效。
甲类非处方药的零售企业必须具有
《药品经营企业许可证》。经省级
药品监督管理部门或其授权的药品
监督管理部门批准的其它商业企业
可以零售乙类非处方药。
零售乙类非处方药的商业企业必
须配备专职的具有高中以上文化
程度，经专业培训后，由省级药
品监督管理部门或其授权的药品
监督管理部门考核合格并取得上
岗证的人员。
使用注意：因非处方药不需要凭执业
医师或执业助理医师处方，消费者即
可按药品说明书自行判断、购买和使
用，为此，对部分品种除规定了使用
时间、疗程外，还强调遇到某些情况
时应向医师咨询等。
The End