蛋白质组学定量分析的常用方法和仪器

① 什么是蛋白质组学的基本技术流程

蛋白质组学的基本技术流程主要为以下四方面。 1 蛋白质标本的制备及分离:寻找较好的方法尽可能完全地抽提细胞或组织中的全部蛋白质是比较蛋白质组..

② 蛋白质组学研究不同组织蛋白质的差异 常用那些技术或软件

蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质. 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸. 多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等.
蛋白质组学研究内容
主要有两方面，一是结构蛋白质组学，二是功能蛋白质组学。其研究前沿大致分为三个方面：
① 针对有关基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学。
② 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理病理体系或过程的局部蛋白质组或比较蛋白质组学。
③ 通过多种先进技术研究蛋白质之间的相互作用，绘制某个体系的蛋白，即相互作用蛋白质组学，又称为“细胞图谱”蛋白质组学。

③ 蛋白质组学主要包括哪些分析技术及各自特点

双向凝胶电泳
双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。由于双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置，它可用于蛋白质转录及转录后修饰研究，蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用，细胞分化凋亡研究，致病机制及耐药机制的研究，疗效监测，新药开发，癌症研究，蛋白纯度检查，小量蛋白纯化，新替代疫苗的研制等许多方面。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。

等电聚焦
等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。等电聚焦凝胶电泳依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。

生物质谱
生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术，其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽键）成肽段，对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种：基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI- MS）。

飞行时间质谱
MALDI 的电离方式是 Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶体，当用激光（337nm的氮激光）照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离。它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱，非常快速（每次分析只需3~5min），灵敏（达到fmol水平），可以精确测量肽段质量，但是如果在分析前不修饰肽段，MALDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列。

电喷雾质谱（ESI-MS）
ESI- MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。ESI-MS从液相中产生离子，一般说来，肽段的混合物经过液相色谱分离后，经过偶联的与在线连接的离子阱质谱分析，给出肽片段的精确的氨基酸序列,但是 分析时间一般较长。 目前，许多实验室两种质谱方法连用，获得有意义的蛋白质的肽段序列，设计探针或引物来获得有意义的基因。随着蛋白质组研究的深入，又有多种新型质谱仪出现，主要是在上述质谱仪的基础上进行改进与重新组合。

④ 蛋白质组学常用的研究方法

酵母双杂交系统、抗体芯片、LCM技术、mic Solution Inc、SPR技术、色谱分离技术、双相电泳技术、有机质谱等等。
LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。
蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。
胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。
Genomic Solution可以为研究者提供除质谱外的所有蛋白质组学研究工具，包括二维电泳系统，成像系统及分析软件，胶切割系统，蛋白质消化浓缩工作站，点样工作站等；同时还可以提供相关试剂和消耗品。
蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。
LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。

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⑤ 基因组和蛋白质组之间的关系，企业常用的分析蛋白质组的方法有哪些

组学omics,研究的是整体.按照分析目标不同主要分为基因组学,转录组学,蛋白质组学,代谢组学.基因组学研究的主要是基因组DNA,使用方法目前以二代测序为主,将基因组拆成小片段后再用生物信息学算法进行迭代组装.当然这仅仅是第一步,随后还有繁琐的基因注释等数据分析工作.转录组学研究的是某个时间点的mRNA总和,可以用芯片,也可以用测序.芯片是用已知的基因探针,测序则有可能发现新的mRNA,蛋白组学针对的是全体蛋白,组要以2D-Gel和质谱为主,分为top-down和bottom-up分析方法.理念和基因组类似,将蛋白用特定的物料化学手段分解成小肽段,在通过质量反推蛋白序列,最后进行搜索,标识已知未知的蛋白序列.代谢组分析的代谢产物,是大分子和小分子的混合物,主要也是用液相和质谱.总而言之,这些技术都想从全局找变量,都是一种top-down的研究方法,原因很简单：避免‘只缘身在此山中’的尴尬.但因为技术局限,都各有缺点,尤其是转录组和蛋白组数据,基本上颠覆了以前一直认为的mRNA水平能代表蛋白水平的观念,因为这两组数据的重合度太低.所以目前很多研究都开始使用交叉验证方法.

⑥ 关于蛋白质组学检测结果分析求助

1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。
2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。
3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。
4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。
在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。 不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。可以利用免疫组织化学技术达到这个目的，但该技术的致命缺点是通量低。激光捕获显微切割LCM(Laser Capture Microdissection)技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，因此LCM技术实际上是一种原位技术。取出的细胞用于蛋白质样品的制备，结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线，可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线，其研究结论值得怀疑，因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起，最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。虽然培养细胞可以得到单一类型细胞，但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境，因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离，分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究，包括mRNA和蛋白质的表达。
LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。可以根据需要制备总蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。相关试剂盒均有厂商提供。 蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。
胶染色后可以利用凝胶图像分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。
LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交，从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。Clontech最近开发了一张抗体芯片，可以对378种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。该芯片同时配合了抗体芯片的全部操作过程的重要试剂，包括蛋白质制备试剂，蛋白质的荧光染料标记试剂，标记体系的纯化试剂，杂交试剂等。
对于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。
关于蛋白质组的研究，也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片，这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究，蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。 Science，Vol. 293，Issue 5537，2101-2105，September 14，2001发表了一篇关于酵母蛋白质组芯片的论文。该文主要研究内容为：将酵母的5800个ORF表达成蛋白质并进行纯化点样制作芯片，然后用该芯片筛选钙调素和磷脂分子的相互作用分子。
最后有必要指出的是，传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。适应这个要求，蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统，通量高而速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内处理最多的数据

⑦ 蛋白质组组学研究的基本策略是什么

蛋白质组 蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制. 作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸. 多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等.
[编辑本段]蛋白质组学的研究内容
主要有两方面，一是结构蛋白质组学，二是功能蛋白质组学。其研究前沿大致分为三个方面：
① 针对有关基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学。
② 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理病理体系或过程的局部蛋白质组或比较蛋白质组学。
③ 通过多种先进技术研究蛋白质之间的相互作用，绘制某个体系的蛋白，即相互作用蛋白质组学，又称为“细胞图谱”蛋白质组学。
此外，随着蛋白质组学研究的深入，又出现了一些新的研究方向，如亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学等。
[编辑本段]蛋白质组学研究中的主要技术
1 双向凝胶电泳技术(2-DE)
双向凝胶电泳技术与质谱技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白质组学分析方法。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。
2 高效液相色谱技术(HPLC)
尽管二维凝胶电泳（2-DE）是目前常用的对全蛋白组的分析方法，但其存在分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。Chong 等使用HPLC/ 质谱比较分析恶性肿瘤前和癌症两种蛋白质差异表达。利用HPLC 分离蛋白质，并用MALDI-TOF-MS 鉴定收集的组分，从而在两种细胞中的差异表达中对蛋白质进行定量分析。多维液相色谱作为一种新型分离技术，不存在相对分子质量和等电点的限制，通过不同模式的组合，消除了二维凝胶电泳的歧视效应，具有峰容量高、便于自动化等特点。二维离子交换- 反相色谱(2D-IEC-RPLC)是蛋白质组学研究中最常用的多维液相色谱分离系统。
3 表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SEL-DI)技术
表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱技术于2002 年由诺贝尔化学奖得主田中发明，刚刚产生便引起学术界的高度重视。SELDI 技术是目前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台，其全称是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情况下将样品经过简单的预处理后直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上，既可比较两个样品之间的差异蛋白，也可获得样品的蛋白质总览。因此，在应用方面具有显着优势。SELDI 技术分析的样品不需用液相色谱或气相色谱预先纯化，因此可用于分析复杂的生物样品。SELDI 技术可以分析疏水性蛋白质，PI 过高或过低的蛋白质以及低分子质量的蛋白质( < 25 000) ，还可以发现在未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质，增加发现生物标志物的机会。SELDI 技术只需少量样品，在较短时间内就可以得到结果，且试验重复性好，适合临床诊断及大规模筛选与疾病相关的生物标志物，特别是它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等， 从而可检测到样品中目标蛋白质的分子量、PI、糖基化位点、磷酸化位点等参数。
4 同位素标记亲和标签(ICAT)技术
同位素亲和标签技术是近年发展起来的一种用于蛋白质分离分析技术，此技术目前是蛋白质组研究技术中的核心技术之一。该技术用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术，对混合的样品进行质谱分析。来自两个样品中的同一类蛋白质会形成易于辨识比较的两个不同的峰形，能非常准确的比较出两份样品蛋白质表达水平的不同。ICAT 的好处在于它可以对混合样品直接测试；能够快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；还可以快速找出重要功能蛋白质。
由于采用了一种全新的ICAT 试剂，同时结合了液相色谱和串联质谱，因此不但明显弥补了双向电泳技术的不足，同时还使高通量、自动化蛋白质组分析更趋简单、准确和快速，代表着蛋白质组分析技术的主要发展方向。针对磷酸化蛋白分析以及与固相技术相结合ICAT 技术本身又取得了许多有意义的进展，已形成ICA T 系列技术。用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术，可对混合的样品进行质谱分析。
5 生物信息学
近年来，生物信息学在生命科学研究中起着越来越重要的作用。利用生物信息学对蛋白质组的各种数据进行处理和分析，也是蛋白质组研究的重要内容。生物信息学是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。生物信息学的发展，已不仅是单纯的对基因组、蛋白质组数据的分析，而且可以对已知的或新的基因产物进行全面分析。在蛋白质组数据库中储存了有机体、组织或细胞所表达的全部蛋白质信息，通过用鼠标点击双向凝胶电泳图谱上的蛋白质点就可获得
如蛋白质鉴定结果、蛋白质的亚细胞定位、蛋白质在不同条件下的表达水平等信息。目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST 数据库。NRDB 由SWISS2PROT 和GENPETP 等几个数据库组成，dbEST是由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和 欧洲生物信息学研究所(EBI)共同编辑的核酸数据库；计算机分析软件主要有蛋白质双向电泳图谱分析软件、蛋白质鉴定软件、蛋白质结构和功能预测软件等。

⑧ 蛋白质组学样品前处理的方法

要回答这个问题，首先需要理解样品前处理需要达到的目的：减少人为降解和修饰，并且尽量多的释放肽段。

整个过程可以分为以下流程：先从组织、体液或细胞中提取蛋白质，拿到蛋白混合溶液（根据你的研究目的，可以对蛋白先做分离，或者不分离），接下来还原烷基化（还原的过程是将蛋白的二硫键打开，然后烷基化可以修饰巯基，防止游离的巯基再生成二硫键）处理，并酶解成肽段。

1，样品的收集与保存

组织样品

1) 对于人体手术切除的组织，有条件的话，最好用PBS（磷酸缓冲盐溶液，作为溶剂，起溶解保护试剂的作用）取完之后直接去血。如果没有去血，可以-80℃液氮保存，干冰运输。

2）对于小鼠、大鼠、兔子之类的组织样品，建议用灌流的方式来去血，尤其是像肝脏、胃、心脏这类大的组织，可以直接用灌流的方式去血，去得最干净。其次的方案是在后期剪碎的时候去血。

细胞样品

常规实验，建议收到5*1E6~1E7个细胞以上的样品量（有些实验需要的样品量会少一些，后面会详细讲）。细胞取好后，首先用PBS清洗一下细胞表面，因为大部分培养基里面都含有血清，这部分血清得洗干净了先~

如果是做分泌蛋白研究的话，首先用PBS清洗样品几次，再用条件培养基（不含有血清的培养基）进行培养，根据细胞情况，大概12个小时以后，离心，去掉细胞碎片，取上清，就能提取到分泌蛋白了。

血清样品

1）血浆样品：可以通过医院常用的EDTA抗凝管进行收集，收集到的血浆会呈悬浮状态，离心去掉血细胞。

2）血清样品：现在大部分研究都直接针对血清样品，它的成份更简单，没有凝集素，没有大量的血细胞，针对性会更强。收集血清样品时，直接把血清吸到管子里，室温静置让它凝结，上清黄色部分就是血清样品啦。
2，研磨或超声破碎样品，为了减少人为操作引入的修饰，通常会准备大量的冰，进行冰上的操作。同时还需要加入蛋白酶抑制剂，防止在操作过程中蛋白被样品中自带的蛋白酶降解掉。

3，充分熔接蛋白质，如果蛋白没有充分溶解，能提取到的蛋白就会很少，达不到研究目的。

4，充分解旋蛋白质，通常，蛋白质都是成球状的稳定状态，解旋蛋白质就是将球状蛋白中的二硫键打开，让它形成链状结构，以便进行下一步酶切。

5，酶解蛋白质，一般会用多种酶对蛋白质进行酶解。

6，去除杂质，我们要知道，质谱是一个非常灵敏的仪器，它检测的是多肽的质荷比。所有的盐类，以及所有会进行离子化的杂质，都会干扰到肽段的检测。所以我们会要求进入质谱之前的蛋白样品非常干净。在蛋白水平及肽段水平都会进行去除杂质的步骤。

更详细的，下次再聊~

⑨ 蛋白质组学的研究手段有哪些原来这里已经有回答了，还不满意，希望详尽点。

一 双向电泳。双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)与质谱(mass spectrum, MS)的结合是最常见的蛋白质组学的研究手段。双向电泳包括第一向等电聚焦(Isoelectric focusing, IEF)和第二向SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)。双向电泳可以提供包含有分子量和等电点信息的二维图谱
二 多维色谱法。在多维色谱法中，蛋白样品通常先被消化成肽段，然后经过离子交换、反相HPLC(high-performance liquid chromatography)而被分离。该方法的中HPLC可以直接和质谱偶联，可有效的分析极酸或极碱、高度疏水等传统2-DE方法难以分析的蛋白质，而且易于实现分析的自动化。
三 荧光差异凝胶电泳技术(differential in-gel electrophoresis, DIGE)。DIGE可用三种不同的荧光染料来分别对样品进行标记，荧光染料可以通过酰胺键与蛋白质的赖氨酸ε-氨基共价结合。将标记的样品混合然后在同一块双向电泳凝胶上分离。这样在一块双向电泳凝胶上可获得三幅图像，即在一块凝胶内分析不同的蛋白样品。DIGE有效地改善了传统2-DE的重复性。
四 定量蛋白质组学方法：
⑴ ICAT(isotope-coded affinity tags)方法。ICAT是用于定量蛋白质组学研究的稳定同位素标签法的一种。在稳定同位素标签法中，质谱可以通过识别标记的肽段和未标记的肽段之间的信号强度差异来达到定量的目的。在ICAT方法中，带有生物素半分子的同位素标签对样品中蛋白质的半胱氨酸残基进行标记，标记的蛋白样品经过消化成为肽段后，经阳离子交换色谱和亲和素亲和纯化，然后进入质谱鉴定。相同肽段在质谱上会表现为双峰，峰的强度直接反应了该肽段对应的蛋白质在两种样品中的相对强度。ICAT的缺点是无法标记缺乏半胱氨酸残基的蛋白质、会丢失转录后修饰信息、相同肽段由于标记上的差异在HPLC中会产生不一致的洗脱表现以及增加的生物素基团会增加质谱解析的复杂性[47][48]。

⑵ cICAT (cleavable isotope-coded affinity tags)。也是稳定同位素标签法，基于ICAT。cICAT采用了13C和酸性可裂解生物素而克服了ICAT的部分缺点。

⑶ iTRAQ 。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)法可同时分析多达四个不同样品的，该方法不会丢失转录后修饰信息，因而可以用于信号转导中的蛋白质磷酸化修饰的研究。

⑩ 测定蛋白质分子量的常用方法

蛋白定量的测试方法有很多种，其中较为常见的有五种，分别是Bradford法、Bradford斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法及BCA法这五种。

在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。

(10)蛋白质组学定量分析的常用方法和仪器扩展阅读

蛋白定量分析也就涉及到生产科研的多个领域及行业，也是生物学科、食品检验及掺假掺伪、临床检验、诊断疾病和质量检验中最常见的方法。

蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。为验证细胞裂解是否成功，或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量。

为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量。为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。