基因表达研究方法

A. 研究基因表达的方法

真核基因表达研究方法与应用

1、基因敲除技术 (Gene Knockout)

注意事项：
（1）、有合适的胚胎干细胞（embryonic stem cells）；
（2）、有已知的单拷贝基因位点；
（3）、用线性载体或不能自我复制的载体。

2.蛋白质相互作用（Pull-down assay）Science, 289:1550-1554 (2000)

NFkB基因表达后导致细胞炎症，而NFkB基因的活化受炎症诱发因子的刺激。IKKα、IKKβ及NEMO（NFkB-essential modifier）抑制NFkB基因的表达。

3、导弹药物--药物导向治疗

肿瘤或癌细胞表面通常过量表达某些特征性蛋白质（如人乳腺癌细胞表面的28 kD 蛋白），可作为肿瘤导向治疗的作用靶。将抗体的某些部分与外毒素相连接，就可以把毒素直接送到病变细胞表面，有效地杀死病变细胞，保护健康细胞。

B. 如何开展基因表达研究

摘要：众所周知，在不同的情况下，在不同的组织中，基因表达的水平也不同。如今，研究人员可利用多种技术来追踪基因表达水平的差异，如定量PCR、芯片或测序。对于这些技术平台，如何选择？如何开展数据分析和验证？且看看专家的回答。

众所周知，在不同的情况下，在不同的组织中，基因表达的水平也不同。如今，研究人员可利用多种技术来追踪基因表达水平的差异，如定量PCR、芯片或测序。《Genome Technology》杂志这一次请来了几位科学家，让他们分享一下应如何选择这些技术。此外，研究人员也谈到了解决质量控制和数据分析的问题，以及如何验证基因表达研究的发现。

Q1：您如何评估哪种方法（芯片、定量PCR或测序）最适合基因表达研究？

Gary Hardiman（加州大学圣地亚哥分校）
答案在很大程度上取决于研究的目的。传统的qPCR最适合于少量目标和大量样品。芯片和RNA-seq最适合于整体的转录谱分析。芯片和RNA-seq之间的选择在于成本、数据处理的轻松程度以及检测灵敏度。
芯片实验的优势在于它们很快，相对廉价，且数据存储和处理较为轻松。在很短的时间内可生成两个样品之间差异表达基因的列表，并用于指导通路、基因本体、网络/互作组的分析，为两个样品之间的生物学差异提供线索。这也可以通过测序来实现，但过程稍微复杂一些。如果要研究选择性剪接，那么无疑要选择测序。
芯片也面临一些问题，包括近缘物种的交叉杂交，杂交动力学不好以及低丰度转录本的灵敏度差，无法区别目的基因和假基因。这些都会导致噪音数据。
商业化的芯片的缺点在于不能“与时俱进”，依赖于12个月或之前的基因组版本，有时注释也不是最新的。这可能导致探针内容不再相关。此外，芯片也可能漏掉与特定研究相关的重要探针。人和小鼠的基因组芯片不会有很大的问题，但其他物种（如斑马鱼）可能会。
高通量测序则没有以上这些限制。最终结果是一系列序列标签，可定位到转录本上。测序是一个有序的过程，不存在芯片技术所固有的噪音，因此产生很少量真正的hits。而另一方面，芯片依赖结合的能量学，而少量转录本会被非特异杂交所冲垮，因此未检测到。
大规模并行测序无疑将取代DNA芯片技术，来监控转录组的变化。然而，这些实验的成本以及分析实验的计算机要求让测序不如芯片技术那么普及，但随着测序仪产量更高，智能条形码的实施以及可靠分析工具的出现，这将迅速改变。也就是说，如果现在要发现两个样品之间差异表达的基因，我还是会选芯片。

C. 基因表达量的研究方法

差异基因表达的研究受到了广泛的关注，常用的技术有DD-PCR；GENE-FISHING；GENE CHIP等。简单介绍如下：

DDRT—PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术，此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT—PCR技术的基本过程如下：
①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA；
②在逆转录酶作用下，以Oligo dT12MN为锚定引物将mRNA反转录成cDNA；
③ 以cDNA为模板利用10一mer随机引物和锚定引物进行PCR扩增；
④ 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，结合银染等显色方法获得平行材料间的差异cDNA片段，回收并再扩增差异片段；
⑤Northern blotting检测差异cDNA片段是否为阳性片段；
⑥克隆cDNA片段并测序；
⑦ 根据测序结果筛选cDNA文库或使用RACE技术获得cDNA片段侧翼序列，进而获得其全长cDNA基因。

GeneFishing技术用来检测不同样品间的表达差异。该技术着眼于解决目前用来检测基因表达差异的方法所面临的问题，如芯片技术和差异显示技术。该技术的实验包括以下三个步骤，反转录PCR (RT) 和两步法PCR (GeneFishing PCR)。
第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一链。dT-ACP1引物的3′端与mRNA的多聚A互补。这样第一链cDNA包含了dT-ACP1引物 5%26acute;端的通用序列。
第二步: 把第一步得到的第一链cDNA稀释后和随机ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。随机ACP引物的3′端序列能有效的结合到第一链cDNA的某一部位。在第一步PCR时，通过控制条件只能使随机ACP的3′端特异的结合到第一链cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火结合到第一链cDNA。通过第一步PCR合成第二链cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互补序列，而其5′端包含了随机ACP的通用序列。第三步: 来自第二步的PCR管的混合物在更严格条件下进行第二步PCR，这时使dT-ACP2和随机ACP能各自退火结合到第二步得到双链cDNA的3′ 端和5′端。既然第二链cDNA的3′端序列与随机ACP引物的通用序列互补，而其5′端与dT-ACP2的通用序列互补，这样保证了只扩增目标产物。该技术特点如下
(1) 无假阳性。GeneFishing技术鉴别的差异表达基因均可通过Northern Blot分析或RT-PCR证实！现有的DEG检测方法，例如生物芯片和差异显示技术的主要瓶颈就是假阳性的存在。无假阳性可以使研究者能快速辨别可信的差异表达基因。
(2) 无需PAGE（聚丙烯酰胺凝胶），琼脂凝胶法即足够。退火控制引物(ACP)极大地提高了PCR扩增的特异度和灵敏度，从而产生特异PCR产物。而且，GeneFishing 技术只需要少量的起始物质。PCR产物可以在标准的溴化乙啶染色的琼脂凝胶中被检测，因而省去了使用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）的繁琐处理步骤。使用GeneFishing 技术在琼脂凝胶中产生的条带具有足够浓度，可以被Northern Blot方法检测。
(3) 无需昂贵的检测方法。放射性/荧光检测方法由于其成本和危险性而不能广泛应用。昂贵的检测方法是现今差别表达基因检测的另一缺点。因此，可以使用标准溴化乙啶染色的琼脂凝胶来进行检测是GeneFishing 技术的一个主要优势。
(4) 重复性保证。GeneFishing技术的所需反应试剂均由试剂盒提供。这样防止了由于使用旧的，不匹配的试剂而带来的变化，确保了可靠的重复性。
(5) 无需特殊技术。GeneFishing 技术是一种以PCR技术为基础的创新方法，简单易用。
(6) 快速经济。GeneFishing技术使得研究者可以在5小时内确认有效的差异表达基因，不必因为假阳性而浪费时间。相比之下，所有其他DEG筛选方法都需要大量的后续工作和时间来鉴别有效的差异表达基因。
(7) 大范围的PCR产物。每一个GeneFishing PCR反应产生从150bp至2kb长度范围的PCR产物，这不仅提高了鉴别差异表达基因的机会，还为预测基因功能提供了更多的有效序列信息。

基因芯片技术的原理类似我们日常所说的计算机芯片，只是在固体基质上的不是集成着各种半导体管，而是成千上万的基因探针，待分析的样品通过和芯片中已知序列的DNA片段碱基互补杂交，经过计算机的分析，从而确定待测核酸序列和性质，表现出基因表达量和一些序列本身的特性。该技术主要包括四个环节：芯片微列阵制备，样品制备，生物分子反应和信号的检测分析。目前的制备方法主要是采用表面化学的方法或是组合化学的方法来处理固相基质，如玻璃片或硅片。在固体材料中刻出微滤栅、微通道，并加上微泵、微阀来控制流体。然后将探针以预先设计的顺序固定在固体基质上。微列阵制备技术主要有两种基本方法：原位合成法和点样法。
以上三项技术比较如下：

发现新基因

假阳性

PCR产物长度

检测方法

重复性

GeneFishing

能

没有

达到2kb

琼脂糖凝胶

高

Gene Chip

否

高

N/A

荧光

低

DD-PCR

否

高

100-500bp

荧光或放射

低
参考资料：试验方案

D. 基因表达调控研究中主要实验技术有哪些

基因表达调控主要实验技术有：ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase
1、 ChIP实验
通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与 DNA交联的复合物, 对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联, DNA与蛋白质之间的 Schiff键水解, 释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。
2、 RIP实验
RIP技术（RNA BindingProtein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。
3 、RNA pull-down实验
使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
4 、EMSA实验
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
5、 Luciferase实验
荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。
萤光生成反应通常分为以下两步：
萤光素+ ATP→ 萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+ PPi
萤光素化腺苷酸+ O2→ 氧萤光素+ AMP +光
荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞（骨髓干细胞、T细胞等）标记上（即表达）荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。
荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子、药物筛选、siRNA和miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测、活细胞的实时动态研究、信号转导通路分析、难转染的细胞（包括干细胞和原代细胞）的研究、RNA剪接研究。
双荧光素酶报告基因测试，是结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速、灵敏、简便。其应用广泛，可同时分析多个调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上的靶点（包括脱靶效应、分析两个或多个通路之间的相互作用）。

E. 列举3种研究基因在体内表达方式的试验方法

目的比较不同途径递送质粒DNA至Balb/c小鼠体内所诱导的报告基因表达效果。方法将编码荧光素酶(luc+)蛋白的重组质粒(pGL-3-CMV)或空载体质粒pGL-3-basic以肌肉注射或电脉冲方法将10μg或100μg上述质粒注入小鼠股四头肌,基因枪法以三枪接种质粒于小鼠腹部(2μg质粒DNA/4.5Mpa/枪)。于质粒注入后24~144h,检测小鼠体内的荧光素酶活性。结果肌肉注射10μg的小鼠未检测到荧光素酶的表达;肌肉注射100μg、电脉冲法递送10μg和100μg质粒的小鼠,接种后48h体内荧光素酶活性达到峰值,递送100μg的小鼠体内表达量明显高于10μg的小鼠。基因枪免疫小鼠在接种24h达到峰值。结论电脉冲和基因枪介导的基因递送方式基因表达水平远远高于传统注射方法,是基因疫苗免疫递送的可靠方法

F. 新基因功能的研究方法

基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度, 不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域, 通过单杂交或ChIP等技术, 寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交, GST pulldown, co-IP, BRET, FRET, BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function & loss-of-function: 也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout), 从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究, 综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1. mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或real time RT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northern blot、Rnase protection assay方法，检测基因的mRNA表达情况/变化。）
2. 蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Western blot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3. 检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。

G. 基因调控的研究方法

许多基因，包括只在某一发育阶段活动的基因（见基因文库）都可以从基因组中分离出来进行研究。应用核酸的顺序分析技术可以测定基因的核苷酸顺序。再应用体内与体外的基因表达系统就能直接了解基因调控的机制。

H. RNAi抑制基因表达的三种方式及原理分别是什么

RNA干扰的分子抑制机制的三种方式及原理

• 转录抑制

与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。

• 转录后抑制

不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。

• 翻译抑制

Grishok等在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因为当RNA的大小为70～80 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成stRNA，由stRNA抑制翻译。这种方式的RNAi也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。

I. 基因表达调控的方式有哪些

基因表达调控分为很多水平：
1.DNA、染色体水平调控：基因丢失、基因修饰、基因重排、基因扩增、染色体结构变化。
2.转录水平调控（主要调控方式）：转录起始、延伸、终止均有影响。原核生物借助于操纵子，真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用进行调控。
3.转录后水平调控：主要指真核生物原初转录产物经过加工成为成熟的mRNA，包括加帽、加尾、甲基化修饰等。
4.翻译水平调控：对mRNA稳定性的调控、反义RNA对翻译水平的调控等。
5.翻译后水平调控：蛋白质的剪切、化学修饰（磷酸化、乙酰化、糖基化等）、转运等。
6.mRNA降解的调控。