抗生素微生物检验计算方法

① 抗生素效价测定的方法有哪两类它们各有什么特点

抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法（cylinder
plate
method）。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm），管内放入标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈（图实验-18）。抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。抗生素效价常采用二剂量法。将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
(1)
求出w和v：
(2)
w=（sh+uh）-（sl+ul）
(3)
v=（uh+ul）-（sh+sl）
式中：
uh：供试品高剂量之抑菌圈直径
ul：供试品低剂量之抑菌圈直径
sh：标准品高剂量之抑菌圈直径
sl：标准品低剂量之抑菌圈直径
求出θ：（2）
θ=d·antilog（iv/w）式中：
θ：供试品和标准品的效价比
d：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1
i：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
求出pr
：
(5)
pr
=
ar×θ
式中：
pr：供试品实际单位数
ar：供试品标示量或估计单位
（1）细菌：短小芽胞杆菌[cmcc（b）63202]的芽胞悬液。
（2）培养基：效价检定用培养基（上层、底层）。
（3）抗生素：抗生素检品及标准品（高剂量、低剂量，高剂量与低剂量之比为2:1）。
（4）试剂与器材：灭菌生理盐水，无菌平皿，牛津杯，无菌吸管，镊子，滴管，直尺。
（1）取无菌平皿，加入20ml底层培养基，凝固后作为底层。
（2）用灭菌生理盐水将短小芽胞杆菌的芽胞悬液稀释至一定浓度以能得到清晰的抑菌圈，且标准品高浓度所得抑菌圈直径在18~22mm为基准。用无菌吸管吸取1ml芽胞悬液，加入到200ml恒温于50℃的上层培养基中摇匀，迅速以无菌吸管吸取5ml，注入到底层培养基上，铺平待凝。
（3）在平板底部四边，分别对角注明“sh”、“sl”
和“uh”、“ul”标记。
（4）镊子火焰灭菌3次，然后夹取4个牛津杯垂直放置在平板中标志附近（注：勿使钢管陷入培养基内，各小杯之间尽量等距）。
（5）以无菌滴管分别在每个牛津杯内加入相应的抗生素溶液至满但不溢出管外，且四杯内液面高度相同，盖上平皿盖，静置30分钟。
（6）将平皿置于37℃恒温培养箱培养16~18
h，量取各抑菌圈直径（sh、sl、uh、ul），以毫米为单位，误差不超过0.1mm。
（7）计算抗生素效价
（8）查放线图计算抗生素效价

② 微生物检验菌落总数计算方法是什么

7.1x0dx0a菌落总数的计算方法x0dx0a7.1.1x0dx0a若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平x0dx0a均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。x0dx0a7.1.2x0dx0a若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：x0dx0a（1）x0dx0ax0dx0a式中：x0dx0aN——样品中菌落数；x0dx0a∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；x0dx0an1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；x0dx0an2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；x0dx0a。x0dx0ad——稀释因子（第一稀释度）x0dx0a若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可x0dx0a7.1.3x0dx0a记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。x0dx0a若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计x0dx0a7.1.4x0dx0a算。x0dx0a7.1.5x0dx0a若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。x0dx0a若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU～300 CFU 之间，x0dx0a其中一部分小于 30 CFU 或大于 300x0dx0a7.1.6x0dx0aCFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。x0dx0a 这里有个例子参考一下以上是<食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定>中的计算方法。

③ 肉类抗生素检测方法有哪些

一种基于冰箱的肉类抗生素检测方法,将紫外激发光源和光谱相机安置于冰箱内部上壁,将肉类放置在冰箱内,开启光谱相机,连续采集n帧数据,每帧数据为八通道光谱图像,将每个通道取平均来降低紫外激发光源波动及光谱相机偏置噪声,获得八通道背景光谱数.

④ 药品领域的微生物检测及标准

中国药典微生物限度检查法，为《中国药典》附录收载的关于药品微生物检查的法定方法。药品的不同剂型的微生物检测标准不同，具体如下：

1、制剂通则品种

制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。

2、口服给药制剂

细菌数每1g不得过l000cfu。每lml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数每lg或lml不得过100cfu。

大肠埃希菌每1g或lml不得检出。

3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂

细菌数每1g、lml或l0cm²，不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数每1g、lml或l0cm²，不得过10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml或l0cm²不得检出。

大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、lml或l0cm²，不得检出。

4、阴道、尿道给药制剂

细菌数每1g、lml或l0cm²，不得过100cfu。

霉菌数和酵母菌数每1g、lml或l0cm²应小于10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm²，不得检出。

5、直肠给药制剂

细菌数每1g不得过l000cfu。每lml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数每1g或lml不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每lg或lml不得检出。

6、其他局部给药制剂

细菌数每1g、lml或l0cm²不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数每1g、lml或l0cm²不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml或l0cm²不得检出。

7、含动物组织

含动物组织（包括提取物）的口服给药制剂每10g或10ml还不得检出沙门菌。

8、兼用途径制剂

应符合各给药途径的标准。

(4)抗生素微生物检验计算方法扩展阅读

微生物限度检查法的注意事项：

1、当建立产品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。

2、检查项目应当包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

3、微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。

4、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

5、除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。

6、检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。

⑤ 什么方法能检测出牛奶中抗生素的具体含量

牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法
随着奶牛饲养业的发展，抗生素在预防和治疗奶牛疾病方面得到广泛的应用。生鲜牛奶中抗生素的来源主要是：第一，治疗泌乳期病牛时使用的抗生素会从奶牛体内移行到乳腺残留进入牛奶中，资料表明治疗后的奶牛，其挤出的牛奶5天内都有抗生素残留；其二，为了预防奶牛疾病并提高产量，在奶牛饲料中添加抗生素也会造成牛奶中抗生素的残留；第三，由于牧场管理不善，挤奶、储奶没有严格的卫生制度和配套的设施，人为添加或造成牛奶抗生素的污染。
牛奶中含有抗生素，不仅对人的健康造成很大的危害，而且对乳品加工企业带来经济损失（因无法生成酸奶和奶酪）。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留，除了要做好科学饲养、精心管理；正确挤奶和预防疾病外，还要规范抗生素的使用，按国标中有关规定，用药后的奶牛5天后所产的牛奶才可作为原料乳，并且要检测其残留。世界粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）、欧盟（EC）及美国的食品和药品管理局（FDA）等对食品中抗生素最大残留量都有明确的规定，我国也有鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）。
目前，鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类：生物测定法（微生物测定法、放射受体测定法）、免疫法（放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法）、理化分析法（波谱法、色谱及联用技术）。下面介绍几种常用的牛奶中抗生素残留检测方法。
TTC法
TTC法是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）的检测法，属生物检测法。其测定原理基于抗生素对微生物的抑制作用。如果牛奶中含有抗生素，则加入菌种（嗜热链球菌）经培育2.5~3小时后,加入TTC指示剂(三苯基四氮唑)不发生还原反应,所以样品呈无色状态;如果牛奶中不含抗生素,则样品呈红色.这样实验后样品颜色不变的为阳性,样品染成红色的为阴性。
TTC法的具体操作步骤:
1.菌液制备:将单菌种(嗜热链球菌)以脱脂乳为培养基,在36±1℃培养箱中培养15小时后,再以脱脂乳以至于1:1稀释待用;
2.取待检样液9mL,在80℃水浴加热5分钟后冷却到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小时,加入4%的TTC指示剂0.3mL, 36℃±1℃水浴培养30分钟;
3.若样液颜色不变为阳性,呈红色为阴性;若阳性的样液,再置于水浴中培养30分钟,不显色的为阳性,呈红色为阴性.
TTC法测定各种抗生素的灵敏度为:青霉素:4ppb,链霉素:500ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有费用低,易开展的优点;缺点是耗时长，要求操作人员需有一定专业知识且实验过程中菌液的制备、水浴过程控制都要求严格遵守操作规程，否则易出现假阳性，以致出现检验结果的不稳定性。
Delvotest? sp法（戴尔沃检测法）
该法最早在香港传到广东的，其使用是基于20世纪80年代初香港要求广东出口的生奶必须“无抗”且要求采用Delvotest法检测。该方法也是生物测定法，其试剂是由荷兰DSM公司生产并由AOAC认证。原理是利用微生物—嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5～3小时后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若牛奶样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素, 嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色.
Delvotest? sp 法的操作步骤:
1.以无菌操作将一片营养药片夹放入小试管内;
2.用微量移液管将0.1mL牛奶样品注入小试管内;
3.把小试管放入已预热至64℃的水浴箱或恒温器中培养;
4).定时3小时取出观察颜色变化.如果底部2/3的固体介质是黄色,则为阴性, 如果底部2/3的固体介质是紫色,则为阳性.
Delvotest? sp 法具有广谱性,可检测到?-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素,如磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素等，其中对青霉素和磺胺类抗生素特别灵敏. 其灵敏度为：青霉素:3ppb,链霉素:300ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便，严格实用，容易判断，结果可靠，费用适中等优点；但也易出现假阳性，实验证明：当牛奶样品中添加微生物防腐剂（如乳酸链球菌素—Nisn）或样品中有足够的洗涤剂残留时，便可影响嗜热芽胞菌生长而使实验为阳性。
Snap?法
该方法是酶联免疫法，由美国IDEXX公司生产其检测分析仪及其试剂盒，均获得AOAC认证，它利用了竟争酶联免疫技术。其基本原理是用特异性抗体将固相载体激活，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原在45℃±5℃共同保温，使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竟争与固定的抗体结合，然后进行洗涤和显色，内置抗生素标志物与固定的抗体结合形成的复合体，通过酶的作用分解可形成有色物质，通过测定色度并与参照物对照，就可以确定结果是阳性或阴性。
Snap?法操作步骤：
1.加入乳样于样品管中,摇匀,加热样品和检测板5分钟;
2.加入乳样于样品孔中,当激活圆环开始退却时,按Snap键;
3.反应4分钟,由Snap?读数仪读取并打印结果.检测读数小于1.05时判为阴性,大于1.05时判为阳性.
Snap?法是一种将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法,其敏感性和特异性好,检测的灵敏度以普遍使用的?-内酰胺类计：青霉素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,头孢西林:8ppb.其他抗生素如四环素等的检测,则需购买相应的试剂来检测. Snap?法检测结果快速准确, 9分钟内即可检测出牛奶中?-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量，且有半定量的读数，可监控牧场用药的情况；检测仪器稳定性良好，结果重现性高，整个检测过程简单方便；但需购置专用仪器和试剂，成本较高。
高效液相色谱检测法
它是一种理化检测方法,是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应来测定其含量.检测的过程采用了气相色谱理论,通过高压液相和高灵敏度的检测器,分离速度快、效率高和操作自动化。一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤，能检测抗生素的具体含量，敏感性较高，但检测程序复杂，费用较高，需购买色谱仪等检测设备，不适合小型检验室。
传统的抗生素检测方法不少,有的操作烦琐,有的实验条件要求高,有的检验时间太长;这些不仅会给乳制品生产企业造成经济上和时间上的损失,而且检测结果常常会被原辅材料和人为操作等因素所影响.鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题,乳品企业及牧场应重视和加强检测工作,应用一些简单、快速和准确性高的方法来监控产品的质量，保证消费者的健康。
http://szddi.com/foodonline/newsdetail.asp?id=15933

反应原理
本产品主要是利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理来进行的。在整个反应当中,样品中氯霉素含量越多，反应呈色就越淡。反之，样品中氯霉素含量越少，则呈色越深。
试剂盒组成
1、微量测试孔：每条8孔，每板12条
2、氯霉素标准溶液：
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35 ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶
3、10倍浓缩萃取稀释液：一瓶，30ml/瓶
4、10倍浓缩洗涤液：一瓶，30 ml /瓶
5、氯霉素酶标记物： 一瓶，8 ml/瓶
6、底物溶液：一瓶，12 ml/瓶
7、反应终止液：一瓶，13 ml/瓶
使用说明
A、注意事项
1、使用前先将氯霉素标准溶液6瓶，浓缩萃取稀释液，浓缩洗涤液，酶标记物，底物溶液及微量测试孔条置于室温下，回温30分钟。
2、原倍萃取稀释液及洗涤液配制
用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液分别以1： 9的比例稀释(即1mL浓缩液+9mL蒸馏水)，即可作为样品萃取稀释液与微孔板清洗液。
3、回温后，取出所需微量测试孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好，置于4oC保存。
B、样品制备
1.待测物为生乳，则依以下方法进行处理 (5倍稀释)
取100ul待测生乳加入400ul萃取稀释液，振荡混合后备用。
2.待测物为蜂蜜，则依以下方法进行处理
a.取2g蜂蜜、4ml蒸馏水与2ml 乙酸乙酯置入离心管中，震荡约5分钟，使其充分混合均匀。
b.离心10分钟(3000rpm)，取0.5ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50℃下氮气吹干(温度请勿超过50oC)。
c.加入0.5ml萃取稀释液，震荡约10秒钟后备用。
3. 待测物为血清、则依以下方法进行处理
a.抽取待检动物血液，离心或静置取其较透明之上层液(血清层)使用，注意不要有溶血。
b.将3ml血清加入离心管中，再加入6ml乙酸乙酯，震荡混合约30秒。
c.离心10分钟(3000rpm)，取2ml上层液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50oC下氮气吹干。
d.于此玻璃管中加入正己烷2ml，先将残余物完全溶解后，再加入1 ml萃取稀释液，震荡约30秒钟。
e. 离心10分钟(3000 rpm)，用吸管吸去上层液(正己烷) 及中间乳化层部分，弃掉。再吸取下层液(水层)备用。
f.若有乳化现象，请先将大部分上层液(正己烷)取出后，再将玻璃管置入80oC水中，隔水加热约5~10分钟，可改善乳化情形。
4. 待测物为鸡肉或鱼、虾，则依以下方法进行处理
a.将3克样品剪碎后放入50 ml离心管中，再加入6ml乙酸乙酯，并以均质机均质约1分钟，再震荡约30秒。
b.离心10分钟(3000rpm)，取2ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50oC下氮气吹干。
c.于此玻璃管中加入正己烷2 ml，先将残余物完全溶解后(若未能完全溶解，可能会导致回收率降低)，再加入1 ml萃取稀释液，震荡约30秒钟。
d.离心10分钟(3000 rpm)，用吸管吸去上层液(正己烷) 及中间乳化层部分，弃掉。再吸取下层液(水层)备用。
e.若有乳化现象，请先将大部分上层液(正己烷)取出后，再将玻璃管置入80oC水中，隔水加热约5~10分钟，可改善乳化情形。待测物为血清、则依以下方法进行处理
5.待测物为内脏(肝、心等)，则依以下方法进行处理(5倍稀释)
同上述步骤a~d，但下层液吸出后，再以萃取稀释液稀释5倍(即下层液50ul加萃取稀释液200ml)。
6.待测物为饲料，则依以下方法进行处理(10倍稀释)
同上述步骤a~d，但下层液吸出后，再以萃取稀释液稀释10倍(即下层液30ul加萃取稀释液270ml)。
C、操作步骤
本产品的酶标记物与氯霉素标准溶液均直接使用，无需再稀释。
1、于适当微孔中分别加入100mL标准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。
2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前处理的样品溶液。
3、再于每一微孔中另再加入50mL酶标记物。
4、轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育1小时。
5、将微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次。
6、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。
7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，轻敲盘子四周，使其充分混合。
8、于室温下避光静置温育20分钟。
9、于每一微孔中加入100mL反应终止液。
10、用酶标仪于波长450nm下判读。
D、判定
1. 计算B/B0值。用样品或标准液吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B0)再乘以100%。
2. 以B/B0值为纵坐标，以标样浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线。
3. 根据每个样品的B/B0值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。
4. 由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。
E、标准曲线

F、灵敏度
氯霉素试剂检测盒的平均检测下限为 0.05ppb，此浓度之吸光值与阴性标准溶液(0ppb)之吸光值有明显的差异。
G、 特异性
针对以下抗生素进行交叉反应之测试，结果如下：
Chloramphenicol =100%
Chloramphenicol(free base) <0.1%
Gentamycin <0.1%
Tetracycline <0.1%
Penicillin G <0.1%
Sulfamethazine <0.1%
H、再现性
针对氯霉素检测试剂盒精密度测试，重复6次，所得不同浓度标准溶液的吸光值变异系数(%CV)如图2所示，显示氯霉素试剂盒有很高的再现性:

I、回收率
生乳(添加1.0ppb)104~117%
蜂蜜(添加0.3ppb)90~110%
虾及鱼肉(添加0.5ppb)95~110%
鸡肉(添加0.5ppb) 90~120%
血清(添加0.5ppb)100~120%
内脏(添加1.0ppb) 100~120%
饲料(添加2.0ppb)80~110%

氯霉素检测试剂盒
简介
氯霉素(Chloramphenicol)是一种广谱抗生素。由于其具有效果好以及价格低廉等优点，目前已被普遍应用于各类家禽、家畜、水产品及蜂制品的各种传染性疾病的治疗。然而氯霉素有其严重的副作用,它会抑制人体骨髓的造血功能，从而引起再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症。目前，我国已禁止其使用。
我公司采用国内外先进的工艺与技术，研发出氯霉素ELISA检测试剂盒，简化了样品处理方式，使用简便，省时省力省钱，整个操作过程不到90分钟。本产品检测范围广(鸡肉、鱼、虾、蟹、牛奶、血清、肌肉、组织、饲料与蜂蜜等)，回收率为80%－120%，灵敏度可达到0.05ppb，是各类企业及各级政府检测机构的理想产品。
简单
1． 样品提取方便快捷。
2． 90分钟得到结果。
3． 只需基本的实验室设备。
4． 操作人员只需最基本的实验知识。
准确
1． 结果重现性高。
2． 精确至0.05ppb。
3． 与其它抗体的交叉反应率极低。
技术支持
我们为用户提供最方便、快捷、周到的服务。
产品规格
包装：每包96孔
灵敏度: 0.05ppb
测试区间：0.05ppb－4.05ppb
检测时间：80分钟(提取后)
储存条件：2-8℃

⑥ 微生物实验纸片法测定测定抗生素效价方法的整套实验步骤

1、配知顷制营养琼脂培养基
2、倒平板四个并编号1、2、3、4.
3、制菌悬液。4、将抗生素稀释成不同稀释度的梯度液。
5、取直径1cm
圆形滤纸若干，取四个分别放入不同梯度的抗生素溶液中浸泡一会。
6、平板凝固后接种。7、在平板中分别放入四个薯皮浸泡在抗生素溶液的滤纸片，间距适中
8、培养。数猛差9、观察