荧光定量pcr计算方法

⑴ 通过荧光定量PCR如何计算基因拷贝数

PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如： SYBR GREEN I ）或特异性的荧光探针（如： Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数： CT 值（ Cycle Threshold ）；通过将已知浓度标准品的 CT 值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。

⑵ 请问：做荧光定量PCR时，△△Ct值是什么意思，它的计算公式是什么

△△Ct这是相对荧光定量的一个计算公式的简化形式，用于比较不同样品之间的差别或变化比率。

Ct= -k lgX0+ b（线性方程）用这个方程可以通过Ct值算出样品的起始浓度

斜率=-1/lg(1+e)

扩增效率E=1, 斜率=-3.32

扩增效率范围：90%-110%

斜率范围：-3.1和-3.59之间

例如，想看a基因和b基因在某细胞系中表达量的差别，选取18s作为内参基因，就用a基因的Ct值减去18s的Ct值，得到△Ct1，用b基因的Ct值减去18s的Ct值得到△Ct2，然后用△Ct1-△Ct2=△△Ct，而a，b基因的表达量差别为2（-ΔΔCt）次方。

当然这计算方法是基于荧光定量的数学计算模型简化来的，平时使用没什么问题，如果两个目的基因的扩增效率不一样，这个计算方法是不能用的。

(2)荧光定量pcr计算方法扩展阅读：

荧光定量PCR应用领域

临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。

动物疾病检测：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

⑶ 做荧光定量PCR时，△△Ct值是什么意思，它的计算公式是什么

△△Ct = △Ct(试验样品) — △Ct(基准样品)
△Ct(试验样品) = Ct（试验样品,目的基因） — Ct（试验样品,内参基因）
△Ct(基准样品) = Ct（基准样品,目的基因） — Ct（基准样品,内参基因）
2 －△△Ct =2 －（－1.2）= 2.30

⑷ 荧光定量PCR的操作步骤

荧光定量PCR实验步骤： ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 ①反应体系 序号 反应物 剂量 1 逆转录buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆转录酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 总体积 10μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。 管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物F 0.5μl 3 阳性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 阳性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物F 0.5μl 3 内参照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待测样品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系： 序号 反应物 剂量 1 10×PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72℃延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下： 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待测样品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 总体积 50 ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。 各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

⑸ 实时荧光定量RT-PCR的Fold change怎么计算

3.Real-timeqPCR定量方法可以分为绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是2-DDCt。3.1绝对定量从标准曲线获得线性方程：Y=-3.432X+34.638;R2=0.995,E=95%，所以可以进行数据分析。如果未知样品的Ct=25，代入方程：25=-3.432X+34.638,所以：X=2.8Copies=10^2.83.22-DDCt定量2-DDCt方法使用的前提是内参和目的基因的扩增效率接近100%，且相差不超过5%。所用公式如下：2-DDCt=2-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]处理组-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]对照组=2-[E-F]处理组-[A-B]对照组=2(F-B)-(E-A)比如Cdk5在处理前和处理后样品中的Ct平均值是25和22.1；内参GAPDH在处理前和处理后样品中的Ct平均值是18.2和18.3.那么处理所致倍数变化(foldchange)应该是=2-[(22.1-18.3)]处理组-[(25-Ct18.2)]对照组=23=8也就是处理造成Cdk5表达增加了7倍。如果是目的基因和内参基因的扩增效率相差比较大，可以用扩增效率进行校正，也就是Pfaffl方法。所用公式如下：处理所致倍数变化(foldchange)=C(A-E)/D(F-B)扩增效率（E）=10-1/斜率(理想的PCR扩增效率=2)百分比表示为：e%=(E-1)×100%同时是上面例子，如果Cdk5的扩增效率是70%；GAPDH的扩增效率是95%，那么处理所致的倍数变化（foldchange）应该是=（1.7）（25-22.1）/(1.95)(18.3-18.2)=4.36即处理造成Cdk5表达量增加了3.36倍。

⑹ 实时定量PCR的结果是怎样分析的

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算。

2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。

3、举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。

4、首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。

5、几点注意：必须确定扩增的特异性，只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同），2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2，最好不用Syber Green。

(6)荧光定量pcr计算方法扩展阅读：

PCR原理：

1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

2、PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

参考资料来源：网络--PCR反应

⑺ 荧光定量pcr标准曲线怎么计算

采用相对法定量要求必须目的基因和内参具有相同的扩增效率,所以需要做efficiency
curve如果得到的斜率小于0.1,可以采用相对法,否则,需要重新设计能达到相同扩增效率的引物,或者就需要制作标准曲线,制作标准曲线,可以将基因片段克隆到质粒,然后体外转录成RNA,定量以后合成cDNA,然后按比例稀释后做出标准曲线,或者可以采用一个一直质量好的RNA样品,如细胞株,然后以此为标准制作.如果直接采用DNA做标准,那前提是RNA逆转录的效率一致.

⑻ 请问：做荧光定量PCR时，△△Ct值是什么意思，它的计算公式是什么

△△Ct = △Ct(试验样品) — △Ct(基准样品)
△Ct(试验样品) = Ct（试验样品，目的基因） — Ct（试验样品，内参基因）
△Ct(基准样品) = Ct（基准样品，目的基因） — Ct（基准样品，内参基因）
2 －△△Ct =2 －（－1.2）= 2.30
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⑼ 急急急 荧光定量PCR中相对定定量方法ΔΔCt法的条件及计算过程！！！！！

△△Ct = △Ct(试验样品) — △Ct(基准样品)
△Ct(试验样品) = Ct（试验样品，目的基因） — Ct（试验样品，内参基因）
△Ct(基准样品) = Ct（基准样品，目的基因） — Ct（基准样品，内参基因）
2 －△△Ct =2 －（－1.2）= 2.30