❶ 求教植物叶片POD酶活性的大致范围
求教植物叶片POD酶活性的大致范围
酶活性测定的原理：
超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的测定 SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。
SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。
过氧化氢酶（Catalase，CAT）
活性测定 CAT 活性参照Aebi (1984)[7]的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL 。400 μL反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。350µL反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100µmol/L邻苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
过氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。反应体系为30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）。反应在加入H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
❷ AsA-POD活性的计算方法
一、抗坏血酸含量测定
【原理】
还原型抗坏血酸(AsA)可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉(4，7－二苯基－1，10－菲咯啉，BP)反应形成红色螯合物。在534nM波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸(DAsA)可由二硫苏糖醇(DTT)还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。
【仪器与用具】
离心机；分光光度计；研钵；试管。
【试剂】
5％三氯乙酸(TCA)；
20％TCA；
无水乙醇溶液；
0�4％磷酸—乙醇溶液；
0�5％BP—乙醇溶液；
0�03％FeCl3—乙醇溶液；
0�6g／L DTT；
NA2HPO4—NAOH溶液：以0�2Mol／L NA2HPO4和1�2Mol／L NAOH等量混合；
60MMol／L DTT—乙醇。
【方法】
1.制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14Mg／L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1�0Ml于试管中，加入1�0Ml 5％TCA、1.0ml乙醇摇匀,再依次加入0�5Ml 0�4%H3PO4—乙醇、1�0Ml 0�5％BP—乙醇、0�5Ml 0�03%FeCl3—乙醇，总体积5�0Ml。将溶液置于30℃下反应90Min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。
2.提取取植物叶片1�0g，按1∶5(W／V)加入5%TCA研磨，4000r／Min离心10Min，上清液供测定。
3.测定
(1)AsA测定取1.0Ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。
(2)DAsA测定向1.0Ml样品液中加入0�5Ml 60MMol／L DTT—乙醇溶液，用NA2HPO4—NAOH混合液，将溶液PH调至7～8,置于室温下10Min，使DAsA还原。然后加入0�5Ml 20％TCA，把PH调至1～2。按AsA相同方法进行测定，计算出总AsA含量，从中减去AsA,即得DAsA含量。
二、抗坏血酸过氧化物酶(AsA－POD)活性
【原理】
AsA－POD催化AsA与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA)。随着AsA被氧化，溶液中290nM波长下的消光值(A290)下降，根据单位时间内A290减少值，计算AsA－POD活性。AsA氧化量按消光系数2�8(MMol／L)／CM计算，酶活性可用每克鲜重每小时氧化AsA的微摩尔数μMol／g·H表示。
【仪器】
离心机；紫外分光光度计；研钵；试管。
【试剂】
50MMol／L K2PO4—KH2PO4缓冲液(PH7�0，内含0�1MMol／L EDTA－NA2)�
0�3MMol／L AsA；
20μMol／L AsA；
0�06MMol／L H2O2。
【方法】
1�酶液制备取1�0g植物叶片剪碎，按1∶3(W／V)加入预冷的50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液进行研磨提取，用两层纱布过滤，滤液在4000r／Min下离心10Min，上清液作酶粗提液供测定。
2.酶活性测定3Ml反应混合液中含50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液(PH7�0)，0.1MMol／L EDTA－NA2，0.3MMol／L AsA，0�06MMol／L H2O2和0.1Ml酶液。加入H2O2后立即在20℃下测定10～30s内的A290变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性。
❸ sod酶活性测定方法
1、测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
2、在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
（1）改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
（2）化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。（3）Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。
（4）亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。
❹ 植物pod怎么算
pod过氧化物酶是过氧化物酶体的标志酶，是其一类氧化还原酶，它们能催化很多反应。过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于载体的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物和烃类氧化产物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用。
用以下公式计算活性：
式中：E436――每分钟吸光度的变化（436nm处）(15次的平均值)
Ew――67μl所用酶液中含酶的重量（0.00004958mg）
8.3――1μmol邻-联二茴香胺/mL的吸光度（436nm处）
2.067――反应混合物的总体积
GOD:
15min的平均值：
U1=181.23U/mg; U2=167.36U/ mg; U3=156.11U/ mg
4min的平均值：
U1=156.56U/ mg; U2=129.89U/ mg, U3=134.97U/ mg
❺ pod测定方法
0.5 g叶片加入50 mmol L-1磷酸缓冲液（pH7.8，含2％的聚乙烯吡咯烷酮），研磨，4℃ 8000 r/min离心20 min，上清液定容至5 ml。 POD活性测定按Kraus和Fletcher(1994)方法进行3 ml反应混合液中含0.2％愈创木酚0.95 ml，50 mmol L-1 PBS（pH7.0）1 ml，酶液0.05 ml，0.3％过氧化氢1 ml。记录1 min内470 nm下的光吸收值变化。
❻ 急呀 知道的给说一下 生化实验！！！制作定 量分析测定标准曲线的原理和方法
植物生理生化实验课程教学大纲
一、课程基本概况
1. 课程名称：植物生理生化实验
2. 课程名称（英文）： Experiments of Plant physiology and Biochemistry
3. 课程编号：B16035
4. 课程总学时：60学时（均为实验教学）
5. 课程学分：3学分
6. 课程分类：必修课
7. 开设学期：第3、4学期
8. 适用专业：园艺、农学、植物保护、植物生物技术等农科类本科专业。
9. 先行课：《物理学》、《化学》、《分析化学》、《植物生理生化》等。
二、课程性质、目的和任务
本课程是植物生理学的配套课程，是农科类各专业必修的专业基础课，属于以植物为对象各专业的工具课程之一。其先行课为物理学、化学、分析化学、植物学、生理生化。该课程主要介绍植物生理生化的实验研究技术以及常用植物生理生化指标的分析方法及原理，为专业课的学习与科学研究工作提供技术支持与手段。
通过本课程的学习，要求学生掌握植物生理生化的一些基本实验技术与原理，熟悉植物生理生化常规仪器的使用方法，能独立设计并完成一般性实验内容，操作规范，能够完成以植物为材料的基本的科学研究工作。从而达到更好地利用植物、人为地影响和改造植物，使之更大限度的为人类服务的目的。。
三、主要内容、重点及难点
实验一 应用纸层析分离鉴定氨基酸
（一）目的要求：学习纸层析分离技术，掌握纸层析分离鉴定氨基酸的原理和方法。
（二）重点：纸层析分离鉴定氨基酸的原理、操作方法、结果分析。
（三）难点 点样适量、分析确定层析结果。
实验二 氨基酸含量的测定——茚三酮比色法
（一）目的要求：掌握茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理和方法；学习分光光度计的使用；学习标准曲线的制作。
（二）重点：实验原理和操作方法
（三）难点：样品提取、标准曲线制作和使用。
实验三 可溶性糖含量的测定——蒽酮法
（一）目的要求：掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法，了解可溶性糖含量这一生理指标的意义。练习分光光度计的使用和标准曲线的制作。
（二）重点：实验原理和方法；蒽酮试剂的配制。
（三）难点：样品提取及适度稀释，标准曲线制作和使用。
实验四 蛋白质含量的测定
（一）方法：考马斯亮蓝比色法；福林酚比色法
（二）目的要求：掌握测定蛋白质含量的原理和方法，了解蛋白含量测定的意义及使用方面。练习分光光度计的使用和标准曲线的制作。
（三）重点：了解实验原理，正确运用方法。
（四）难点：样品提取及适度稀释，标准曲线制作和使用。
实验五 酶的基本性质
（一）目的要求：通过实验，进一步理解酶的重要性质和影响酶活性的条件。
（二）重点：酶的专一性，温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响，鉴定酶促反应速度快慢的依据和方法
（三）难点：鉴定酶促反应速度快慢的依据和方法。
实验六 RNA的提制
（一）目的要求：掌握浓盐法提制RNA的原理和方法，进一步理解RNA的理化性质。
（二）重点：理解实验原理和各步操作的方法、意义和目的。
（三）难点：理解实验原理和各步操作的方法、意义和目的。
实验七 RNA含量的测定
（一）目的要求：掌握苔黑酚法测定RNA含量的原理和方法；学习RNA含量和纯度的计算方法及计算原理；进一步练习分光光度计的使用和标准曲线法的应用。
（二）重点：掌握苔黑酚法测定RNA含量的原理和方法；学习RNA含量和纯度的计算方法及计算原理。
（三）难点：正确称量，掌握测定原理。
实验八 淀粉酶活性的测定
（一）目的要求：了解α淀粉酶和β淀粉酶催化的产物和作用条件，掌握α淀粉酶活性、β淀粉酶活性和淀粉酶总活性的测定原理和方法；进一步理解酶的作用条件。
（二）重点：淀粉酶活性的测定原理和方法，进一步理解酶的作用条件。
（三）难点：通过控制实验条件，准确测定不同淀粉酶的活性。
实验九 电泳法分离酶或蛋白质
（一）方法：醋酸纤维薄膜电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）目的要求：掌握电泳的概念、原理以及电泳技术
（三）重点：电泳的原理和电泳技术
（四）难点：电泳技术的掌握
实验十 谷物种子中赖氨酸含量测定
（一）方法：茚三酮溶液显色法；染料结合（DBL）法；.三硝基苯磺酸（PDAB）法
（二）目的要求：掌握测定原理、方法及技术
（三）重点：原理及标准曲线制作
（四）难点：材料处理
实验十一 植物组织水势的测定
（一）方法：小液流法
（二）目的要求：学习并掌握小液流法植物组织水势的测定方法，理解水分在细胞内外的转移的条件和水势的概念。
（三）重点：测定原理和方法
（四）难点：根据试材确定浓度系列；检验操作方法。
实验十二 呼吸强度的测定
（一）方法：小篮子法；氧电极法。
（二）目的要求：掌握呼吸强度的测定原理和方法；学习滴定管的使用。
（三）重点：测定原理和方法。
（四）难点：滴定管的使用；滴定终点的把握。
实验十三 叶绿素含量的测定
（一）方法：光电比色法
（二）目的要求：掌握分光光度法测定叶绿素含量的原理和方法；学习分光光度计的使用。
（三）重点：叶绿素的提取、含量计算。
（四）难点：叶绿素的提取、定容；按要求稀释到适当浓度；正确地使用分光光度计。
实验十四 光合色素的提取分离与理化性质
（一）目的要求：进一步理解光合色素的重要理化性质；学习鉴定理化性质的方法。
（二）重点：光合色素的种类；光合色素的化学与光学性质；纸层析分离鉴定光合色素的方法。
（三）难点：皂化反应；吸收光谱。
实验十五 硝酸还原酶活力测定
（一）方法： 对-氨基苯磺酸法。
（二）目的要求：掌握测定硝酸还原酶活力的原理及方法，加深对硝酸还原酶在植物体内重要作用的认识；学习真空泵的使用；练习标准曲线的制作。
（三）重点：测定原理和方法；真空泵的使用；标准曲线的制作。
（四）难点：理解测定原理；制作出符合要求的标准曲线；理解各步操作的目的性。
实验十六 种子生活力的测定
（一）方法（三种方法同时做）：红墨水染色法；TTC染色法；BTB显色法。
（二）目的要求：理解测定原理；学会用三种方法测定种子生活力。
（三）重点：三种方法的原理与操作；各步注意事项。
（四）难点：在实践中能根据具体种子的特点选择适用的测定方法；能正确判别种子的生活力。
实验十七 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
（一）方法：NBT光化还原法。
（二）目的要求: 认识SOD的作用及测定SOD活性的意义，掌握SOD的测定原理和方法。
（三）重点：掌握测定原理和方法；理解照光的意义。
（四）难点：测定原理；具体使用中能根据酶活决定加入提取液的数量；各种试剂的作用；实验条件的控制。
实验十八 过氧化物酶（POD）活性的测定
（一）方法：联苯胺氧化法；愈创木酚法。
（二）目的要求：认识过氧化物酶的作用，掌握过氧化物酶活性的测定原理和方法。
（三）重点：明了测定原理；掌握测定方法。
（四）难点：具体使用中能根据酶活决定加入提取液的数量及三滤乙酸的量；准确保温。
实验十九 丙二醛（POD）含量的测定
（一）方法：硫代巴比妥酸法。
（二）目的要求：认识丙二醛的来源、作用及测定意义，掌握测定原理和方法。
（三）重点：测定原理和方法
（四）难点：明了测定原理；掌握测定方法。
实验二十 植物细胞差别透性的测定
（一）方法：电导率仪法。
（二）目的要求：了解逆境对细胞膜透性的影响，掌握电导仪法测定细胞膜透性的原理和方法；学习电导仪的使用。
（三）重点：明了测定原理；掌握测定方法；学会使用电导率仪。
（四）难点：正确控制实验环节，正确使用电导率仪。
实验二十一 光合强度的测定
（一）方法：改良半叶法；氧电极法；光合测定仪法。
（二）目的要求：学习不同方法测定光合强度的原理；进一步理解总光合强度和净光合强度；掌握测定方法；要求能根据需要和条件独立完成光合强度测定。
（三）重点：相关仪器的使用、测定原理和方法；实验环节的条件控制。
（四）难点：正确使用仪器和测定方法。
实验二十二 脯氨酸含量影响
（一）方法：酸性茚三酮法；磺基水杨酸法。
（二）目的要求：掌握脯氨酸的测定方法及原理；能根据需要独立完成测定过程。
（三）重点：标准曲线的制作、植物材料的处理。
（四）难点：标准曲线的制作、植物材料的处理。
实验二十三 植物根系活力的测定
（一）方法：TTC比色法；α-萘胺氧化法。
（二）目的要求：理解根系活力的内涵，掌握根系活力的测定原理和方法。
（三）重点：实验原理和方法
（四）难点：操作方法
实验二十四 维生素C含量的测定
（一）方法：滴定法；二苯胺萃取比色法；2，4二硝基苯肼比色法；荧光法。
（二）目的要求：掌握测定原理和方法；能根据需要和条件选择适当的测定方法。
（三）重点：相关仪器的使用、测定原理和方法；实验环节的条件控制。
（四）难点：正确掌握操作方法。
实验二十五 综合性实验——植物组织中POD的提取分离纯化与鉴定
（一）方法：采用分段盐析法提取分离POD；用透析法脱盐；用福林酚法测定蛋白质含量；愈创木酚法测定POD活性，计算比活力和回收率；用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定POD同工酶。
（二）目的要求：掌握实验的基本原理和方法；能设计实验操作流程。
（三）重点：相关仪器的使用、测定原理和方法；各实验环节的衔接。
（四）难点：实验技术的综合运用。
实验二十六 设计性实验——植物组织衰老过程中的生理变化
（一）方法和实验流程：设计使植物组织衰老的处理方法；根据理论知识，设计在衰老的不同阶段测定与衰老有关的生理指标；确定各生理指标的测定方法；写出实验设计方案；配制药品；取材、测定；写出实验报告。
（二）目的要求：学习实验设计方法，初步培养科学研究的基本能力。
（三）重点：实验设计、相关仪器的使用、测定原理和方法；各实验环节的衔接。
（四）难点：试验设计、实验技术的综合运用。
四、学时分配表
教学时数分配
顺 序
授 课 内 容
学时分配
小计
生化实验部分
（第三学期与生化理论课教学平行开课）
实验一
应用纸层析分离鉴定氨基酸
4
4
实验二
氨基酸含量的测定——茚三酮比色法
3
3
实验三
可溶性糖含量的测定——蒽酮法
3
3
实验四
蛋白质含量的测定——福林酚法
3
3
实验五
RNA的提制
4
4
实验六
RNA含量的测定
3
3
实验七
淀粉酶活性的测定
4
4
实验八
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶
6
6
综合性实验
（任选）
将蛋白质含量测定、酶活性测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳三项实验内容综合起来，开设综合性实验植物组织POD的提取分离纯化与鉴定。
18
18
备选实验一
酶的基本性质
4
4
备选实验二
谷物种子中赖氨酸含量测定
3
3
生理实验部分
（第四学期与植物生理理论课教学平行开课）
实验十一
植物细胞水势测定
3
3
实验十二
呼吸强度测定
3
3
实验十三
光合色素含量测定
3
3
实验十四
光合色素的提取分离与理化性质
3
3
实验十五
硝酸还原酶活性测定
3
3
实验十六
种子生活力快速测定
3
3
实验十七
超氧化物岐化酶（SOD）活性测定
3
3
实验十八
过氧化物酶（POD）活性测定
2
2
实验十九
丙二醛（MDA）含量测定
3
3
实验二十
细胞差别透性测定
4
4
备选实验一
光合强度测定
4
4
备选实验二
脯氨酸含量测定
3
3
备选实验三
根系活力测定
3
3
备选实验四
维生素C含量测定
3
3
设计性实验（任选）
将光合色素含量测定、POD、SOD活性测定、MDA含量测定和细胞差别透性测定结合起来，开设设计性实验植物组织衰老过程中的生理变化。
15
15
注：根据需要和实验室条件从中选择60学时实验，生理、生化部分各30学时。
五、课程教学的基本要求和主要环节
（一）实验教学的基本要求：
1．坚持精讲多练的原则，讲授、演示、指导与学生独立设计独立完成相结合，让学生成为实验课主体。
2．将能力培养做为实验课的主要目标追求。一方面要求学生掌握实验原理，能根据实验原理适当调整实验步骤；另一方面训练学生能根据专业研究的需要，能独立地从选择实验内容、确定实验方法、试剂配制、实验条件控制、仪器使用等环节完成实验内容；
3．把培养学生动手能力做为实验课重点之一，达到规范操作目的。
4．实验内容可根据需要和实验室条件在大纲范围内选择10～11项，并应根据需要和实验室条件启动备选实验。
（二）教学主要环节
1．实验教学：与相应理论课相伴进行。
2．考试及成绩构成：本课程为考查课。成绩由两部分构成，一是实验报告成绩，占总成绩的30%～50%；二是期末考试成绩，占总成绩的50%～70%。
六、本课程与其它课程的联系与分工
本课程与物理学、化学、分析化学、植物学、生理生化理论课有重要联系，与化学尤其是分析化学的联系尤为重要。
化学课为本课程奠定试剂配制、实验室基本操作方法与操作规范的基础，本课程运用这些知识与技能基础完成教学，并在教学中使之巩固和强化；
植物学为以植物为材料试材准备和取舍提供基础知识；
植物生理生化为本课程的学习提供必要的理论指导，本课程的学习加深对生理生化知识的理解，并使深奥的理论知识具有可操作性，甚至使之物质化。
七、建议教材与参考教材
建议教材：刘永军主编《植物生理生化实验》，中国农业科技出版社，2002年。
参考教材：
1．李合生主编. 植物生理生化实验原理及技术.北京：高等教育出版社，2000.
2．李建武等主编. 生物化学实验原理和方法. 北京：北京大学出版社，2000.
3．白宝璋等. 植物生理学测试技术. 中国科学技术出版社，1993
4．西北农业大学. 基础生物化学实验指导. 陕西科学技术出版社，1986
5．张志良主编. 植物生理学实验指导（第二版）. 北京：中国农业出版社，2000.
6．邹琦主编. 植物生理学实验指导. 北京：高等教育出版社，1990.
7．朱广廉等主编. 植物生理学实验. 北京：北京大学出版社，1990 .
9．李秀锦主编. 实用生化实验技术. 北京：中国农业出版社，1995.
10．刘福岭编着. 食品物理与化学分析方法. 北京：轻工业出版社，1987.
11．张承圭等合编. 生物化学仪器分析与技术. 北京：高等教育出版社，1990.
12．何忠孝主编. 电泳. 北京：科技出版社，1999.
13．华东师范大学生物系植物生理教研组编. 植物生理学实验指导，人民教育出版社，1980
14．.植物生理与分子生物学报
15．.植物生理学通讯
❼ SOD活性怎么测
超氧化物歧化酶(SOD)的催化底物是O2 ，一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位。由于O2 自身很不稳定，且不易制备，测定SOD的方法除少数采用直接法外，一般多为间接法。
1．直接法 原理是根据O2 或产生O2 的物质本身的性质测定O2 的歧化量，从而确定SOD的活性。经典的直接法包括：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法(EPR)、核磁共振法。由于所需的仪器设备价格昂贵,一般较少应用。
2．一般化学法 这些方法的共同特点是要有一个O2 的产生体系和一个被O2 还原或氧化的可检测体系。在SOD存在下，一部分O2 被SOD歧化，因而O2 还原或氧化检测体系的反应受到抑制。根据反应受抑制程度，测定SOD的活性。一般化学法有邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、羟胺法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法、没食子酸法、6-羟多巴胺法、亚硝酸盐形成法和碱性二甲亚砜法。
常用的有： (1) 邻苯三酚自氧化法：即改良Marklund法。原理是基于经典的分光光度法，在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm(经典为420nm)，同时产生O2 ，SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量。本法具有特异性强，所需样本量少(仅50μl)，操作快速简单，重复性好，灵敏度高，试剂简单等优点。 (2) 细胞色素C还原法(McCord法)：原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2 使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在时，由于一部分O2 被SOD催化而歧化，O2 还原细胞色素C的反应速度则相应减少，即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中SOD活性。本法是间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。
3．化学发光法原理是黄嘌呤氧化酶在有氧条件下，催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸，同时产生O2 。后者可与化学发光剂鲁米诺反应，使其产生激发。SOD能清除O2 从而抑制鲁米诺的化学发光。本法可应用于SOD的微量测定，不仅灵敏度高，简便易行，而且特异性与准确性至少与细胞色素C还原法类似。
4．免疫学方法上述方法测定的是SOD活性，免疫学方法则可测定样品中SOD的质量，因此特异性较好，是较理想的测定SOD方法，免疫法有放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。但其缺陷是只能测定抗体相应的抗原，对于检测不同种类的SOD，则须制备相应的特异性抗体，手续繁琐。
5．电泳法电泳染色定位法的基本原理是根据光化学法与NBT还原法。电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色(呈现棕色区带)也可采取SOD活性负染色(呈现无色透明区带)。根据凝胶上电泳分离的SOD区带的着色深浅与面积大小，对样品进行半定量分析，也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。染色定位法常用于鉴定SOD，很少为了定量，主要原因是它不及化学法简便，但鉴定SOD却较化学法为优。用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白，有无同工酶，且可半定量地确定SOD的活性大小。
6. 平行放在距20 W荧光灯管3 cm处的光照台上，光照8 min后，立即在200A分光光度计的460 nm波长下比色。用测得的结果计算样品中的SOD含量。
SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内 6性极强的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧链条。