‘壹’ 超详细细胞计数步骤
细胞计数是科学研究中不可或缺的部分，旨在准确、重复性和统计意义上获取细胞数量和存活率。常用的计数工具有细胞计数板与细胞计数仪。
细胞计数板是通过激光蚀刻的网格辅助在光学显微镜下计数样本细胞，得出实验样品细胞总数。其核心原理在于中央有两个细胞计数池，池上有网格划分成9个主要方格，角上四个方格细分16个更小方格，中心主要方格则被划分为25个更小方格，每个小方格进一步细分16个微型方格。计数时，样品从上样口加入，借助毛细作用填满网格。
执行细胞计数板步骤如下：
首先，清洁并擦拭细胞计数池和盖玻片以去除纤维、指纹或水印。其次，通过轻轻摇动细胞悬浮液，使其单个细胞分散。接着，使用微量移液器吸取10微升细胞悬浮液至上样口，使其通过毛细作用进入细胞计数池，填满网格。随后，让细胞静置，选择适当物镜，将细胞计数板置于显微镜载物台上。在显微镜下观察细胞，若每个大方格内细胞少于5个，需重新离心，用更小体积重悬细胞；若细胞相互重叠或密度太大难以区分，需要再次稀释至更大体积。注意记录稀释倍数，以便计算细胞浓度。
在计数过程中，根据样品细胞密度决定选取方格大小。细胞数量较少时，计数一个角落方格所有细胞；数量适中时，选择16个较小方格之一；密度较高时，计数中央25个小方格之一。确保每个方格至少有20-50个细胞进行计数。计数原则是记上不记下，记左不记右，并计算四个同样大小方格内的平均细胞数。计算1毫升体积中的细胞数，将平均细胞数乘以10000（网格中的大方格体积为万分之一毫升）。如果计数的是大方格，乘以1；较小方格乘以16；中央方格乘以25。若细胞悬浮液在上样前已稀释，还需乘以稀释倍数。
细胞总数计算公式：已知1毫升中细胞总数为5E6个/mL，若样品体积为5毫升，细胞总数为5E6个/mL * 5mL = 2.5E7个细胞。若取的细胞悬液已稀释，总数还需乘以稀释倍数。
细胞计数完成后，应清洁盖玻片和细胞计数池。另外，可以测定细胞存活率。使用96孔板进行细胞铺板，是细胞计数与存活率测定的后续步骤。
‘贰’ 科研 | 血细胞计数板的使用方法
普通光学显微镜、血球计数板、吸水纸、盖玻片、吸管、移液枪、枪头、离心管、镊子（取用盖玻片）、无水乙醇或 95% 乙醇溶液、
如果需要将细胞进行稀释需要加入培养基吗？还是生理盐水，缓冲溶液都可？
二、实验步骤
血球计数板的准备：取血球计数板，检测血球计数板是否清洁，如果有污垢，应先洗涤干净并擦干。用无水乙醇或 95% 乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张。先在低倍镜下，熟悉计数板和计数区的构造。
加盖玻片，盖住血球计数板两边的小槽。
制备细胞悬液：将动物细胞用稀释液制备成适当浓度的细胞悬液备用。
（如果需要染色，需要在充液之前将染色液按照一定的比例加入细胞悬液中）
充液: 用滴管或者移液器将一小滴震荡混匀的稀释的细胞悬液滴在盖玻片边缘的玻片上，细胞悬液借毛细管现象自动渗入计数室中。如果加入的液体过多，会进入计数取两侧的凹槽内，使盖玻片浮起，需要用滤纸把多余的液体吸出。
避免滴入过少细胞悬液，易产生气泡。如果加入的过少，需要洗净计数板，干燥后重做。
充液后静置1-2min，待细胞下沉后，方可计数。
先用低倍镜找到血球计数器的计数区。
计数结束后，清洗计数板，整理试验台。
三、计数原理
1、熟悉血细胞计数板的计数区
2、计数时只计数中央
3、细胞浓度计算
细胞浓度计算公式：
细胞浓度(细胞个数/mL) = (80小方格内细胞个数÷80)×400×104×稀释倍数
4、细胞计数原则
计数区每个中方格内16个小方格要依次计数，遵循 S形计数原则。
在计数靠近中方格边线（为双线）的细胞时，遵循“计上不计下，计左不计右”原则。
如发现各中方格中的细胞数目相差20个以上，表明细胞分布不均匀，须重新计数。
四、实验注意事项
血球计数板为易碎品，请务必轻拿轻放。
检查计数板，确保清洁。
方格网的分隔线无色，在相差显微镜下更容易看到。
充液时，避免滴入过多细胞悬液，溢出并流入两侧槽内，使盖玻片浮起。避免滴入过少细胞悬液，易产生气泡。
计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。
二次重复计数误差不应超过 ±5%
如果细胞数量较多的情况下，可取一滴（或100ul）细胞混悬液＋八滴（或800ul）细胞培养液＋一滴（或100ul）苔盼蓝，这样最终稀释倍数为十倍。
五、染色计数
如果需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。
细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞内而使细胞着色（蓝色）。
1、用滴管吸取 0.4% 台盼蓝染液，按 1∶1 比例加入细胞悬液中。
2、镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。
3、计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。
参考网址：
https://www.icourse163.org/learn/XMU1207467801tid=1207788203#/learn/contenttype=detail&id=1213913014&cid=1217906593（中国大学慕课-细胞与显微技术实验课程）
http://paper.dxy.cn/article/501668（丁香园-献给初学者：手把手教你做细胞计数实验）
文章文字稿整理自中国大学慕课
‘叁’ 细胞计数的通用步骤和注意事项
细胞计数是生物学实验中至关重要的步骤，主要用于评估细胞的数量和生长状态。在实验中，它对于监测细胞培养密度、研究不同条件下的细胞生长效果至关重要。细胞计数方法主要分为直接计数和间接计数，其中血球计数板计数法是常用的直接计数法，它涉及胰蛋白酶消化细胞、制备单细胞悬液并借助显微镜进行计数。
血球计数板计数操作步骤如下：首先，消化或收集细胞并制成单细胞悬液。接着，用酒精擦拭计数板，盖上盖玻片，吸取20微升悬液滴入计数板，使用10倍物镜观察，计数25个格子内的细胞。然后，根据公式计算细胞浓度和总数。值得注意的是，计数过程中需确保细胞悬液充分分散，避免细胞团导致误差，同时遵循特定的计数规则，如忽略边缘线上的细胞。
血球计数板虽然成本低廉，但人工操作较多，易产生误差。在使用时要注意细胞悬液的准备，及时操作以防止细胞聚集，以及正确处理细胞团的计数问题。如果细胞成团，可以尝试裂解细胞后计数细胞核。实验过程中，还要注意细胞数量的适宜范围，过多或过少都可能影响结果准确性，需要适当调整计数区域和方法。
以上是细胞计数通用步骤和注意事项的详细解释，希望对你的实验研究提供帮助。
‘肆’ 血球计数板使用方法
血球计数板是用于测定微生物数量的精密工具。在进行操作前，应将待测菌悬液稀释至适当浓度，一般斜面稀释100倍，以确保每小格内的菌体数量可计数。
接着，准备一块洁净的血球计数板，用盖玻片覆盖计数区。将菌悬液均匀摇匀后，用滴管吸取适量液体，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片边缘滴入，让菌悬液自行填满计数区，注意避免气泡产生，并用吸水纸吸去多余液体。
等待一段时间，让细胞沉降，不再随液体漂移。然后，将血球计数板置于显微镜下，先使用低倍镜找到计数区，再切换至高倍镜进行观察与计数。在观察时，应适度减弱光线强度，以便更清晰地识别细胞。
对于16中方格组成的计数区，需计数左上、左下、右上、右下的4个中方格（共100个小格）内的菌数。若计数区有25中方格，则还需计入中央1中方格的菌数（共80个小格）。为确保计数准确性，应统一规定如何处理位于格线上的细胞。例如，如果菌体位于大方格的线上，仅计数上线不计下线，仅计数左线不计右线，以减少误差。
对于出芽的酵母菌，当芽体达到母细胞大小的一半时，可将其作为两个菌体计算。每个样品应重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），并根据公式计算出每毫升（克）菌悬液所含细胞数量。
完成计数后，小心取下盖玻片，用清水冲洗血球计数板，避免使用硬物洗刷或抹擦，以保护网格刻度。将血球计数板自然晾干或用吹风机吹干后，存放在盒内。
血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具
‘伍’ 血细胞怎么做计数实验
实验
目的原理 了解血细胞计数的原理并掌握红细胞、白细胞、血小板计数的方法，红细胞计数结果结合血红蛋白值还可以计算出红细胞平均血红蛋白量(MCH)可作为生理机能检查和临床诊断的指标。用相应的稀释液将血液稀释若干倍(另有抗凝、固定、着色作用)，置于计数室中，在显微镜下计数一定容积内的血细胞数。 稀释血液有血细胞吸管法和试管法，本实验采用后者。
实验对象与用品 鸡或家兔。血细胞计数板、专用盖玻片、吸血管、显微镜、手揿计数机、血细胞稀释液、拭镜纸、毛笔。
方法步骤
(一)熟悉计数室
血细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer) 计数板在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格。四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。中央大方格被划分为２５个中方格，每一中方格又划分成１６个小方格(图8－2称２５×１６，也有的计数板为１６×２５的，小方格面积一致)。中央大方格的四角及中心５个中方格(１６×２５者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。
(二)红细胞计数
先用试管稀释法制备禽类血细胞悬液：将禽类红细胞稀释液Ⅰ、Ⅱ分别置水浴锅中预热到４１～４２℃，取Ⅰ液１mL于试管中，用吸血管加入新鲜鸡血(或肝素抗凝血)２０霯，再加入Ⅱ液１mL混匀，置该水浴锅中保温５０s左右，置室温，即为待检的血细胞悬液。可用于充液计数。取干洁的计数板，置于水平的显微镜载物台上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜(图8－3)。静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃。计数时用虹彩、集光器、反光镜等调节入射光角度和强度，认清 计数室位置。采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则(图8～4)。依次计数并记录５个中方格中分别有多少个红细胞。
(三)血小板计数
采取血液并立即与抗凝剂混合(由于血小板具有趋向于凝集和粘附于异物表面的特性)。以血小板稀释液(１０％EDTANa2 １０mL与０.８％NaCl９０mL组成)将血液稀释２００倍，混匀后滴入血细胞计数室内，静置１５min，待血小板下沉后。于高倍镜下计数(同红细胞 计数)。在高倍镜下血小板呈椭圆形、圆形或不规则的折光小体分布于红细胞间，注意与杂质相区别。也可用复方尿素稀释液稀释血液，应静置２０min以上，待红细胞充分溶解后再充液计数。
(四)计算
按计数室构造及血液稀释倍数,将血细胞计数结果换算成每立方毫米中血细胞的个数。以每１００mL血液中的血红蛋白量（g）乘以１０再除以红细胞数（106/mm3）得红细胞平均血红蛋白量（MCN，单位μμg）。
(五)仪器洗涤
计数板、盖玻片和测定管用清水冲洗，再用绸布或细布沾干。
要求与思考题
１.计算结果，报告中简要说明计算过程。求出本组同学测定的均值并评价之。
２.了解各类稀释液成分，分析各物质的作用。
注意事项
１.充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计
数。
２.计数板、盖玻片、吸血管及测定管等用过后必须立即按要求洗涤干净。
组织建议 将相同类型的计数板集中在一个组内，便于指导。本实验属于基本操作，各位朋友均应独立操作得出结果。
附注：
1.本法可同时计数禽类白细胞数，计算方法也类似。
2.禽类血细胞稀释液为：
Ⅰ液
中性红 25.0mg
NaCl 0.9g
加蒸馏水至100.0mL
Ⅱ液
结晶紫 12.0mg
柠檬酸钠 3.8g
福尔马林 0.8mL
加蒸馏水至100.0mL
3.哺乳类红细胞稀释液可用生理盐水或阿扬(Hayem)氏液(NaCl 1g，Na2SO4·10H2O 5g，HgCl2 0.5，加蒸馏水至200mL过滤)。白细胞稀释液成分为冰醋酸0.1mL，1%龙胆紫1mL加蒸馏水至100mL，或直接用2%醋酸溶液。
4.血小板复方尿素稀释液配方为：尿素10g，柠檬酸钠0.5g，甲醛0.1mL，加蒸馏水到100mL，混合，待完全溶解后过滤。置冰箱内可保存1～2周。