植物幼苗花青素的提取方法和步骤

‘壹’ 花青素的纯化方法

原花青素(简称PC)是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物。植物化学家通常将从植物中 分离得到的一切无色的，在无机酸存在和加热处理下能产生红色的花青素(cyanidin)的一类多酚化 合物统称为原花青素。从20世纪60年代初至今，原花青素抗氧化、清除自由基等一系列化学反应已 被初步揭示，这类天然产物在医药、食品、日用化 学品等领域的应用日益广阔。全世界对原花青素的研究越来越深入，其中对原花青素提取、分离、纯 化方法的研究是一大重点，现将原花青素提取、分 离、纯化方法综述如下。

1 原花青素的提取方法

植物材料中原花青素的提取率与材料的状况和 提取条件密切相关。植物材料的贮存、干燥、粉碎 度，提取溶剂、温度等都可能导致原花青素化学结 构的变化和提取率的改变，从而改变原花青素的理化性质和生物活性.

当测定原材料中的原花青素含量时，贮存时间 越长，可能会导致测定结果降低。同时样品中的水 分含量也会导致测定结果降低。而且干燥条件的不 同也会导致提取率的变化，最好是采用冷冻干燥， 避免高温。

样品提取前一般要经过粉碎，通常较细的粉末 有利于提取，但过细时提取率反而会降低。

提取剂的选择也是影响提取率的关键因素。因 为原花青素在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢 键和疏水键形式形成稳定的分子复合物，原花青素 分子间也是如此。因此原花青素的提取剂，不仅要 求对其有很好的溶解性，而且还必须有氢键断裂作 用。因此有机溶剂和水的复合体系(有机溶剂占总 体积的50％～70％)最适合提取。有机溶剂的提 取能力顺序为丙醇<乙醇<甲醇<丙酮<四氢呋喃，其中应用较多的是丙酮一水体系和甲醇一水体 系。

当植物样品中铁等金属离子含量较大时，原花 青素在中性条件下与金属离子发生络合沉淀，沉积 在纤维中不利于提取。此时也必须采用酸化溶剂， 一方面断裂原花青素与蛋白质、多糖及本身离子间 的氢键和疏水键，另一方面断裂原花青素一金属离 子络合键，提高提取率。

1．1 传统有机溶剂提取

Ayroles等在1991年发明酮类化合物水溶液作 提取剂提取银杏叶中的原花青素的方法。采用酮类化合物的水溶液作提取剂，提取液过滤后，用碱调 节滤液pH值至9左右，使原花青素沉淀，再用酸 调节滤液至pH值为2左右，在(NH4) SO 存在条件下用c ～c 酮类萃取滤液中的原花青素，除去酮类 化合物，干燥。

Romanczyk等发明从可可中提取原花青素时， 对脱脂可可豆用质量分数70％MeOH／去离子水提 取后，再用质量分数70％丙酮／去离子水溶剂提取 2次，真空浓缩，除去有机溶剂后，再溶于水中， 用CHC1，提取，其水相用乙酸乙酯提取后，真空浓 缩除去乙酸乙酯，水相冷冻干燥，得到原花青素。

1．2 绿色溶剂—— 水提取技术

由于丙酮等有机溶剂可能带来环境污染和产品 的有毒有机物残留，人们在大力发展对环境友好的绿色提取技术。1998年Duncan和Gilmour发明一 种从植物材料(树皮、树叶、葡萄籽、皮、大豆、绿茶)中提取原花青素的方法。将材料粉碎(≤15 mm)，常压、60℃～100℃或高压100℃～125℃条 件下采用脱氧热水提取(1 min～20 h)，过滤采用超滤 或反渗透或两者连用，浓缩滤液，真空喷雾或冷冻 干燥，此法主要是提取分子量≤5 000 D的水溶性原花青素，得率为0．5％～10．0％之间，通常为6．5％ 一9．6％ (随取样部位的差异而定)，分离得到原花 青素B 、B，、B 和c 。获得的产物对AAPH引发 的亚油酸的氧化有明显抑制作用，1肛g／mL能达 到70％～79％的抑制率。毒理学检测表明：对于按人体重剂量给药组和100倍人体重量的剂量给药组 24 h内无毒害和副作用产生，慢性毒理学(5个月) 实验也无明显毒、副作用。

1999年Karim等人发明了在加压条件下，采用 脱氧去离子水提取植物材料中的原花青素。将提取 液超滤后，采用疏水性微孔聚合物树脂作填料的柱 色谱方法，选用极性洗脱液(乙醇+水)洗脱，将 洗脱液采用反渗透方法除去乙醇，干燥得到原花青素。

1．3 超临界流体萃取技术

孙传经等发明一种采用超临界二氧化碳加丙酮 和水组成的极性改性剂，从银杏叶中萃取含有原花青素提取物的方法。在萃取温度60℃～90℃，萃取 压力20 MPa～35 MPa下加入丙酮与水的体积比为 (50％～80％)：(50％～20％)的极性改性剂，萃 取时向2 h-4 h，进行静态、动态萃取。萃取液经传统的树脂浓缩和喷雾干燥器干燥，得到精制银杏叶 提取物。产品含银杏黄酮甙>35 g／100 g，萜内酯> 8 g／100 g，原花青素<7 g／100 g，酚酸<5 mg／kg。该法的优点是流程短，能萃取最强的天然抗氧化剂原花青素。2000年孙传经等又发明一种超临界CO 从黑加仑籽中提取黑加仑籽油和原花青素低聚物的方法。该法分两步进行：第一步，是利用超临界 CO 提取黑加仑籽油，控制萃取压力在25 MPa一 29 MPa，温度为60℃ ；第二步是超临界CO2加人 丙酮与水的体积比为70：30的改性剂，CO 与改性 剂流量体积比为4：1，压力为22 MPa～25 MPa，温度为60℃，提取原花青素低聚物。黑加仑籽油得 率为16％，原花青素低聚物得率为4％。该法优 点是同时获得两种产品，流程简单可靠，CO 和改 性剂循环利用，产品中无溶剂残留，对环境无污 染。

1．4 微波提取技术

刘征涛等发明了一种采用频率为2450 MHz或 915 MHz、功率为500 W～15 000 W 的微波对葡萄籽 在选用水、碳链长为C ～C，的醇、乙醚、丙酮、乙 酸乙酯、甲苯或其混合物的溶剂中进行处理，从葡 萄籽提取原花青素类物质的新方法。该方法较常规 化学法工艺简便、高效、快速，成本低，废液排放 量少。

1．5 双水相萃取方法

自1956年瑞典伦德大学的Albertsson发现双水 相体系到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多 年历史，但由于其条件温和，容易放大，目前已成 功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离纯化。近几年来，有关双水相萃取技术提取中草药 有效成分的文献开始报道，尽管数量不多，但是已 有的实例充分表明其有良好的应用前景。用双水相萃取体系富集分离银杏叶浸提液的研究，表现良好 的分配系数和分离效果。研究认为双水相体系具有 分相快，使用温度低，易于操作等待点，且所使用的PEG及盐类对人体及环境无毒害，萃取率高，为 银杏黄酮化合物富集分离的一种有效方法。尽管双 水相萃取对中草药提取研究的应用处于起步阶段，这一技术的应用有望为从天然产物中提取有效成分 提供一个新的思路。

2 原花青素的纯化、分离

2．1 液相萃取法

原花青素的纯化多采用乙酸乙酯、甲苯、二氯 甲烷、醚等多级有机溶剂通过液相萃取的方法进行，这类方法因为有机溶剂用量大，对环境可能带 来污染，同时也容易造成产品中有毒有机物残留。

2-2 柱层析法

目前常采用的纯化方法多用柱层析法进行。王 建清等对大麦中的原花青素丙酮提取液，采用 PVPP树脂作柱层析的填料，以CH CN作流动相进 行纯化。

Ricardo da silva等将葡萄用甲醇提取，提取液 回收甲醇后，通过聚酰胺柱进行初步分离，先用中 性水洗去酚酸，再用体积比30：70的乙腈／水洗脱 儿茶素，再用体积比75：25丙酮水洗脱原花青素， 进行纯化。

刘睿等采用大孔树脂对高粱中的原花青素用乙醇 的水溶液进行纯化，得到产物纯度大于95 g／100 g的 低聚体原花青素。

2．3 固相萃取法

从复杂体系中选择性地萃取所需成分，固相萃 取(SPE)是其中最为有效的方法之一。1999年 Lazarus等人对杏仁皮、葡萄汁和红葡萄酒中的原花 青素采用SPE方法进行纯化，条件：supelcosil Envi一18 20mL SPE柱，流动相：丙酮：水：乙酸= 70：29．5：0．5 (体积比)。Kennedy和Waterhouse 对红葡萄酒中的原花青素采用c一18柱(Alhech)， 流动相：水和甲醇。洗脱除去有机酸、糖类和其他 不溶于有机相中的化合物而将提取得到的原花青素 进行纯化。

2，4 凝胶色谱法

凝胶色谱也常用于原花青素的纯化。 SephadexLH一20是一种对黄酮类化合物具有高度亲 和性的羟丙基化葡聚糖凝胶，Sephadex LH一20凝 胶色谱目前多用于原花青素的纯化和分离。但 Sephadex LH一20凝胶的物理特性决定其并不能对原花青素进行高效率分离。所以进一步的纯化和分离 要采用凝胶过滤色谱或HPLC进行。

此外，Sepherdex 75HR作为平均粒度为13 m 的葡聚糖聚合物，也用于原花青素的纯化、分离， 其能承受超过1．8 MPa的反压，尽管这种材料的商业 柱通常用于蛋白质的分离，发现其分离原花青素的 能力优于Sephadex LH一20。McMurrough和Madigan 将大麦提取液浓缩后，直接采用高效凝胶过滤色谱 (Sepherdex 75HR)，用甲醇洗脱，根据uV检测， 收集洗脱物，用DMACA鉴定每个组分。Escribano— Bail 6 n et al采用Sephadex LH一20和半制备RP—HPLC对葡萄籽中的原花青素进行纯化。

Rigaud等对可可和葡萄籽的提取物，采用凝胶 渗透色谱(GPC)TSK G 2500 Hxl和TSK G3000 Hxl， 采用四氢呋喃(流速1 mL／min)洗脱进行纯化。

2．5 微生物发酵法

Ariga等发明一种由活性酵母，可将用水和有 机溶剂提取得到的提取物中的淀粉发酵除去而达到 纯化原花青素的目的；同时还发现纯化的原花青素 中金属离子也能较好的被除去，如果提取剂是水和 水／乙醇，能直接浓缩后发酵，若提取剂是丙酮， 则要除去丙酮后才能进行发酵。常用的酵母有：葡 萄酒酵母、酵母属和接枝酵母属的菌株。

2．6 高速逆流色谱法

高速逆流色谱技术由美国国家医学院Ito Yiochiro 博士20世纪60年代首创，最初是一种制备型色谱技术，是一种不用固体载体或支撑体的液液分配色 谱，主要根据化合物在不相溶的两相间的分配能力 进行分离，具有分离效率高，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和污染，制备量大，溶剂消耗 少，而且操作条件简单(室温、Teflon惰性柱材) 的特点。目前已被广泛用于天然药物材料的制备和分析。

目前高速逆流色谱仪已成功开发出分析型和制 备型两大系列。即高速逆流色谱仪既可用于天然药 物成分的制备分离，又可定量。进样量从几毫克到克，进样体积从几毫升到几十毫升，不但适于非极 性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离，既 适合于天然产物功效成分的粗分，也可进一步精制、纯化。

2-7 分子烙印技术

分子烙印技术(molecular imprinting technology， MIT)是20世纪末出现的一种高选择性分离技术，由于MIT模仿了生物界的锁匙作用原理，使制备的 材料具有极高的选择性，因而很快在许多相关领域 如手性分离和底物选择性分离、固相萃取、化学或生物传感器、不对称催化和模拟酶等方面得到了应 用。在普通分离方面，较之传统方法，MIT法具有 高效、快速、专一的优点。MIT法在手性分离方面的作用更是无与伦比。据统计，现有药物60％具 有一个或一个以上的手性中心，而对映体间的药效 及对人体影响有很大不同，因此1992年美国食品和药物管理局规定，今后含不对称中心的药物必须 将光学异构体分离开。相对于传统方法的一筹莫展，MIT法就显得非常珍贵了。P>

周力等人在2002年制备了以槲皮素为模板的 分子烙印聚合物(MIP)，从沙棘粗提物中分离提取槲皮素和异鼠李素两种黄酮，得到良好的分离效果。 谢建春等用非共价法，在极性溶剂中、以丙烯酰胺 作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备了分子烙印聚合物(MIP)。液相色谱实验表明，MIP 对懈皮素具有特异的亲合性，将此MIP直接分离银杏叶提取物水解液，得到主要含模板槲皮素及与槲 皮素结构相似化合物山奈酚两种黄酮的组分。研究 证实了MIP技术用于直接分离、提取中草药中具有特定药效化合物的可行性。

‘贰’ 如何提取花青素

花青素，是一种热敏性活性物质。属于水溶性多酚黄酮类化合物，其特殊的结构和化学成分赋予了花青素多种生物活性，这些活性物质对温度较为敏感，当所在环境温度超过一定界限后，就会失活，也就是我们俗话说的死掉。（比如我们都知道，乳酸菌、益生菌等都属于热敏性活性物质，不能加热，否则失去活性就会失去其主要作用。）花青素失活就会失去其特有的功效作用。
有机溶剂萃取法
这是目前国内外最广泛使用的提取方法。多数选择甲醇、乙酮、丙酮等混合溶剂对材料进行溶解过滤，通过调节溶液酸碱度萃取滤液中的花青素。国内吴信子等用盐酸一甲醇溶液提取，然后用纸层析法(中号)和柱层析法(聚乙酰胺)进行花色苷的分离 。目前，有机溶剂萃取法已成功地应用于诸如葡萄籽、石榴皮、蓝莓等绝大多数含花青素物质的提取分离。有机溶剂萃取法的关键是选择有效溶剂，要求既要对被提取的有效成分有较大溶解度，又要避免大量杂质的溶解。该方法原理简单，对设备要求较低，不足之处是大多数有机溶剂毒副作用大且产物提取率低。
2水溶液提取法
有机溶剂萃取的花青素多有毒性残留且生产过程环境污染大，有鉴于此，水溶液提取应运而生。该方法一般将植物材料在常压或高压下用热水浸泡，然后用非极性大孔树脂吸附；或直接使用脱氧热水提取，再采用超滤或反渗透，浓缩得到粗提物。它是Duncan和Gilmour(1998)发明的提取花青素的方法 ，此方法设备要求简单，但产品纯度低。
3超临界流体萃取法
超临界流体萃取是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响进行提取。这种方法产品提取率高，但设备成本过高。孙传经 采用超临界CO：萃取法从银杏叶、黑加仑籽及葡萄籽中提取花青素工艺进行了研究。该工艺中CO 和改性剂可循环使用，对环境无污染。

‘叁’ 如何提取花青素

蓝晓科技花青素提取树脂介绍

花青素提取纯化方法较多，但受保健食品与化妆品行业对原料溶剂残留的严格限制要求，目前行业使用较为普遍的是水提+大孔吸附树脂吸附的工艺，即将植物原料在常压或高压下用水浸提，经必要的过滤预处理后，提取清液采用非极性大孔吸附树脂吸附富集，再用乙醇解吸。

为了达到更好的分离纯化效果，需要选择不同类型的吸附树脂进行富集纯化，蓝晓科技在多年的花青素树脂分离纯化研究与工业实践过程中，自主研发出了适用不同原料进行花青素提取的树脂系列：

▲XDA-6和LSA-12 主要应用于越橘、黑加仑、蓝莓、浆果类来源花青素等提取。

▲LSA-10 主要用于葡萄籽、松树皮、花生衣等来源花青素提取。

▲LX-32 主要用于紫薯、紫甘蓝、萝卜等蔬菜类来源花青素的提取。

‘肆’ 如何证明花青素的存在

如何证明花青素的存在？

花青素是一种水溶性色素，可以随着细胞液的酸碱改变颜色。细胞液呈酸性则偏红，细胞液呈碱性则偏蓝。花青素(anthocyanins)是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。经由苯基丙酸类合成路径(phenylpropanoid pathway)和类黄酮生合成途径(flavonoids biosynthetic pathway)生成。影响花青素呈色的因子包括花青素的构造、pH値、共色作用(copigmentation)等。果皮呈色受内在、外在因子和栽培技术的影响。光可增加花青素含量；高温会使花青素降解。花青素为植物二级代谢产物，在生理上扮演重要的角色。花瓣和果实的颜色可吸引动物进行授粉和种子传播 (Stintzing and Carle, 2004)。常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层。部分果实以颜色深浅决定果实市场价格。花青素属于酚类化合物中的类黄酮类(flavonoids)。基本结构包含二个苯环，并由一3碳的单位连结(C6-C3-C6)。花青素经由苯基丙酸路径和类黄酮生合成途径生成，由许多酵素调控催化。以天竺葵色素(pelargonidin)、矢车菊素(cyanidin)、花翠素(delphinidin)、芍药花苷配基(peonidin)、矮牵牛苷配基 (petunidin)及锦葵色素(malvidin)六种非配醣体(aglycone)为主。花青素因所带羟基数(-OH)、甲基化(methylation)、醣基化(glycosylation)数目、醣种类和连接位置等因素而呈现不同颜色 (范和邱, 1998)。颜色的表现因生化环境条件的改变，如受花青素浓度、共色作用、液胞中pH値的影响 (Clifford, 2000)。本文目的为了解影响花青素生合成的因子，以作为田间栽培管理的参考。
橙色和黄色是胡萝卜素的作用。1910年在胡萝卜中发现了β-胡萝卜素，以后共发现另外2种胡萝卜素异构体，分别是：α、β、γ三种异构体。1958年β-胡萝卜素获得专利（US2849495，1958年8月26日，专利权人：Hoffmann La Roche），目前主要从海洋中提取，也可人工合成

自然界有超过300种不同的花青素。他们来源于不同种水果和蔬菜如越橘、酸果蔓、蓝莓、葡萄、接骨木红、黑加仑、紫胡罗卜和红甘蓝、颜色从红到蓝。这些花青素主要包含飞燕草素（Delchindin）、矢车菊素（Cyanidin）、 牵牛花色素（Petunidin）、芍药花色素（Peonidin）.

花青素颜色随PH值发生变化，从当PH值为3时的覆盆子红到当PH值为5时的深蓝莓红。在大多数应用中这些色素具有良好的光、热和PH稳定性，并且能够承受巴氏和UHT热处理。花青素广泛地应用在饮料、糖果、果冻和果酱中。

近年来对作为多酚的花青素对健康可能带来的好处的关注越来越集中。将来花青素的这种特性在功能食品和保健食品中有可能得到日益应用。目前市场上有比较成熟的花青素产品，这些花青素主要是越橘花青素、蓝莓花青素、蔓越橘花青素、接骨木花青素、黑莓花青素和黑豆皮花青素等，含量均为25%或40%。国内西安天一生物技术有限公司的 薛西峰先生做了详细的提取工艺研究，并于2001年开始大规模生产25%的花青素成品。

花青素的作用
花青素为人体带来多种益处。从根本上讲，花青素是一种强有力的抗氧化剂，它能够保护人体免受一种叫做自由基的有害物质的损伤。花青素还能够增强血管弹性，改善循环系统和增进皮肤的光滑度，抑制炎症和过敏，改善关节的柔韧性。下面列出花青素的部分功效：

1.有助于预防多种与自由基有关的疾病，包括癌症、心脏病、过早衰老和关节炎；

2.通过防止应激反应和吸烟引起的血小板凝集来减少心脏病和中风的发生；

3.增强免疫系统能力来抵御致癌物质；

4.降低感冒的次数和缩短持续时间；

5.具有抗突变的功能从而减少致癌因子的形成；

6.具有抗炎功效，因而可以预防包括关节炎和肿胀在内的炎症；

7.缓解花粉病和其它过敏症；

8.增强动脉、静脉和毛细血管弹性；

9.保护动脉血管内壁；

10.保持血细胞正常的柔韧性从而帮助血红细胞通过细小的毛细血管，因此增强了全身的血液循环、为身体各个部分的器官和系统带来直接的益处，并增强细胞活力；

11.松弛血管从而促进血流和防上高血压（降血压功效）；

13.防止肾脏释放出的血管紧张素转化酶所造成的血压升高（另一个降血压功效）；

14.作为保护脑细胞的一道屏障，防止淀粉样β蛋白的形成、谷氨酸盐的毒性和自由基的攻击，从而预防阿尔茨海默氏病；

15.通过对弹性蛋白酶和胶原蛋白酶的抑制使皮肤变得光滑而富有弹性，从内部和外部同时防止由于过度日晒所导致的皮肤损伤等等。