无菌检测方法在药典的哪里

1. 中国药典无菌检查法的供试品的无菌检查

检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“抽验数量 系指一次试验所用供试品最小包装容器的数量（支或瓶），成品每亚批均应进行无菌检查。除另有规定外，原液、半成品和成品按表1规定，上市产品监督检验按表2规定。 ”） 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“接种量 系指每个最小包装的最少取样量（ml或g），接种供试品量按表3规定。若采用直接接种法，按接种量要求等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中(两种培养基的接种支（瓶）数之比为2:1);若采用薄膜过滤法，应采用三联薄膜过滤器，其中两联假如硫乙醇酸盐流体培养基，一联加入改良马丁培养基。只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。”） 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照的菌液制备同培养基灵敏度检查项下金黄色葡萄球菌菌液制备方法，加菌量小于100cfu。阳性对照也可在供试品无菌检查14天后，取其中一份硫乙醇酸盐流体培养基，加入小于100cfu阳性对照菌，作为阳性对照。阳性对照置30℃～35℃培养48～72小时应生长良好。”） 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。
操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。

2. 什么是无菌检查法

无菌检查法
无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。
无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。
生物制品应按卫生部《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。
培养基及其制备方法
1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)
酪胨（胰酶水解）
15g
氯化钠
2.5g
葡萄糖
5g
新鲜配制的0.1％刃天青溶液
1.0ml
L－胱氨酸
0.5g
(或新鲜配制的0.2％亚甲蓝溶液 0.5ml)
硫乙醇酸钠
0.5g
琼酯
0.5～0.7g
(或硫乙醇酸0.3ml)
水
1000ml
酵母浸出粉
5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
在无菌检查接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5。否则,须经水浴煮沸加热, 只限加热一次。
2.霉菌培养基
胨
5g
磷酸氢二钾（K2HPO4)
1g
酵母浸出粉
2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
0.5g
葡萄糖
20g
蒸馏水
1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH约6.8，煮沸,加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟。
3.选择性培养基
(1) 对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后摇匀，分装，115℃灭菌30分钟。
(2) 吐温培养基(用于油剂药品的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加10ml的吐温80，摇匀后，分装，115℃灭菌30分钟。
4.营养肉汤培养基
胨
10g
肉浸液
1000ml
氯化钠
5g
取胨与氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
5.营养琼脂培养基
照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
6.0.5％葡萄糖肉汤培养基
胨
10g
葡萄糖
5g
氯化钠
5g
肉浸液
1000ml
取胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2， 分装，115℃灭菌30分钟。
7.霉菌琼脂培养基
照霉菌培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
上述培养基分别按15ml与40ml分装于试管中，装量约为试管高度的2/5，在115℃灭菌30分钟。细菌培养基经30～35℃培养48小时，霉菌培养基经20～25℃培养72小时后，应无菌生长。
培养基的质量应通过灵敏度检查。
培养基灵敏度检查法
1.菌种
(1)藤黄微球菌(Micrococcus Lutea)[CMCC(B)28001]

(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2.操作
取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的霉菌琼脂斜面的新鲜培养物分别用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌的不含琼脂需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物,吸入灭菌离心管，离心，弃去上清液，菌体用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。分别取上述菌悬液用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标 准管相同的浓度，然后，作10倍系列稀释并计数。

将藤黄微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分别接种至9ml试验培养基中,每个稀释度至少接种3管,以未接种的培养基管作对照，细菌试验管置30～35℃培养3天,白色念珠菌试验管置20～25℃培养5天。逐日记录结果。
3.结果判定
以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种菌量均应小于10个），三次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判定标准。
需气菌、厌气菌培养基灵敏度为藤黄微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:10<6>。
[附注]
肉浸液制备法
取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后,每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。
对照用菌液
1.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）菌液
取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至需气菌、厌气菌培养基内,在30～35℃培养16～18小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释成1:10<6>。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液
取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,再接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小时，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<6>。
3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液
取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的霉菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至霉菌培养基内，在20～25℃培养24小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<5>。
检查法
1. 直接接种法
(1) 供试品如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液, 任取供试品2支（瓶）以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面后,以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管，其中1管接种对照用菌液1ml，供作阳性对照；取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照, 另接种于霉菌培养基2管，供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量,按下列规定取用：
供试品装量
每管接种量
培养基分装量
2ml或2ml以下
0.5ml
15ml
2ml以上至20ml
1.0ml
15ml
20ml以上
5.0ml
40ml
接种后轻轻摇动,使匀。需气菌、厌气菌培养基在30～35℃培养5日, 霉菌培养基在20～25℃培养7日，抗生素类药品均培养7日，放射性药品培养5～7日。培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有细菌生长）；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时,可取该培养液转种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
(2) 供试品如为注射用灭菌粉末或无菌冻干品，照该药品项下的规定或按该药品剂量项下的溶剂用量，加入灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液,使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。
(3) 供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药，按各该药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。
(4) 供试品如为外科敷料，取供试品2个包装，以无菌操作拆开包装,于不同部位剪取约1cm×3cm的样品，分别接种于40ml培养基中。
(5) 供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌使用的浓度；或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。
(6) 供试品如为抗生素药品,取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下,取最大规格量2份，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，分别等量接种于每管装量为40ml的培养基中。
(7) 供试品如为放射性药品，取供试品1瓶(支)，以每管接种量为0.2ml，接种于每管装量为7.5ml的培养基中。
2. 薄膜过滤法
(1)供试品如为抗生素药品，取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下取最大规格量2份, 分别按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9％灭菌氯化钠溶液至少100ml或其他适宜的溶剂中, 摇匀, 以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内,减压抽干后,用0.9％灭菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜3次,每次至少100ml；取出滤膜,分成4片, 取3片分别放在3管各40ml需气菌、厌气菌培养基中, 其中1管接种对照用菌液1ml,供作阳性对照, 另1片放在霉菌培养基管中。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。

(2) 供试品如为抗厌氧菌药品，取规定量的供试品，按上述方法经薄膜过滤器处理后，取出滤膜，分成4片，其中3片放在3管需气菌、厌气菌培养基管中，1管接种生孢梭菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。另1片放在霉菌培养基管中。 取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
(3) 供试品如为抗真菌药品，取规定量的供试品,按上述方法经薄膜过滤器处理后,取出滤膜,分成4片，取2片分别放在2管需气菌、厌气菌培养基管中；2片分别放在2管霉菌培养基管中,其中1管接种白色念珠菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
结果判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管阴性时,可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法倍量复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。

3. 中国药典无菌检查法的附表

表1批出厂产品最少检验数量 供试品 批产量N（个） 接种每种培养基所需的最少检验数量 注射剂
大体积注射剂（>100 ml） ≤100
100<N≤500
>500 10%或4个（取较多者）
10个
2%或20个（取较少者）
2%或10个（取较少者） 眼用及其他非注射产品 ≤200
>200 5%或2个（取较多者）
10个 桶装无菌固体原料
抗生素固体原料药（≥5克） ≤4
4<N≤50
>50 每个容器
20%或4个容器（取较多者）
2%或10个容器（取较多者）
6个容器 医疗器具 ≤100
100<N≤500
>500 10%或4件（取较多者）
10件
2%或20件（取较少者） 注：若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。
（注：“抗生素固体原料药（≥5克）和医疗器具”为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法项目。《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法
表1 出厂制品不同规格及原液和半成品最少抽验数量） 供试品 批产量（N）；装量（V） 最少抽验数量 注射剂 N≤100 5个 100<N≤500 10个 N>500 20个 冻干血液制品 V>5ml 每柜冻干N≤200 5个 每柜冻干N>200 10个 V≤5ml N≤100 5个 100<N≤500 10个 N>500 20个 原液或半成品 每个容器取样，取样量为每个容器制品总量的0.1%或不少于10ml。每开瓶1次，应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每批抽验量应不少于3ml。 表2液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量 供试品装量V（ml） 每支供试品接入每种培养基的最少量 供试品最少检验数量（瓶或支） ≤1
1<V<5
5≤V<20
20≤V<50
50≤V<100
50≤V<100(静脉给药)
100≤V≤500
V>500 全量
半量
2ml
5ml
10ml
半量
半量
500ml 10①
10
10
10
10
10
6①
6 注：①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法
表2上市制品监督抽验数量） 品种及装量（V） 最少抽验量 血液制品V<50ml 6个 血液制品V≥50ml 2个 其它生物制品 10个 表3固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量 供试品装量M/支或瓶 每支供试品接入每种培养基的最少量 供试品最少检验数量(瓶或支) M <50mg
50mg≤M<300mg
300mg≤M<5g
M≥5g
外科用敷料棉花及纱布
缝合线、一次性医用材料
带导管的一次性医疗器具
（如输液袋）
其它医疗器具 全量
半量
150 mg
500 mg
取100 mg或1cm×3cm
整个材料③
整个器具③（切碎或拆散开） 10①
10
10
10②
10
10①
10
10① 注：①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。②抗生素粉针剂（≥5克）及抗生素原料药（≥5克）的最少检验数量为6瓶（支）。桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。③如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法
表3不同规格制品的最少接种量） 规格每支（瓶）供试品的最少接种量液体制剂（ml）V≤1 全量1<V≤5半量5<V<202ml20≤V<5010mlV≥50半量原液或半成品M <50mg半量固体制剂 M <50mg 全量50mg≤M<300mg半量300mg≤M<5g150mgM≥5g半量

4. 中国药典无菌检查法的供试品处理及接种培养基

除另有规定外，按下列方法进行。 薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm。直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
水溶液供试品取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其分成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“取规定量，每支（瓶）供试品装量为5ml及以下者，全部转移至含适宜稀释液100ml的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，2个滤器中加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，另一滤器中加入改良马丁培养基100ml。”）
可溶于水的固体制剂供试品取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“水溶性固体供试品”）
β-内酰胺类抗生素供试品取规定量，按水溶液或固体制剂供试品的处理方法处理，立即过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜。再用含适量β-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基，必要时培养基中可加少量的β-内酰胺酶；或将滤膜直接接种至含适量β-内酰胺酶的培养基中。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目）
非水溶性制剂供试品取规定量，直接过滤；或混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。用含0.1～1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“用含0.1～1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次。”）
可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯①中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过44℃，趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
注①：无菌十四烷酸异丙酯的制备 采用薄膜过滤法过滤除菌。选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜，在140℃干热灭菌2小时。
无菌气（喷）雾剂供试品取规定量，将各容器置至少－20℃的冰室冷冻约1小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，并将供试液转移至无菌容器中，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
装有药物的注射器供试品取规定量，排出注射器中的内容物置无菌容器中，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“取规定量，将注射器中的内容物（若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解），直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。然后按水溶性供试品项下方法操作。”）
具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品取规定量，每个最小包装用50～100ml冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品项下方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目） 直接接种法即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。若供试品具有抑菌作用，可加入适量的无菌中和剂或灭火剂，或加大每个容器的培养基用量。供试品检查时培养基的用量和高度同方法验证试验。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。取规定量供试品，等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中（2种培养基的接种支数或瓶数之比为2:1）。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法验证试验。”）
混悬液等非澄清水溶液供试品取规定量，接种至各管培养基中。
固体制剂供试品取规定量直接接种至各管培养基中。或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量接种至各管培养基中。
非水溶性制剂供试品取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，接种至各管培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的各管培养基中。
敷料供试品取规定数量，以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取约100mg或1cm×3cm的供试品，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目）
肠线、缝合线等供试品肠线、缝合线及其它一次性使用的医用材料按规定量取最小包装，无菌拆开包装，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目）
灭菌医用器具供试品取规定量，必要时应将其拆散或切成小碎段，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目）
放射性药品取供试品1瓶(支)，接种于装量为7.5ml的硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中。每管接种量为0.2ml。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目） 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份，一份置30℃～35℃培养14天，另一份与接种后的改良马丁培养基置20℃～25℃培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌种鉴定。） 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。
若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：
⑴无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。
⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。
⑶供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。

5. 中国药典中药物微生物检测在哪部

你好，微生物检测方法在中国药典2010年版二部附录XI J，具体方法为附录XI J微生物限度检查法
微生物限度检査法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅
料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、
酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁
净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格
遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品
中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期
按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方
法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活
剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检査法中细菌及控制菌培养温度为
30〜35°C;霉菌、酵母菌培养温度为23〜28°C
检验结果以lg,lml、10g、10ml或10cm
2为单位报告，特
殊品种可以最小包装单位报告。
检验量
检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm
2
)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂
为100cm
2
»贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要
求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中
10g或10ml用于阳性对照试验）。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂
还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单
位）的3倍量供试品。
供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法
制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不
应超过451C。供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过
1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1. 液体供试品
取供试品10ml ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至
100ml，混匀，作为1 ： 10的供试液。油剂可加人适量的无菌
聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混
合的供试品原液作为供试液。
2. 固体、半固体或黏稠性供试品
取供试品10g ，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至
100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1 ： 10的供试
液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温
使供试品分散均匀。
3. 需用特殊方法制备供试液的供试品
(1) 非水溶性供试品
方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的（温度不超
过45'C)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无
菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加人45"的
pH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供
试品充分乳化，作为1 ： 20的供试液。
方法2 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙
酯（制法见附录H H无菌检査法中供试品的无菌检查项下）
和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯
的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加人45\：的pH7.0
无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5〜：L0分钟，萃取，静
置使油水明显分层，取其水层作为1 •• 10的供试液。
(2) 膜剂供试品.
取供试品100cm
2
，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓
冲液lOOmK必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1 ： 10的
供试液(3) 肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g,加pH6. 8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制
剂）或pH7. 6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，
置45t:水浴中，振摇，使溶解，作为1 :
10的供试液。
(4) 气雾剂、喷II剂供试品
取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消
毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室
温，并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器
吸出全部药液，加至适量的PH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
(若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80)中，混匀，取
相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1 ： 10的供试液。
(5) 贴剂供试品
取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或
塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱
布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置
于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的
稀释剂中，用力振荡至少30分钟，制成供试液。贴剂也可采
用其他适宜的方法制备成供试液。
(6) 具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除
供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。
① 培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养
基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测
定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml,每
lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基,混匀，凝固，
培养，计数。每lml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即
为lml的菌落数，计算每lml供试液的平均菌落数，按平皿法
计数规则报告菌数;控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。
② 离心沉淀法取一定量的供试液，500转/分钟离心3
分钟，取全部上清液混合。用于细菌检査。
③ 薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的"薄
膜过滤法"。
④ 中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试
品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或
灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

6. 中国药典无菌检查法的检验条件

无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。
注：《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行版国家标准分为：
GB/T16292-2010医药工业洁净室(区)悬浮粒子的测试方法
GB/T16293-2010医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法
GB/T16294-2010医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法 培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2℃～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1．硫乙醇酸盐流体培养基
酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g
葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g
L-胱氨酸 0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 ml
硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g
(或硫乙醇酸) （0.3ml) 水 1000 ml
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ，否则，须经100 ℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
硫乙醇酸盐流体培养基置30℃～35℃培养。
2．改良马丁培养基
胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g
酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g
葡萄糖 20.0g 水 1000 ml
除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。
改良马丁培养基置23℃～28℃培养。
3．选择性培养基
按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
4．0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）
胨 10.0g 氯化钠 5.0g
葡萄糖 5.0g 水 1000 ml
牛肉浸出粉 3.0g
除葡萄糖外取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
（注：此培养基为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法中特有项目。）
5．营养肉汤培养基
胨 10.0g 氯化钠 5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水 1000 ml
取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
6．营养琼脂培养基
按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
7．改良马丁琼脂培养基
按改良马丁培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH 值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
无菌性检查每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。
灵敏度检查
菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕
菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18小时～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml 含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，置30～35℃培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，20～25℃培养5天。逐日观察结果。
（注：以上培养温度为《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法添加，一部、二部无温度。）
结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
（注：《中国药典》2010版一部附录ⅩⅢB无菌检查法、《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法称为“结果判断”。）