abc染色法的实验方法及步骤

A. 革兰氏染色的步骤和原理

革兰氏染色的步骤和原理如下:

步骤:

1、首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用滚如灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。

2、固定。将载玻片在火焰上方固定。

3、染色。加路哥式碘液大概一滴，作用1 min后用水冲洗，注意流水不要直接往薄层上冲，用过滤纸吸干。

4、脱色。用95%乙醇脱色，一般脱色时间大概为30 s。

5、观察。

干燥后，用油镜镜检观察，并做好记录。

原理：染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴大宏启定。

B. 单染色法的基本步骤有哪些有何注意事项

一、单染色法的基本步骤：

1．涂片取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作，分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

2．干燥于室温中自然干燥。

3．固定涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上败烂侍烤，否则细菌形态将毁坏。

4．染察吵色放标本于水平位置，滴加染色液于涂片历春薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。吕氏碱性美兰染色液约染2-3分钟，石炭酸复红染色液约染1-2分钟。

5．水洗染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。

6．镜检按实验程序进行显微镜观察。

二、注意事项：

(1)载玻片要清洁无油污，否则菌液不易涂开。涂片时取培养物宜少，培养物涂层宜薄，涂层过厚则不易观察细菌形态。

(2)干燥和固定时，玻片不能直接在离火焰很近的位置上烘烤，否则会破坏细菌形态并使之变形，影响观察结果。

(3)观察时如需用到油镜，油镜检查前玻片应完全干燥，观察后要将油镜用擦镜纸等彻底擦拭干净。

单染色法原理：

简单染色法即只用一种染料对涂片进行染色，该法简便易行，适用于菌体的一般形态观察。通常情况下由于细菌菌体多带负电荷，易和带正电荷的碱性染料结合而被染色，因此常用碱性染料进行简单染色，如美蓝、碱性复红、结晶紫、孔雀绿、番红等。

所有的苯胺染料，均可用来做简单染色法的染色剂。在进行染色之前的制片过程是影响染色结果好坏的关键性步骤。

C. 革兰染色法的步骤、结果及其临床意义分别是什么

一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染1分钟。3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，自来水核搏冲洗。干燥，镜检。x0dx0a 具体试验 流程x0dx0a 1、 取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、 涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、 晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶做盯紫液，染1min。 6、 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。 9、 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。x0dx0ax0dx0a结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。x0dx0ax0dx0a其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌 2.选择药物 3.与致病性有关：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素；而内毒素主要是指革兰氏阴性菌胞壁成分中的脂改胡祥多糖，两者的致病作用不同。

D. ABC法的介绍

ABC法是ABC免疫酶染色法的简称，又称卵白素-生物素-酶复合物染色法，是目前最敏感的免疫组织化学染色法之一。其基本原理是将盯埋镇特异凯粗性一抗与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素化二抗与一抗结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性液岩将生物素化辣根过氧化物酶链接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。

E. 什么是免疫组织化学以ABC为例介绍免疫组织化学染色的步骤及在染色过程中应该注意的问题

免疫组化就是通过免疫反应来验证组织中是否存在某个蛋白。A是待检测的蛋白，也就是抗原，B就是一抗，只会和A发生反应，C就是二抗，只会和B反应，C通常会携带某种标记，比如说荧光，用于检测。
结正尘果就是有A，B就能结合上，有AB，橘清和C就能结合上圆盯，通过检测C是否存在就可以知道A是否存在。

F. 给细菌染色的方法都有几种，怎么操作，都用复红染色

给细菌染色的方法都有几种，怎么操作，都用复红染色
简单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的一种方法.例如番红.
1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀,涂成极薄的菌膜.
2．干燥：可自然晾干,或将涂片置于火焰高处微热烘干,但不能直接在火焰上烘烤.
3．固定：手执玻片一端,有菌膜的一面朝上,通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面,以不烫手为宜）.
4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液),染l～2min.
5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止.
6．干燥
7．镜检
复染色：利用用两种以上染料对细菌进行染色.例如革兰氏染色法.
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,需要碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）.
碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）.媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘（iodine ）是常用的媒染剂.脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精（ethanol）.复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,而且将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液为番红.
1.载玻片固定.在无菌操作条件下,用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀,在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定.
2.草酸铵结晶紫染1分钟.
3.自来水冲洗,去掉浮色.
4.用碘-碘化钾溶液媒染1分钟,倾去多余溶液.
5.用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒,革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色,革兰氏阴性菌被褪色而呈无色.
6.用番红染液或者沙黄复染30秒,革兰氏阳性菌仍呈紫色,革兰氏阴性菌则呈现红色.

G. 革兰氏染色的关键步骤是什么

酒精脱色为整个流程最关键的一步。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

（1）载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

（2）草酸铵结晶紫染1分钟。

（3）自来水冲洗，去掉浮色。

（4) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

（5）用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。酒精脱色为整个流程最关键的一步。

（6）用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

(7)abc染色法的实验方法及步骤扩展阅读

染色原理：

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低。

故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。

H. 什么是革兰氏染色法染色过程应注意什么

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家汉斯·克里斯蒂安·约阿希姆·革兰氏（HansChristianJoachimGram，1853-1938）创立。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。

注意事项:

1.选用活跃生长期菌种染色,老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成贺雹假阴性。

2.涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。

3.脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够造芹拍答成假阳性,脱色过度造成假阴性。

方法原理：

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

酸性染料嫌慧的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

I. 免疫组化原理、流程及结果分析

免疫组化原理
免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。
免疫组化更多的意义在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western来实现。

免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位，组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。
通俗的讲，HE仅仅是看大体病理改变，比如组织坏死，比如炎性渗出。免疫组化，看你的目的蛋白的表达情况。

免疫组化和****HE****染色的对比
DAB和HE一样也是一种染色剂，HE染色相对简单，能分辨出细胞中的嗜酸嗜碱性物质；DAB染色全称应该叫做免疫组化DAB染色，经过一系列复杂的生化反应后，DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。

常用的免疫组化染色方法:
组化用HRP的话，信号不够强。通常用生物素标记HRP来增强信号。
1、 ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法）
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力特性，与生物素化二抗结合，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物，最后DAB显色。
复合物配制：先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物袭森素-过氧化物酶复合物。
2、 SP法（抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物）
本身没有连接生物素，但有两汪磨个生物素亲和力极高的结合位点，可以与二抗上的生物素结合，敏感性高，复合物不需要使用前混合，更为简便。
3、 PAP法
4、 直接法

样本制备

免疫组化结果分析
免疫组化结果的判断原则：
1 、必须设阳性对照和阴性对照。
2 、 抗原表达必须在特定部位。
3 、 阴性结果不能视为抗原不表达。

免疫组化染色实验组与对照组结果分析表

从表可以看出只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用Ab。

染色失败的几种情况及原因:
1、拍陵亩 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。
2、 所有切片均呈阳性反应。
3、 所有切片背景过深。
4、 阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

所有切片呈阳性反应，其原因:
1、 切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。
2、 缓冲液配置中未加氯化纳和PH值不准确， 洗涤不彻底。
3、 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反 应时间过长。
4、 抗体温育的时间过长。
5、 H ₂ O ₂ 浓度过高，呈色速度过快且粘附剂太厚。

所有切片背景过深，其原因:
1、 内源性过氧化酶没有完全阻断。
2、 切片或涂片过厚。
3、 漂洗不够。
4、 底物呈色反应过久。
5、 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
6 、使用全血清抗体稀释不够。

阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。
最常见的原因:标本固定和处理不当。

注意事项：
1、 苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。
2、 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。
3、 以下原因可能导致片子着色不均匀：
①脱蜡不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。
②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇。
③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂。④抗体孵育时，切片放倾斜。
⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。
⑥制片厚薄不均匀等问题。
⑦染片盒不平，切片倾斜。
4、 一抗的清洗:
1、单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
2、温柔冲洗，防止切片的脱落，推荐用浸洗方式。
3、冲洗的时间要足够，才能彻底洗去 结合的物质。
5、 PBS的PH和离子强度的使用：
1、建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。
2、中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利 于分解。
6、 拍照：
1、有条件的话应该立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。