鱼细胞培养方法步骤

1. 什么是sl培养基它的配方是什么

SL培养基（选择性培养基）：酪朊水解物(胰蛋白酶解酪蛋白闹尺洞)胰酶解酪胨10 g
酵母提取物 5g
葡萄糖 20g 柠檬困慧酸二铵 2 g
吐温80 1.0ml 3-水醋酸钠 25g
磷酸二氢钾 6g 7-水硫酸镁 0.58 g
7-水硫酸铁 0.03g 4-水硫酸锰 0.15g
琼脂 15 g 溶解在500ml水中 可以再加10ml/L的亚胺环液枯己酮能排除酵母菌的生长

2. 动物细胞传代培养的操作步骤

1.观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。
2.加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3.打开超净台(先开风机，后开照明)，用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。
4.取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5.取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6.用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7.打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8.将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。
9.取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆，但不漂起)，用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加埋辩入细胞，吹打，至所有细胞从培养键庆皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，稿液握versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10.吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11.细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12.擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。
13.吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。

3. 动物细胞培养的原理。

动物细胞培养原理是细胞增殖。动明庆宴物细胞培激银养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶），放在适宜的培差磨养基中，让这些细胞生长和增殖。细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。

4. 细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

一、细胞复苏

将冻消袭余存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。

加入10mlDMEM培养基清洗，弃上清液。加入10mlDMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1mlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。

加入10mlPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10mlPBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10mlPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

注意事项

（1）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：

①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有禅枣瓶盖旋松。

⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火拿滚焰上简单烧灼。

⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

（2）细胞污染的预防

①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。

②操作过程防止污染。

③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。

④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。

⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。

⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。

⑦实验操作时生物安全柜的隔板要尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽时绝对不能对着工作区，以免造成不必要的污染。

⑧瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。

⑨不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。

⑩实验操作时要注意及时更换巴斯德吸管、移液枪枪头和移液管，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了非洁净或者无法确定洁净的物品必须直接丢弃。实验完毕应及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

（3）防止细胞交叉污染

①在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。按顺序进行操作，一次只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生t昆乱。

②在进行换液或传代操作时，粘有细胞的移液枪头和移液管不要触及试剂瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。

③所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养。

(4)鱼细胞培养方法步骤扩展阅读：

细胞培养（cellculture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。

不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。

细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

5. 动物细胞培养的一般步骤是什么 动物细胞培养的步骤简介

1、复苏，把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装搭搭有10ml培养差瞎基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。3天换一次培养基。

2、传代，培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。把原有培养基吸掉。加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。根据细胞种类知庆拿把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

3、冻存，把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。冻存液的配制：70%的完全培养基 20??%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

6. 求助鱼的巨噬细胞分离培养

求助鱼的巨噬细胞分离培养
吞噬细胞功能检测的临床应用 试验原理是将人巨噬细胞与鸡红细胞(chicken red blood cell，CRBC) 混合后孵育，通过计算巨噬细噬 CRBC 百分率和吞噬指数判断人巨噬细胞的 吞噬功能。通过观察 CRBC 消化程度，反映巨噬的消化功能。 一、中性粒细胞功能检测的临床意义 趋化能力显着下降见于 Chediak-Higashi 综合征、Lasy 白细胞综合征、 慢性皮肤黏膜白色念珠感染、糖尿病、烧伤等。正常新生儿中性粒细胞趋 化能力亦明显低下。吞噬能力明显低下者见于补或抗体缺陷症时。酶代谢 能力显着降低见于慢性肉芽肿、6 磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)高度缺陷。 NBT 试验不仅是检测中性粒细胞的胞内杀菌能力的试验，还作为疾病的 鉴别指标。正常人外血中性粒细胞 NBT 阳性率约为 10％，全身性细菌性感 染在 NBT 试验阳性率明显增高；病毒性感或无感染的低热患者阳性率一般 在 10％以下。器官移植病人术后因细菌感染伴发热时，NBT 阳性升高；而 因排斥反应发热者，NBT 则正常。故发热患者在暂无条件查清病因或检测报 告较迟时，可用 NBT 试验对发热病因作过筛性鉴别。 二、巨噬细胞功能检测的临床意义 单核巨噬细胞系统具有直接吞噬和杀伤病原体和肿瘤细胞的功能，还 具有参与抗原加工、递呈免疫调节的重要作用，检测巨噬细胞吞噬功能对 于判断巨噬细胞的功能，了解机体的特异性和非特性免疫状态有重要作用。 巨噬细胞吞噬功能低下，主要见于原发和继发的吞噬细胞功能缺陷、 胃癌、肠癌等多种肿瘤病，肿瘤病灶中浸润的巨噬细胞与肿瘤的扩散与转 移呈负相关，检测这两个指标有助于判断机体抗肿的能力。

7. 鱼的肌细胞可以进行传代培养吗

一般不瞎袭用鱼的肌细胞进行传代培养，因为它皮族的分裂能力低。通常选择鱼类的胚胎组磨握兄织和幼鱼的各种组织作为培养材料。

8. 动物细胞贴壁培养的方法有哪些

动物细胞贴壁培养的方法有组织块培养法和消化培养法。

贴壁细胞培养方法操作步骤 ：

1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；

2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；

4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中；

5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻
片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。

实验要点及说明 ：

1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；
2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造，并经过铬酸洗液处理；

3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；

4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；

5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。

贴壁培养的优点：

• 容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。

• 容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。

• 当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。

• 同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。

• 适用于所有类型细胞。

  
  

贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比

• 扩大培养比较困难，投资大；

• 占地面积大；

• 不能有效监测细胞的生长；

9. 生物实验操作步骤

观悄脊察小鱼尾鳍内血液的流动
材料用具：
尾鳍色素少的活的小鱼，显微镜，培养皿，滴管，棉絮（纱布）。
方法步骤：
1、取尾鳍色素少的小活鱼，用浸湿的棉絮把小金鱼头部的鳃盖和躯干部包裹起来，露出口
和尾部。
注意：为了控制小金鱼的跳动，最好用浸湿的棉絮从小鱼头部的鳃盖、躯干部一直包裹到尾
鳍，只露出口和尾鳍。
2、把小金鱼放在培养皿中，使尾鳍平贴在培养皿上。
注意：小鱼在培养皿中会跳动，应等鱼安定后，将载玻片盖在尾鳍上。
3、将培养皿放在载物台上，用低倍显微镜观察尾鳍血管内血液的流动情况。
注意：观察时最好用低倍镜。因为用低倍镜观察时，虽然物像较小，但视野较亮。
4、找到管径最小的血管，注意观察血液在这种血管中的流动情况。
5、注意观察管径最小的血管是由什么血管分支而来的，它最终又汇入什么血管中。

注意：
（1）观察过程中，应常用滴管往棉絮上滴碰运逗水（滴水过多，影响观察），让笑卖鱼鳃始终保持湿润，
尽量使小鱼少受伤害。如果时间过长，可以把小鱼放回鱼缸，另取一条小鱼观察。实验后，
将小鱼放回鱼缸。
（2）在冬天用显微镜观察小鱼尾鳍内的血液流动情况时，应在实验前将小金鱼放在30℃左
右的温水中浸浴2～3分钟，以加速它的新陈代谢，使血流明显。

10. 动物细胞培养的基本过程

一、准备工作

准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

二、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

三、培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态棚拍。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。

细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

四、冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚橘和罩砜或甘油）的培养基，圆闹以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。

在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

(10)鱼细胞培养方法步骤扩展阅读：

进入细胞间开始细胞培养时，注意事项：

①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。

⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。

⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。