流式细胞检测b细胞亚群方法步骤

1. 流式细胞鉴定有哪些步骤

最基本的步骤：
1、制备样品的单细胞悬液；
2、标记流式抗体；
3、流式上机检测。

2. 流式细胞术的步骤

流式细胞仪的操作和使用①打开电源，对系统进行预热； ②打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统； ③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统； ④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小； ⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程； ⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统； ⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理； ⑧将所需结果打印出来。 细胞凋亡研究：细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。

细胞分选：流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度＞95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记。 细胞因子的检测：随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。本文主要对胞内细胞因子流式细胞技术作介绍。 血液学应用：文向您介绍流式细胞仪在血液研究领域的应用，包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等

3. 流式细胞术的步骤

1，制备细胞悬液，计数
2，分装，按照每个EP（1.5ml）管1-2*10 6个细胞分装（要设空白对照，单标和isotype control），3500rpm，4度，离心。
3，用100ulPBS重悬，加入10ul大鼠血清封闭（或者其他封闭剂），4度，避光，30min。
4，加入相应的荧光标记的抗体，混匀，避光，4度孵育30min。
5，加入1mlPBS洗两遍（3500rpm，4度，离心）。
6，用200ul PBS重悬，经纱布过滤转至流式管，上级检测。

这个是正对细胞表面分子，如果检测细胞内分子，需要在加封闭剂之前加入穿膜液。如果细胞内的分子表达量很少，需要加刺激剂。

4. 请教流式细胞的具体实验步骤是怎样的

一 、细胞表面标记的检测
1.试剂平衡至室温。准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。
2.写编号纸并编号。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD33----CD14/CD454----
3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血，震荡，室温避光20分钟。加血前摇匀血样。
4.加入溶血素1ml，震荡后室温避光10分钟。
5.离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。
6.加入PBS洗液2ml，震荡，离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。
7.加入PBS 900l。上机前4度保存。
8.上机。
二 、细胞内细胞因子的检测
1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。
2.写编号纸并编号。IgG1/ CD8/CD3IFN-gamma; /CD8/CD3
3.（3－5在超净台操作）取出PMA（1∶100），BFA（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠PBS稀释储存液。
4.刺激：取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1 106 ）50l/管，再加入50l RPMI1640进行稀释一倍，加入刺激剂PMA，离子霉素和BFA，混匀。最后在全血中的终浓度：PMA:50ng/ml离子霉素：1g/mlBFA：10g/ml。
5.37℃，5% CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖) 。
6.胞外染色：各管中加入相应的表面抗体20l和激活的全血100l混匀，室温避光20分钟。
7.溶血：每管加入溶血素2ml，室温避光10分钟。离心，1200转， 5分钟。弃上清。
8.破膜通透：每管加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟。加入2mlPBS，1000转，离心5分钟。弃上清。
9.胞内染色：加入IFN-gamma;或IgG1的抗体20l，混匀，室温避光30分钟。加入2ml PBS，1000转，离心5分钟，弃上清。
10.加入PBS 500l。上机前4度保存。
11.上机检测。
注意：本实验室可提供流式细胞检测服务或流式细胞仪,不会的新手可以自行上门观察.本实验室为正规三甲医院科研共享平台,所有开放的实验均为本实验最常规的技术服务,暂时开放的除了流式细胞术外还有荧光定量pcr,ChIP免疫沉淀,wester blot,细胞培养,细胞株.

5. 流式细胞仪的原理和操作过程

原理：
流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。
在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。
荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

操作过程：
①打开电源，对系统进行预热；
②打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；
③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；
④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的 基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；
⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选 择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；
⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；
⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭 气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；
⑧将所需结果打印出来。

6. 流式细胞术检测细胞表面抗原的步骤

1. 定量细胞浓度
2. 分为2组，一组为实验组，另一组为抗体对照组
3. 两组都先加入非特异性的IgG，封闭可能的Fc受体
4. 按照抗体生产厂家的推荐浓度加入抗体，对照组加入同样荧光标记的非特异性同型抗体。
5. 4°孵育半小时
6. 用含0.5% BSA的PBS洗2遍
7. 上机后先用抗体对照组设置阴性Gate。
8. 检测样本。

7. 流式细胞术实验步骤是什么

流式细胞术实验：

1、制备细胞悬液，计数

2、分装，按照每个EP（1.5ml）管1-2*10 6个细胞分装，3500rpm，4度离心。

3、用100ulPBS重悬，加入10ul大鼠血清封闭，4度避光30min。

4、加入相应的荧光标记的抗体，混匀，避光，4度孵育30min。

5、加入1mlPBS洗两遍。

6、用200ul PBS重悬，经纱布过滤转至流式管，上级检测。

细胞或者大小接近的颗粒物质都可以检测。

样本通过鞘液的输送，成单个队列依次通过激光束。样本事先可以根据检测需要被荧光标记，通过激光束的时候就会得到荧光信号，被记录下来。可以同时标记不同的荧光标记做不同的检查。优点就是可以在短时间内检测大量的样本（每秒几千个到几万个细胞）。

主要应用于各种生物医学研究和临床诊断。国际上通用的白细胞和淋巴瘤的诊断标准就是靠流式细胞仪的分型来确定的。

以上内容参考：网络-流式细胞术

8. 如何运用流式细胞仪进行T淋巴细胞亚群分析

简单的概括：

1、先在FSC/SSC散点图gate出淋巴细胞；
2、然后把淋巴细胞显示到柱状图，gate出CD3阳性的（T细胞）；
3、再把T细胞显示到散点图，横坐标，纵坐标分别为CD4和CD8。