异位表达FXN蛋白的方法步骤

㈠ 角蛋白19片段偏高结果是5.59而正常值是3.35而NSE结果正常，CEA结果正常，TSGF正常。

肿瘤标志物可追溯至1848年，本周（本斯 - 琼斯）的蛋白质，实验室多发性骨髓瘤诊断的基础上，。 1964年至1965发现甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），肿瘤标志物在临床的应用范围广泛。细胞杂交，成立于1975年，制备的单克隆抗体，建立了一系列的特异性肿瘤标志物。在1976年，原癌基因的发现，肿瘤标志物，从分子水平上升到基因水平。但事实并非如此，直到1978年，正式提出概念的肿瘤标志物（肿瘤标志物），在1979年被世界公认的Herberman。肿瘤标志物和肿瘤的诊断，判断肿瘤预后和治疗效果，以及检测肿瘤的复发和转移，具有重要的临床价值。根据其来源和分布，通常分为5组：①原位肿瘤标志物;②异位肿瘤标志物;③胎盘和胎儿的肿瘤标志物;④病毒的肿瘤标志物;⑤基因抗癌基因及其产物的。其中第①至④组的肿瘤基因表型标记，部分⑤组的肿瘤基因标记。当细胞癌变，临床肿瘤进展和演变，肿瘤标记可以用作一个临床诊断和鉴别诊断的指标来判断复发的疗效和检测。这些标记有助于早期诊断，基因突变和表达异常的肿瘤标志物反映了细胞在癌前病变的启动阶段，并有助于早期诊断的临床监测。现代肿瘤标志物对肺癌，缺乏特异性，但结合临床诊断为肺癌，预后，治疗效果，后续的测试仍然是一个很大的作用。

癌胚抗原

癌胚抗原（CEA）于1965年由加拿大医生真金镶首次发现，随后不断纯化，是目前临床应用广泛，可使用所有的生产和分泌的CEA和输入部分的身体的流体和在各种肿瘤，如结肠，直肠癌，肺癌，胰腺癌，在病人的血清，血浆，和在各种体液中的血液循环，可以是检测CEA升高。 CEA确定，帮助辅助诊断，预后和疗效的测试，但有一个较高的假阳性和假阴性。

CEA是一种糖蛋白复合物，结构，分子量为20×104，在除了含有癌抗原特定行列式，也有各种各样的非特异性抗原的健康人体一致共同的抗原表位。因此，临床CEA多克隆抗体（多抗）和CEA的单克隆抗体（mAb），而后者则是更具体的。

法测定多抗肺癌患者SCEA阳性率之间的不同病理类型，其次是小细胞癌，鳞状细胞癌腺癌更高。这种差异可能是有关的肺癌细胞的分化程度，并且也可能与使用的抗体的特异性。

不同的CEA抗原表位，CEA试剂盒由不同厂家，不同肿瘤和不同类型的肺癌阳性率也有较大的差异。如果它们可以识别不同的CEA抗原表位，该制剂不为更高的特异性不同的肿瘤，或不同类型的，肺癌CEA试剂盒可以进一步提高检测的阳性率和特异性。

SCEA检测阳性率与病期肺癌患者有密切的关系，有显着的差异，科检测病情变化，3倍以上，比正常的时候发现，将预示着可能全身性转移。在肺癌手术的患者术后可升高短期SCEA普遍下降约两个月恢复，如长期下降或继续上升，应考虑转移可能。

CEA放射免疫分析法和酶联免疫吸附试验检测方法。

β2微球蛋白

升高β2微球蛋白在各种全身性疾病的血液和固体恶性肿瘤，和为负与CEA有关。 18％至21％的肺癌患者中的阳性率与血清β2-微球蛋白，欧洲，日本53.5％至90％。

同时检测与CEA，两者是相辅相成的，更多的患者能够积极的迹象，而且更有利于预后。肺癌初诊或复发的患者SCEA腺癌的阳性率最高，其次是鳞状细胞癌，小细胞肺癌，腺鳞状细胞癌，鳞状细胞癌，腺癌，小细胞肺癌，其次β2-微球蛋白阳性率。 SCEA的测量值？并随着疾病的进展，与控制的疾病，可以降低或正常β2微球蛋白相反的结果。

的SCEA浓度和肺癌患者的预后密切相关的特异性较高，但阳性率较低，特别是在早期阶段的肺癌，尤其是β2微球蛋白阳性率是较高的，但也比较高的假阳性。两者的结合可以相得益彰，很容易找到更多的肿瘤标志物阳性患者，这将有助于发现病情变化，并确定合理的化疗间歇期更有利于早期发现肿瘤的复发，并容易抓住的机会检查和治疗。

铁

铁（铁）是流行在人体内的铁储备铁的储存和代谢的蛋白质发挥了重要作用。今年以来，随着肺癌肿瘤标记物科的诊断和预后检测。然血清铁蛋白是不特定的肿瘤标志物，在肺部疾病的鉴别诊断意义并不大，但它不会有助于肺癌的早期诊断，但发展到检测肺部疾病，肿瘤的复发和转移的潮起潮落仍然有一定的临床价值。

在肺癌患者，约1/3的患者增加铁蛋白，仍然未知的原因，一般认为，合成和分泌铁蛋白的异常的肿瘤细胞的能力也可伴有与肿瘤细胞本身坏死，与化疗或放疗导致的组织损伤和细胞的破坏，从而在铁蛋白的释放增加胞浆内，和肝功能降低间隙有关的损伤铁蛋白。

铁蛋白还可以作为胸水和良性或恶性的鉴别诊断的一个很好的指标，胸腔积液及血清铁蛋白浓度> 500ng/ml，应怀疑有恶变;> 1000ng/ml，帮助恶性确立诊断，其敏感性为76％，特异性94％，阳性诊断准确率91％，阴性诊断准确率为83％。

铁决心积液，没有同时测定血清铁蛋白或胸腔积液，血清铁蛋白的比例。

四，神经元特异性烯醇化酶

神经元特异性烯醇化酶（NSE），神经元特异性烯醇化酶，神经母细胞瘤的肿瘤标志物，小细胞肺癌是最常见的表现神经内分泌肿瘤的性质，NSE也是使SCLC最敏感和最具体的肿瘤标志物。近年来，NSE作为神经元损伤的敏感性和特异性标志物的中枢神经系统疾病的关系已引起了国内外学者的极大关注。

1，

的NSE生化性质甘油的最终分解酶的催化糖酵解途径。三个独立的基因片段编码不同的亚基，α，β，和γ的免疫学性质的由3种，组合物中的五种形式的同工酶αα，ββ，γγ和αγ，βγ。二聚体是酶分子的活性形式，γ亚基同工酶存在于神经元和神经内分泌细胞的细胞质中，称为NSE。位于在神经胶质细胞中的α亚基同工酶，相同的结构和免疫学特性的肝烯醇化酶，称为神经元特异性烯醇化酶（NNE）; NSE和NNE分子量为78kD和87kD。

2，正常价值的确定方法

烯醇化酶两类，一类酶酶活性测定，含量测定方法。活动的直接分光光度法酶偶联速率法，生物发光和琼脂糖凝胶电泳法，测定酶免疫组织化学方法检测。

NSE的最常用的方法RIA和ELISA，RIA放射性污染，ELISA RIA缺乏和高灵敏度的测定。国内不受限制的ABC-ELISA灵敏度2ng/ml;科学院，军事医学科学院，建立了ELISA检测试剂盒，灵敏度为1ng/ml，操作方便，重复性好。国外学者报道，近日通过时间分辨荧光免疫分析血清NSE，其重现性好，灵敏度，特异性和RIA方法是一致的，相关系数为0.99，女性的正常参考值范围为2.9?9.6μg/ L，男性和3.4?11.7μg/ L，显着的性别差异（P <0.001）。 NSE测定值不同的方法有一定差异，在一般情况下，以下10ng/ml的健康成人血清NSE水平是正常的。

3，临床意义

神经母细胞瘤和小细胞肺癌的NSE标记。神经母细胞瘤是一种常见的儿童癌症，占1至14岁儿童肿瘤的8％至10％。 NSE作为神经母细胞瘤的标志物，在疾病的早期诊断具有较高的临床应用价值。神经母细胞瘤患者尿中NSE一定的升高血清NSE水平正常，治疗后。测定血清NSE水平监测疗效和复发，更有意义的比测定尿中儿茶酚胺代谢产物的预测是一个重要的参考价值。小细胞肺癌（SCLC）是一种高度恶性的神经内分泌肿瘤，肺癌占约25％至30％。它可能会显示神经内分泌细胞，过度表达的NSE，超过5至10倍，高于其他肺癌和正常对照组的特性。小细胞肺癌患者血清NSE阳性检出率可高达65％至100％，并已被确认为SCLC高特异性的NSE，肿瘤标志物的敏感性据报道，NSE水平与SCLC转移;独立转移的部位，也具有良好的相关性之间的NSE水平及对治疗的反应。

五，细胞角蛋白

细胞角蛋白的细胞体的中间丝，可根据其分子量和双向二维电泳分等电点，在正常细胞中，肿瘤细胞，在细胞培养中的20种不同的类型，不同的上皮细胞的分化。细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1），组织多肽抗原（TPA），组织多肽特异性抗原（TPS）是细胞角蛋白的标记。

1，CYFRA21-1

尤其是丰富的内容，特别是在肺CYFRA21-1浓度在非小细胞肺癌患者的血清和胸腔积液的敏感性随病情进展而越高肺癌分期呈正相关，灵敏度也较高，灵敏??度为50％至70％的鳞状细胞癌，腺癌30％至50％，从20％到50％的小细胞肺癌。 CYFRA21-1与放疗，化疗和临床反应良好的相关性之间的有效化疗的患者中，血清CYFRA21-1水平将显着减少，血药浓度在肺手术后也减少了，而且是密切相关的生存的肺癌患者血清CYFRA21-1水平较高，预后较差，尤其是，可以用于肺鳞癌细胞的生存和复发的独立预后因素。的CYFRA21-1，支气管肺泡灌洗液中水平，不能被用来识别恶性肺部疾病的量的。

2，TPA

角蛋白8,18,19片段的一部分，它的表达反映了细胞的增生。 TPA是一个肿瘤细胞的增殖可以识别特定的版本的TPA M3抗原单克隆抗体确定的决定巢。该TPA与肺癌的灵敏度为30％至60％，特异性为65％至90％的患者的血清中检测到。 TPA的临床疗效和临床分期密切相关的进展与TNM分期，TPA水平指示的肿瘤无复发，但做的组织类型无关，是不敏感的SCLC。

3在非小细胞肺癌患者血清TPS

TPS检测的敏感性36％，特异性为90％。 TPS非小细胞肺癌患者的淋巴结转移和疾病的不断进步化疗的患者，血清中显着较高。 TPS是预后的重要因素之一，高水平的那些寿命短租者置其屋计划的患者在治疗前，可能表明不敏感的化疗和预后不良。

六，鳞状细胞癌的细胞抗原

鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）的，从子宫组织中提取的一种糖蛋白，由江东区1977年各种鳞状细胞癌具有不同的特异性和灵敏度。

肺鳞状细胞癌，鳞状细胞癌抗原敏感度为33％至78％，特异性为89％?100％，但其他类型的肺癌的临床意义。最初的鳞状细胞癌抗原水平肺鳞状细胞癌血清SCC-Ag和肺部疾病期间呈正相关，与肿瘤的扩散和转移，提高III-B，IV肺鳞状细胞癌患者显着高于Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ一个患者，患者的生存期密切相关，可作为指标来确定的肺鳞状细胞癌的预后和疾病进展的检测。

7

糖类抗原碳水化合物抗原（CA）是一个系列的肿瘤相关抗原，大分子细胞膜上的糖蛋白，主要CA19.9，CA50， CA125。

CA19.9，CA50检测肺癌的敏感性为44％，51％，67％，特异性为69％。治疗前CA19.9和疾病分期呈正相关，但与预后无关，约1/5的患者在治疗后CA19.9下降。远处转移的肺癌患者中，血清CA50高于无转移者。

CA125是最重要的卵巢癌胚抗原，CA125水平与TNM分期呈正相关，肺癌患者中，血清CA125高于中晚期患者，其生存期短于正常的可能性增加复发，独自一人非小细胞肺癌的预后提示。

8个基因诊断肺癌

20世纪的发展，生物医学的深入了解生命现象的重要特征之一，逐渐向微观分子水平上。在21世纪，基因和基因诊断已不再是“神秘的”东西。

1，基因诊断

利用现代分子生物学和分子遗传学在基因水平上，直接的生活问题和缺陷，存在的基因检测遗传结构的表达功能是否异常，这使诊断的疾病（癌症）或人类状态。

基因诊断的实验技术和检测方法：通过免疫组化的蛋白水平，免疫印迹凝胶电泳，PCR，PCR-SSCP，在DNA水平上的序列分析，原位杂交，南现代杂交凝胶电泳，RT-PCR，原位杂交，Northern杂交，在RNA水平等。

分子生物学，基因诊断肺癌肺癌的发生和发展是一个遗传易感因素占重要地位，涉及一系列基因（癌基因异常变化的复杂的过程和/或肿瘤抑制基因）。在正常细胞对肿瘤细胞的恶性转化过程的启动阶段，促进阶段进度的演变阶段，都涉及到激活的癌基因突变，扩增和过度表达;失活的肿瘤抑制基因的功能障碍（主要是损失住方式的缺失，点突变和甲基化），有些茫然的染色体片段，导致细胞动力学的正常发展周期紊乱，细胞增殖失控无限增长的癌症的形成和恶性转化。分子事件的发展，肺癌的基因进行检测和分析，特别是对抑癌基因p16，Rb的研究可以建立一个理想的早期诊断肺癌的分子生物学检测指标。

①癌基因

与肺癌基因myc基因家族（C-myc和N-??myc和L-myc基因），ras基因家族（K-ras基因，H- ras基因，N-ras基因）和Her-2/neu的基因，简单的突变基因在肿瘤的形成过程中的模板是占主导地位的癌基因，突变蛋白可以启动细胞增殖信号，引起细胞无限繁殖。

Myc家族几乎所有的小细胞肺癌和非小细胞肺癌的发生; ras基因家族基因突变与预后不良相关，密码子的突变在特定部位的活动。产品p21和细胞生长的G蛋白通过不断的有丝分裂信号，导致细胞增殖不断ras基因突变的肺癌患者高于无变异生存期缩短;特异性HER-2/neu基因编码的酪氨酸激酶跨膜电位P185中p185蛋白表达在非小细胞肺癌，启动细胞的生长和分化更糟糕的信号，细胞分化，阳性率较高的中p185高表达的基因的侵袭和转移的肺癌和多重耐药性的基因（特别是肺腺癌）。

肺癌的癌基因：C-MYB，C-fos基因和bcl-2，C-erbB2的。

②肿瘤抑制基因

与肺癌肿瘤抑制基因p16和Rb，p53基因突变两个模板，肿瘤会发生。

研究发现，p53基因缺失或点突变的p16基因在人类肿瘤的发生发展，可作为早期火灾事件，提供了理论依据肺癌的早期诊断。 RB是首次分离出肿瘤抑制基因，其编码产物在细胞周期调控中发挥了重要的作用。 P16在大多数肿瘤抑癌基因失活的最新发现和克隆的存在。

分子病理学的角度来看，肺癌的发生发展过程中的第一3P等位基因丢失，那么9P区基因突变（p16基因在染色体9p21区域明确），最后的p53基因ras基因改变。

非小细胞肺癌，缺失p16，Rb基因缺失的70％?80％的只有22％;小细胞肺癌的Rb缺失突变在95％以上，表明p16基因起着极其重要的发展肺癌的作用，P16，Rb基因不仅可以被用于肺癌的早期诊断检测指标，也可以作为小细胞肺癌和非小细胞肺癌的分型早期诊断的重要依据。

我们都知道，任何肿瘤的早期诊断不能完全依赖单一的，各种诊断方法必须相辅相成。这两种肿瘤标志物与肺癌的基因，不能是一个单一的完全证实了肿瘤，必须紧密结合临床，以作出早期诊断，分型，分级，分期，采取合理适当的治疗方法，治疗效果，预后，转移潜在的预测。

㈡ 关于植物双受精过程的概述

        这次介绍的是整个双受精过程的简介，是最最原始的初稿，文字啰嗦，图不对文，我在我读研的这几年内想把整个受精过程参与的因子都尽可能完善，欢迎各位读者及时补充交流。

        双受精主要是被子植物（当然裸子植物麻黄属和买麻藤属也存在）特有的生殖方式，其过程主要是成熟的花粉粒落在柱头上水合萌发形成花粉管，花粉管穿过引导组织，穿过隔膜，进入胚珠后花粉管爆炸释放出两个精细胞，其中一个精细胞与卵细胞结合，最后发育成胚（2n），另外一个与中央细胞融合发育形成胚乳（3n）。

       植物生殖过程中演化出了许多独特的生理机制，例如花粉管的顶端生长（tip growth），在植物生长发育和环境中过程中，有很多种顶端生长的例子，如真菌的菌丝，植物的根毛以及毛状体，目前花粉管的顶端生长是顶端生长生长最快的一种形式之一，所以以花粉管为模型研究顶端生长是一个很好的方式。目前花粉管生长区别于其他细胞生长有两个最重要的特点，一是花粉管于顶部向顶端生长，二是通过果胶甲基酯酶（PME，如VANGUARD1）对果胶的去酯化作用会使得顶端新形成的细胞壁沉积物之间产生空间上距离。这种去酯化作用产生的羧基使果胶与其他聚合物形成Ca2 +-盐桥，从而形成果胶凝胶，有助于使壁硬化。在顶端PME会与PMEI（PME的抑制物）相互作用形成复合物来抑制PME的酶活，随着顶端不断向前生长，复合物逐渐解散，使得细胞壁硬化。此外花粉管细胞壁还具备许多多糖以及不同的修饰形式，如乙酰化，硼酸二酯交联，岩藻糖基化木葡聚糖的分泌以及纤维素和胼胝质的局部合成。

        其中分泌蛋白 LRXs（leucine-rich repeat extensins）可能参与了花粉管细胞壁和膜结构的修饰， LRX8, 9, 10, 11这四个蛋白mRNA在花粉中的表达量极其高。 lrx  突变体显示花粉管处存在纤维素和胼胝质的不正常积累，且四突雄配子体的传递率下降了六倍。如果在 lrx  突变体中添加Ca+能部分抑制突变体的表型，暗示着LRX可能通过Ca信号才调控下游过程。此外LRX8以及其他三个LRX可以和小肽RALF4/19（rapid alkalinization factor 4/19)相互作用来调控ANXUR1 (ANX1) 和ANX2使得花粉管的爆炸。其中有一个有趣的问题是，花粉细胞分泌多种水解酶，其可能降解花粉管或周围雌蕊细胞的细胞壁并产生DAMP(damage-associated molecular patterns)，那么植物是如何区别这两者从而保护正常的生殖过程的呢？

       此外， ROPs（Rho GTPases from plants）以及其下游的效应因子作为主要调控者调控了细胞极性生长，同样参与花粉管顶端生长极性的建立。ROPs家族共有11个成员,其中ROP1主要调控了花粉管的的顶端生长，当ROPs结合GTP时，会变成激活构像，当GTP水解成为GDP时，会变成非激活的构像。GDP到GTP的转化是被GEF(guanine nucleotide exchange factor）催化。激活状态下的ROP–GTP能够与一系列的效应因子相互作用，但是仅仅只有一小部分被鉴定出来，因为ROP固有的GTP酶活性会将GTP转化成GDP，所以与ROP–GTP相互作用的效应因子是非常瞬时的，因此非常难以鉴定。其中ROP–GTP的激活构像持续时间会被GAPs(GTPase-accelerating proteins)缩短从而增加GTP的水解速率，同时ROP-GDP也会与GDIs(GDP-dissociation inhibitors)相互作用，从而使得GDP不会被GEFs催化形成新的GTP。GAPs, GEFs 和 GDIs其活性均可被磷酸化和去磷酸化调节，主要是受 CPKs(Ca2+-dependent protein kinases), MAPKs( mitogen-activated protein kinases)和 RLKs调控。在顶端生长的过程当中RIC4（ROP-interactive CRIB motif–containing protein 4）和RIC起到非常重要的作用，RIC4能够促进F-肌动蛋白的组装，而RIC3会刺激Ca2 +浓度瞬变，从而使得F-肌动蛋白的分解。但是目前还不清楚RIC3是否是直接与Ca+通道蛋白相互作用还是与激活了一条新的信号途径来调控Ca2+。此外，位于ROP-ATP下游的NOX（NADPH oxidase）也起到非常重要的作用，NOX可以产生ROS来调控细胞壁的修饰并且激活新的信号通路，目前认为ROS可以激活一条尚未鉴定出的Ca2+通道，有趣的是NOX还可以被Ca2+ 和 CPKs直接激活，这就可能推测这里存在一条正反馈的机制：ROS诱导的钙信号反过来调控新的ROS通路，或者可能是以ROS 到 Ca2+ 调控 ROS 再到 Ca2+引发的钙振荡来调控下游过程。在顶端汇集的细胞质钙震荡到底是标志着生长周期的开始还是结束呢？这是目前生殖领域比较关心的科学问题之一。但是目前研究发现这种钙振荡可能需要多个过程协调激活，例如通过离子通道蛋白的Ca2+离子内流或离子泵和离子交换蛋白引起的Ca2+外流，可是在模式植物拟南芥的花粉中至少有潜在的39个基因可以编码Ca2+通道蛋白，包括 CNGCs(cyclic nucleotide gated channels),GLRs(glutamate-like receptors), MSLs(mechanosensitive-like channels), OSCAs(reced hyperosmolality-inced[Ca2+]i increase channels), 一个Piezo离子通道和膜联蛋白。目前关于 CNGC18 和 GLRs 的突变体的研究发现这些通道的缺失并不能使得顶端钙振荡消失，除了Ga2+本身运输可能会影响顶端Ca2+的聚集之外，还与细胞骨架动态变化相关。此外在拟南芥中至少存在230个花粉特异表达的基因可以与Ca2+结合或者是参与Ca2+的信号通路，例如CBLs(calmolins or calcineurin B–like proteins ),CPKs和CBL-interacting protein kinases，因为CPKs可以磷酸化下游数百个蛋白，所以要理解Ca2+是如何影响顶端生长还是个复杂的问题。在先前的研究中，认为Ca2+的每一次震荡都对一次生长周期至关重要，但是钙成像实验显示，在一次钙振荡过程中，生长周期已经完成多轮，所以这些观察结果表明，Ca2+振荡不是生长周期所必需的，Ca2 +振荡可能作为开关间歇地起作用，以重新同步或重启细胞过程。

第一阶段：花粉落在柱头上，标志着雌雄配子双方密切的信号交流开始

        当花粉落在柱头上开始，复杂的信号交流便开始了，首先雌方需要确定花粉是不是合适的（杂种不育或是自交不亲和），如果合适才会经过粘附、水合、萌发的步骤形成花粉管。花粉在柱头上水合的过程是收雌雄双方的调控的，水合过程中会引起花粉粒内Ca2+的内流，随后还会引起花粉粒内细胞质的重塑和ROS的累积。目前对于各向同性的花粉粒产生极性生长的花粉管的机制还不是很清楚，可能是细胞质内钙离子浓度的梯度分布或是RIP1(ROP–interactive partner 1)的定位又或是Exocyst复合体中的SEC3A亚基作用于在花粉管出现的地方。此外，快速水合过程中水进入引起渗透压的改变为什么没有使得花粉粒裂解也是一个重要的问题，例如大肠杆菌能够通过使用机械敏感性通道释放渗透物来防止细胞裂解。花粉特异表达的MSL8（mechanosensitive-like channel 8）可能具有相似的功能，水通道蛋白的调控以及鞘脂也在其中发挥作用。

       在干燥的柱头，花粉萌发的速度很快，30min即可，但是在体外却要大于3.5h，这其中花粉上的脂质对于萌发过程至关重要，从柱头释放出来来的十氢喹啉衍生物以及油菜素甾醇可以刺激花粉的萌发和花粉管的生长。在对烟草的研究中发现，自噬对于烟草花粉的正常萌发非常重要。在百合中存在chemocyanin碱性小蛋白，可以在花粉萌发后，指导花粉管导向性生长。除此之外，花粉管的出现还需要突破物理上的阻碍，这就需要有关水解酶的分泌和活跃的信号传导，其中AtOFT1(OFUCOSYLTRANSFERASE 1)和tod1(turgor regulation defect 1,神经酰胺酶)的突变体显示穿过柱头和花柱隔层的能力变弱。

第二阶段:花粉管在花柱，引导组织，隔膜的导向性生长

      引导组织具有特化的细胞外基质，是多糖，糖蛋白和糖脂的复杂混合物，被认为可以用来支持花粉管的生长。在有些植物当中花柱，引导组织，隔膜会作为自交不亲和发生的地点，但是在拟南芥中主要是为了让花粉管正常导向完成双受精。

      目前对于花粉管快速生长依据的原料还不清楚，在烟草中的TTS(TRANSMITTING TRACT–SPECIFIC)蛋白TTS1和TTS2可以在体外刺激花粉管生长，但是TTS在拟南芥的同源物是否能刺激花粉管的生长还未知。GABA 和GABA和d-serine两个氨基酸分子能够促进花粉管的生长。外源的GABA能在体外影响花粉管生长，在较低浓度下刺激花粉管生长，在较高浓度下抑制花粉管伸长，柱头产生的d-serine可能作为花粉管顶端GLRs的激动剂调控Ca2+来促进花粉管在花柱，引导组织和胚珠的生长。花粉管表达的GLR的功能取决于亚细胞定位，而亚细胞定位又由CNIH（CORNICHON HOMOLOG）分子伴侣调节。 但是，d-serine触发的Ca2+信号传导的特定功能仍有待确定。据目前的实验观察，花粉管粘附在引导组织上对于花粉管的正常生长至关重要，使用体外粘附生物测定法鉴定了百合花粉管粘附所必需的两个分子。两者中较大的是果胶而较小的分子是脂质转移蛋白SCA(stigma/stylar cysteine-rich adhesin)，两个分子都非常重要，单独之一并不能重复粘附过程。此外有意思的，如果花粉在体外萌发，最后找到珠孔的能力很弱，但是穿过花柱和引导组织后，找到珠孔的能力大大增加，并且转录组数据显示，穿过花柱和引导组织会使得原先数千个不表达的基因表达。在蓝猪耳中，一个胚珠起源的蛋白AMOR(ovular methyl-glucuronosyl arabinogalactan)，能够使得花粉管穿过体外切割过得花柱来响应胚珠产生的信号。AMOR被鉴定为阿拉伯半乳糖多糖，其末端的4-O-甲基-葡萄糖醛酸残基是主要的功能部位。

第三部分 珠孔导向

       珠孔导向一般被认为是一个非常理想的模型来理解胞外的信号分子是如何引起胞内的信号转导途径。在先前的研究中发现助细胞对于珠孔导向非常重要，进一步深入研究发现位于助细胞上的丝状器上分泌的小肽信号参与了这个过程。第一个被鉴定出来参与珠孔导向过程的是玉米中的ZmEA1，利用RNAi的技术发现沉默掉ZmEA1后，花粉管不能找到珠孔，并且导致严重的育性下降。随后在蓝猪耳里鉴定到一组小肽LUREs能够吸引花粉管。随后在拟南芥中也找到了物种特异性的小肽AtLURE1也能参与花粉管的吸引（AtLURE1与LURE1在序列上无相似性，只是功能类似），AtLURE1是一组富含半胱氨酸的防御素样的小肽，在对AtLURE1.1–1.5的研究过程中，发现这组小肽特异性的定位在助细胞，蛋白从丝状器上分泌出来到珠柄。但是五突并没有产生败育的表型，随后通过建树又找到了两个与AtLURE1相关的基因并且展现出可以吸引花粉管的功能，并命名为AtLURE1.7，AtLURE1.8。有趣的是七突也没有明显的育性下降，暗示着AtLURE1介导的信号通路可能并不是对于植物生殖所必须的。那么他们的功能又是什么样的呢？通过将拟南芥的花粉与另一种与拟南芥亲缘关系很近的物种琴叶拟南芥的花粉一起共同授于拟南芥的柱头上，发现在AtLURE1信号正常的植物中，拟南芥的花粉管被优先吸引，竞争性明显；而在缺失了AtLURE1信号的 atlure1 突变体植株中，拟南芥的花粉管被优先吸引的能力就显着降低，这表明AtLURE1的生物学功能主要是促进近缘物种的生殖隔离，为达尔文提出的同种花粉优先的理论提供了分子水平的证明。此外，还有4个在 myb98 突变体中表达下调且无物种特异性的小肽XIUQIUs，在 AtLURE1s 七突的背景下敲除，发现存在20%的育性下降，并且XIUQIUs不仅可以吸引拟南芥的花粉管，还可以吸引其他近缘种如琴叶拟南芥和哈勒氏拟南芥的花粉管。

        在整个珠孔导向的过程中，RLK也发挥着非常重要的功能。 prk6 （pollen receptor kinase 6）突变体在半体外的环境下不能响应AtLURE1.2的信号，PRK共有8个成员，其在番茄中的直系同源的基因已经知道可以通过自分泌和雌性表达的配体来调控花粉管的延伸。 prk6prk3 双突珠孔附近花粉管生长异常， prk6prk3prk1 花粉管穿过柱头异常缓慢。此外，还有其他组发现了MDIS1–MIK组成的受体复合物，MDIS1, MIK1和MIK2的胞外域可以与AtLURE1.2互作，但是 MDS1 MIK1 MIK2 的突变体表现出细微的花粉管引导缺陷，但没有像在prk突变管中观察到的花粉管延伸的缺陷。那到底谁才是AtLURE1s的受体的呢？接着有报道通过生化和结构的方法，验证了AtLURE1s与PRK6的互作，但是了重复不出AtLURE1s与MDIS1–MIK的互作，因此很有可能AtLURE1s-PRK6小肽受体复合物介导了拟南芥进缘物种的生殖隔离。还有两个RLCK LIP1(LOST IN POLLEN TUBE GUIDANCE)和LIP2也被报道能够响应AtLURE1的信号。但是目前XIUQIUs的受体还没有发现。

          PRK6可以与ROP–GEF相互作用，暗示着AtLURE1s-PRK6会激活了下游ROP和Ca2+，两个钾转运蛋白chx21和chx23也对珠孔导向的过程非常重要。此外，在珠孔的的过程中值得关注的是，通过情况下，胚珠仅仅吸引一根花粉管，但是如果受精失败，则会吸引第二根花粉管，暗示着植物里存在某种机制在受精成功后能够抑制花粉管再次进入受精成功的胚珠，可能与乙烯信号导致的助细胞退化相关。

第四部分 花粉管的接收

        一旦进入胚珠，花粉管会缓慢通过丝状器最终在助细胞处停止生长爆炸，花粉管的接收是种间杂交的一个重要的合子前障碍，在种间杂交中花粉管不能停止生长并释放精细胞。

         FER(FERONIA)一个雌方表达的CrRLK1L的成员，其突变体花粉管过度生长，不能正常产生种子。其中FER和LRE（(LORELEI，GPI-anchored membrane protein）的协同作用对于花粉管的接收非常重要，在未受精的胚珠当中，LRE可以起到分子伴侣的作用一起和FER从内质网运送至助细胞的丝状器上。定位到丝状器上后，FER和LRE便成为ROP信号复合体的成员，调控ROS的产生，这对于花粉管的接收非常重要，并且FER的胞外域可以与LRE互作，有趣的是，异位在花粉管表达的LRE能够互补雌方 lre 突变体花粉管接收缺陷的表型，暗示着LRE在花粉管到达助细胞后在信号传递中的关键作用，且不同于其作为分子伴侣在细胞内作用。当花粉管与助细胞相互存在信号交流后，助细胞内细胞质的Ca2+浓度的改变以及Ca2+的振荡是依赖于FER和LRE。近期发现EN14(GPI-anchored membrane protein)也定位于助细胞的丝状器上并且可以与FER相互作用。近期，CrRLK1L家族的另外两个成员HERK1和ANJEA可能与FER形成异源复合物来调控花粉管的接收。NTA是Mildew Resistance Locus O家族的一个跨膜蛋白，FER对于在花粉管到达时NTA在丝状器上的重新定位是必须，暗示着NTA作用于FER的下游。EVN和TUN分别编码UDP-糖基转移酶超家族蛋白和多萜醇激酶，暗示着在助细胞的表达的N-糖基化蛋白能够在花粉管的接收中起作用。 amc (abstinence by mutual consent)突变体仅仅在雌雄双方都缺失时才会出现花粉管不能正确接收的表型，这表明花粉管的接收需要雄配子体和雌配子体之间的相互作用，并且两种配子体共享一套信号传递的机制。在对于雄方的研究中发现三个MYB类的转录因子MYB97, MYB101和MYB120，这三个转录因子在花粉管穿过柱头后受诱导表达，单突或是双突都没有表型，在 myb 三突中，约70%的胚珠都出现花粉管缠绕在雌配子体上，并且无法释放出精细胞。这三个MYB类的转录因子和FER的关系目前还不清楚，并且FER的配体还没有找到。 

       在助细胞正确接收花粉管后，花粉管将会爆炸释放出两个精细胞。玉米中在助细胞表达的类防御素蛋白ZmES4可以与在花粉管内表达的钾离子通道KZM1相互作用并且诱导花粉管爆炸。在水稻中，定位于花粉管顶端的RURP(Ruptured Pollen tube)与钾离子通道HAK1相互作用来调控钾离子的稳态和花粉管细胞壁完整性。在拟南芥中，一个编码Ca2+泵的蛋白ACA9如果在花粉管内缺失，则会导致爆炸失败，但是 aca9 的花粉管能够正常到达目的地。此外ANX1 ANX2 还有 BUDDHA’S PAPER SEAL 1 (BUPS1) BUPS2组成的受体复合物是维持花粉管细胞壁完整性的重要因子，这四个蛋白都属于CrRLK1L家族，在花粉管生长时，花粉管内分泌小肽RALF4和RALF19能够与该受体复合物结合，维持花粉管细胞壁的完整性，当花粉管生长至一定阶段时，胚珠分泌的小肽RALF34可以更高的亲和力竞争结合该受体复合物，使得花粉管爆炸。此外LLG2(LORELEI-LIKE-GPI ANCHORED PROTEIN）和LLG3可以作为BUPS1/2ANX1/2受体复合物的共受体存在，且在RALF4/19小肽存在的情况下，可以显着加强LLG2/3与BUPS1/2、ANX1/2受体胞外域之间的相互作用。MARIS属于RLCK8家族的成员，该突变体也展示花粉管提前爆炸的表型，暗示其也位于RALF4/19-BUPS1/2ANX1/2-LLG2/3的信号通路之中。

第五部分 精卵融合

      随着花粉管的爆炸，一对物理上联系的精细胞被释放出来。但是在正式的精卵融合之前，通过活体成像的实验，发现精卵细胞在正式融合之前，会存在几分钟的停滞，这几分钟被认为是雌雄配子信号大量进行交流的时刻确保精卵融合正确进行。基于先前的研究，认为目前在拟南芥配子融合过程总共分为三步，首先是卵细胞分泌的小肽会使精细胞激活，激活后的精细胞会与卵细胞黏附，最后实现融合。

      GEX2(GAMETE EXPRESSED 2)是精细胞特异表达的单次跨膜蛋白，其有一个filamin-repeat的结构域，并且在其他的物种中存在同源基因， gex2  突变体精细胞与卵细胞和中央细胞不能进行正常的粘附过程。突变体雄配子传递率较野生型下降1.9倍。目前GEX2在雌方的配体还没有发现。 hap2(hapless 2) 突变体精细胞不能与卵细胞和中央细胞融合，主要介导了融合的过程。HAP2的同源基因在除了真菌的真核生物中广泛存在，暗示着该蛋白可能在真核生物有性生殖早期就起到融合的功能。此外，结构的数据显示，在精卵融合过程中，HAP2功能类似于II类病毒融合蛋白，需要形成蛋白三聚体，将一个两亲性螺旋插入雌方膜中来与卵和中央细胞融合。由于在雄配子发育过程，营养细胞会将生殖细胞吞噬，所以精细胞会有双层膜的结构，所以外层的膜应该在精细胞膜膜融合之前裂解。此外由于两个精细胞之前还存在一个连接区域，这个区域应该在融合过程会裂解。EC1(egg cell-specific expressed genes)是一组定位于卵细胞的分泌型小肽，共有五个成员EC1.1-EC1.5,EC1小肽定位于卵细胞囊泡状的结构中，并且会从其中分泌到卵细胞外，引起精细胞中HAP2定位的改变完成对精细胞激活。利用EC1-RNAi的材料也发现精细胞的粘附过程也受阻，同时两个精细胞不分离，暗示了EC1功能的多样性。但是目前为止，EC1分泌的时间还不确定，此外EC1位于精细胞上的受体还未鉴定。近期还鉴定到两个精细胞定位的四次跨膜蛋白DMP8(DOMAIN OF UNKNOWN FUNCTION 679 membrane protein)和DMP9,并且主要是在融合过程中发挥作用，被认为可能主要起到保证HAP2正确发挥功能。

       在融合过程，一个精细胞和卵细胞融合，一个与中央细胞融合，多精融合的概率也是非常低，暗示同样存在一种机制来确保精卵的正确融合。在动物中，该过程涉及快速的膜去极化，随后使得精子与合子隔离开。在植物当中，精卵融合的过程在雌雄配子中都会存在细胞质Ca2+浓度增加的现象，但是这是膜去极化的原因还是结果以及是否是真的用来阻止多精融合的过程，现在还不确定。

       至此被子植物已经从单倍体跨越到了二倍体，如果以上的步骤都顺利完成的话，那么他就有可能长成我们随处可见的花花草草。

主要参考文献（简单先列出文章名字）：

1.A Fruitful Journey: Pollen Tube Navigation from Germination to Fertilization

2.Cysteine-rich peptides: signals for pollen tube guidance, species isolation and beyond

3.Ligands Switch Model for Pollen-Tube Integrity and Burst

4.How CrRLK1L Receptor Complexes Perceive RALF Signals

5.Twice the fun, double the trouble: gamete interactions in flowering plants

㈢ 如何诱导建立耐药肿瘤细胞株

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是造成化疗失败的主要原因，体内外研究发现肿瘤耐药的分子机制很复杂，包括靶基因突变、靶基因扩增、DNA损伤修复能力差异、药物进入肿瘤细胞内浓度减少等。本文主要从肿瘤细胞内在的分子异常如原癌基因表达异常、DNA损伤修复基因表达异常及多药耐药有关基因表达异常等几个方面综述了肿瘤耐药的一些分子机制进展。 1原癌基因表达异常 许多原癌基因参与调节细胞的增殖与凋亡，这些基因的改变导致分子调节缺陷使细胞恶变，并对生理刺激作出凋亡的反应能力降低，而诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物作用的重要机制。因此抑制癌细胞凋亡的原癌基因表达异常参与了肿瘤细胞的抗药性，这主要包括P53 、Rb、Bcl 2三种原癌基因。 1.1P53 原癌基因野生型P53 (wtP53 )基因是一种抗癌基因，其产物是核内转录因子，作用是参与基因稳定。当细胞受损时wtP53 蛋白表达增高，诱导与DNA修复有关的基因GADD45表达，增加细胞DNA修复能力，同时通过诱导凋亡促进受损细胞死亡。近年认为P53 蛋白也能活化P21 waf 1基因表达，从而抑制细胞周期蛋白激酶复合物如Cyclin D/cdk4、Cyclin D/cdk6及Cyclin E/cdk2的活性，并增加Rb蛋白的去磷酸化，从而抑制损伤细胞由G 1进入S期，活化的P53 蛋白水平增高能降低细胞发生凋亡反应的阈值，当受损细胞不能修复DNA时则进入凋亡［1］。P53 基因突变消除了许多依赖P53的反应，增加了染色体不稳定性，从而使肿瘤细胞在有DNA损伤的情况下进入细胞周期，抗药性的肿瘤细胞被筛选出来，并且产生有利于基因扩增的条件，使嘌呤、嘧啶生物合成特异性的酶基因扩增，产生对抗代谢类药物如氨甲蝶呤的耐药性。另一方面，P53 基因突变的肿瘤细胞株对凋亡的敏感性下降从而产生耐受化疗药物的特性，研究发现P53 突变的肿瘤细胞导入外源野生型P53 基因后增强化疗药物5-Fu的细胞杀伤作用，这些结果表明wtP53 突变参与了肿瘤细胞对化疗药物的抗性［2］。 1.2Rb原癌基因 Rb基因产物是一种核内蛋白，起反式作用因子的作用。Rb蛋白能与一种细胞生长调节因子E2F形成复合物，抑制E2F诱导S期基因如DNA聚合酶、胸腺嘧啶合成酶、二氢叶酸还原酶等基因的表达，从而抑制细胞的增殖。细胞周期蛋白Cyclin D家族通过使Rb蛋白磷酸化，抑制其与E2F形成复合物，增加自由E2F因子释放，参与了Rb蛋白网络控制细胞由G1期向S期转变的过程。因此，当Rb基因突变或Cyclin D 1蛋白表达增高，则使E2F因子活性增强从而使E2F诱导的S期基因表达增高，使肿瘤细胞对化疗药物氨甲蝶呤敏感性下降［3］。 1.3Bcl2原癌基因家族Bcl2基因是在人滤泡淋巴瘤细胞14、18号染色体异位时发现的，但Bcl2蛋白本身并无促进细胞周期进行和使细胞分裂的作用。研究发现Bcl2作为一种抗凋亡基因能专一性抑制许多刺激导致的细胞凋亡，作用机理可能与抑制野生型P53蛋白活性、抑制C myc诱导的凋亡、与bax蛋白形成异聚体抑制其活性有关。在人前列腺癌、结肠癌等肿瘤中发现有Bcl2蛋白过表达，并发现过表达Bcl2的腺癌对化疗药物阿糖胞苷等有抗药性［4］，Bcl2基因家族中的Bcl XL也能与Bax蛋白形成复合物，抑制其诱导凋亡的活性。在白血病高度耐药株P388 中发现，Bcl XL水平显着增高，并与肿瘤细胞耐药性相关［5］。2DNA损伤修复能力异常许多化疗药物如氮芥、顺铂等通过损伤DNA如使DNA链间交联达到杀伤肿瘤目的，当肿瘤细胞修复DNA损伤的能力增强，则使肿瘤对化疗药物产生抗性。近来发现另一类化疗药物，能选择性抑制拓扑酶使DNA链断裂，不同的抑制物能与拓扑酶以共价复合物形式稳定在DNA不同位点，通常是DNA核基质附着区和c myc基因活化转录区，使DNA链断裂导致细胞死亡。当肿瘤细胞拓扑酶发生改变如拓扑酶Ⅱ转录水平和活性降低或者肿瘤细胞拓扑酶Ⅰ突变，使肿瘤细胞对化疗药物拓扑酶抑制物产生耐药性［6］ 。另一方面，研究发现O 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶MGMT能清除O 6 乙基鸟嘌呤并与N1O6 乙醇鸟嘌呤反应形成一种不可逆的复合物，从而抑制了N 3C N 1G链间交合物的形成，缺少MGMT的肿瘤细胞株对化疗物苄氯亚硝基脲CENUs高度敏感，而转染人MGMT进入缺乏此酶的细胞株后发现链间交联形成减少并对CENUs产生抗性。在脑肿瘤中，低水平MGMT的表达与卡氮芥碱基治疗效果转好有关［7，8］ 。体外发现DNA错配修复与识别错配位点的蛋白hMSH2(人Muts同源物2)、GTBP(G T结合蛋白二异聚体)和结合此异二聚体的hMLH1蛋白(人Mutl同源物)有关。hMSH2或hMLH 1缺失导致肿瘤的发生及对顺铂产生低水平耐受［9］ 。另外损伤识别蛋白DPR s与铂抗性有关，DPRs是一类含迁移基因HMG的蛋白，选择性地与顺铂 GG和 AG链间双聚物结合后，丧失其转录因子的正常功能，从而影响特异基因的转录使肿瘤细胞产生铂抗性。酵母菌编码HMG蛋白的IXR1基因活性缺失，可对顺铂产生两倍抗性［10］ 。紫外线损伤识别蛋白UVDRP与紫外线诱导的6，4 光合物高度特异性结合，这种DPR蛋白在顺铂耐性肿瘤细胞株中表达活性增加［11］。近年来有文献报道DNA聚合酶α、β在苯丙氨酸、氮芥和铂耐性细胞株中表达大大增高。体内用顺铂治疗后，肿瘤细胞的DNA聚合酶α、β和DNA连接酶活性大大增加［12］，使肿瘤细胞在有DNA链损伤的情况下仍能进行复制，在细胞G2期清除链间交联、DNA链间双聚体，并抑制P53诱导的凋亡，从而产生铂耐性。在对铂化疗无反应的恶性卵巢癌患者的肿瘤组织中发现与核酸有关的切除修复基因P33 和P31 基因表达远高于铂化疗有效的患者。在白血病患者的研究中发现P33 过表达与其对氮芥的耐药性有关［13］ 。因此DNA修复有关的酶活性增高是肿瘤对化疗药物产生抗性一个重要原因，筛选与DNA修复有关的选择性抑制剂能增加化疗效果。 3多药耐药有关基因表达异常 肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉抗药性的造成肿瘤化疗失败的一个重要原因。研究发现这种耐药方式即在人肿瘤中和培养的肿瘤细胞株中出现多药耐药的产生机制与多种因素如多药耐药基因、谷胱甘肽转移酶、蛋白激酶C等有关。多药耐药基因MDR定位于第7号染色体，这个基因蛋白编码区由27个外显子组成，其编码的170KD的P糖蛋白，属于腺苷三磷酸结合蛋白超家族成员。P 糖蛋白在耐药细胞膜上过度表达，可将细胞内的化疗药物泵出胞外，细胞内化疗药物达不到有效杀伤剂量而致耐药性产生。非经典型多药耐药如人HL60抗阿霉素等抗性细胞株，其内质网膜上表达一种110KD蛋白，因从肺癌细胞中分离到该蛋白基因故命名为肺抗性蛋白LRP 56，cDNA序列同源性分析中发现这种蛋白属于胞质穹窿蛋白，这种胞内穹窿蛋白是一种与核胞浆运输有关的细胞器。因此，LRP 56的作用途径可能是：一方面通过降低药物的核质分布比率以降低药物的有效浓度，另一方面通过囊泡转运和胞吐机制将胞质内药物排出细胞外，降低药物的绝对浓度。许多人肿瘤细胞株和实体瘤中均有LRP 56蛋白表达，在人结肠直肠癌中LRP 56有高表达［14］ ，血液系统肿瘤及实体瘤的LRP 56表达水平也与化疗敏感性有关。此外，在P糖蛋白表达阴性的胀瘤细胞株中发现多药耐药相关蛋白MRP，MRP编码mRNA7.8～8.2 kb,定位于染色体16 p13.1,MRP产物为190KD的膜结合糖蛋白，克隆及转化实验发现MRP基因能使肿瘤细胞对多种药物产生抗性［15］。体内外的实验证实，谷胱甘肽转移酶GST能催化谷胱甘肽与药物形成复合物而解毒，肿瘤细胞的GST活性增高从而产生耐药性。研究发现GST家族中GST π水平在人肿瘤组织如胃癌、结肠癌、肺癌表达增高，许多肿瘤细胞株对化疗药物苯丙氨酸芥、环磷酰胺的抗药性与GST π表达水平的增高。利用反义技术阻断肿瘤细胞GST π表达，可明显增强其对各种化疗药物的敏感性［16］ 。另一种药物代谢机制与亲核物质如氮硫等和葡萄糖醛酸结合有关，这是由葡萄糖醛酸转移酶UDPGTS这一类大家族催化。在鼠白血病细胞株P338 就发现UDPGTS水平增高并灭活有代谢毒性的daunorubicinol，并对其产生抗药性［17］。蛋白激酶C是一种Ca2+ /磷脂依赖的同功酶，由单一多肽链组成，包含钙依赖性的巯基蛋白酶分解的两个不同部位和含有ATP及底物蛋白结合区域的亲水性催化部位/活性中心。在体外建立的耐药细胞株与相应的敏感株相比，蛋白激酶C活性明显增高。研究表明蛋白激酶Cα对肿瘤多药耐的形成起重要作用，但各种肿瘤组织的蛋白激酶C存在异质性。蛋白激酶C可能通过磷酸化耐药基因编码的膜蛋白调节其转运功能或通过核内的基因转录参与肿瘤的多药耐药形成。因此，有必要对蛋白激酶C在多药耐药发生、发展中的作用做进一步研究［18］。综上所述，肿瘤细胞对化疗药物产生抗性的机制是复杂的。针对肿瘤细胞原癌基因表达异常，人们利用基因治疗的方法将正常的基因导入细胞增加其对化疗敏感性，而许多化合物如钙离子通道阻滞剂具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。因此临床化疗应联合不同作用机理的药物、不同的治疗方法才能达到良好的临床疗效。

㈣ 生物反应器的应用

1.改良乳汁品质；
2.生产药用蛋白。
3.外源基因在动物体内的位点整合问题；
4.乳蛋白基因表达组织特异性问题；
5.目的蛋白的翻译后修饰问题；
6.转基因表达产物的分离和纯化问题；
7.转基因的技术与方法问题；
8.伦理道德问题。
膀胱生物反应器
膀胱反应器有着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易，不必对动物造成伤害。此外，该系统可从动物一出生就收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。膀胱生物反应器最显着的优势在于从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。
膀胱生物反应器多用Uroplakin启动子启动人生长激素（hGH）的表达，产生 hGH特异性的高丰度RNA，这些RNA与蛋白分泌量高度相关。Uroplakin基因在多种哺乳动物体内有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。
生长激素 Kerr等[12]将pUPII-LacI用质粒的Kpn i进行消化，用T4DNA多聚酶切去3'端，然后用BamHI消化，分离出3.6kb的5'端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反应器特异性表达所需的大部分序列。将此片段与位于无启动子的pOGH质粒纯化SaI和BamHI位点间的hGH结构基因的5'端连接，得到pUPII-hGH质粒，能表达该质粒的组织分布有限。将得到的pUPII- hGH质粒用HindIII和EcoRI消化，得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用于显微注射，在膀胱上皮细胞中合成hGH，收集转基因动物尿液，从中提取重组蛋白。但在这一途径中转基因动物会因hGH的作用逐渐肥胖，并导致雌性动物不育症。乳腺生物反应器也能表达hGH。用同源重组方法将hGH基因导入210kb的人α-乳球蛋白位置依赖性YAC载体，将重组的YAC dNA显微注入大鼠胚胎，转基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH，含量可达0.25～8.9mg/ml[13]。
翻译与修饰
转基因动物分泌的蛋白，特别是糖链成分的结构与人体蛋白有差异。因此研究分泌蛋白的修饰就显得很重要。在乳腺生物反应器中，蛋白质翻译前修饰的主要方式是在多个位点对乳腺中的蛋白前体进行信号肽剪切和对糖链进行修饰。例如，从山羊乳液中得到的长效组织型纤溶酶原激活剂与人体内和相比较，含有少量的异种（外源）低聚糖，同时，唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖含量明显减少，关且出现缺少蛋白质C127的N-乙酰半乳糖胺。此外，从猪乳液中得到的C蛋白中是没有的；从羊乳液中得到的重组α1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差异；在山羊乳腺中观察到了重组抗凝血酶Ⅲ上低聚甘露糖与特异天冬酰胺的位点特异性聚合等等。研究小鼠乳液中的重组γ-干扰素可对翻译前修饰有更好的理解，γ-干扰素有大量的位点特异性变化，在N端连接位点进行复杂的唾液酸酸化和连接核心岩藻多聚糖，其次是低聚甘露糖。与从小鼠细胞中取得的蛋白质相比，分泌的重组蛋白没有GalNAc、NeuGC和Gal∞l 、3Gal-βl、 4GlcNAc残基。这些蛋白特异性的糖基化类型可与细胞上的受体结合并清除病人体内的重组蛋白，因此可能会影响疗效，最终的结果尚有待验证。
同源组织表达蛋白质的优点是可对表达产物进行调控并校正珠蛋白链的翻译过程，避免无效的翻译前修饰，使产物蛋白尽可能与人体天然蛋白相似，降低人体内的排斥反应，提高药物蛋白疗效。目前，蛋白分离技术飞速发展，大大提高了蛋白质分离的可行性和分离效率。第二种技术路线中目前以乳腺生物反应器较为多见，因为乳汁易得到，且乳汁中的特异蛋白含量较大，对蛋白水解酶的降解作用也比较稳定。乳汁是一种混合物，含3%～6%的总蛋白，3%～5%的脂类，对蛋白提纯技术要求比较高。另一方面，药用蛋白是在动物乳腺中产生。因此只有含转基因型人雌性动物在泌乳期才能生产药用蛋白，可用的动物数目有限，且生产期较短。膀胱生物反应器的优点在于含有转基因型的两性动物都可用，产后收集时间长，提取产物蛋白浓度双乳液中的含量低得多，尽管收集的尿液多且时间长，生产单位数量的药用蛋白在乳腺和膀胱生物反应器中的成本是差不多的
问题与展望
在转基因动物生物反应器的应用中，有些问题尚待解决。比如，由于转基因动物的基因是镶嵌整合型的，因此它的下一代并不都转基因型。但是在绵羊，猪和山羊中观察到只要转基因型从起始个体传给了下一代，这种转基因型就可以稳定地遗传好几代。而其他一些因素，如外源基因的整合率低，胚胎移植的受孕率低等都使有效的转基因动物大大减少。同时，由于对调控表达水平的程序，指导进行精确的组织特异性和发育调控表达的程序，以及调控和编码内含子序列间可能的相互作用的认识尚不充分[14]，容易引起异位点表达；由于现在的技术还不能控制整合的位点，因此存在对内源基因进行插入诱变的可能性，转基因型的表达会受整合的不同位点的影响。这些因素使得在家畜长成前，要用小鼠对新基因构型进行常规试验。
转基因动物生产的药用蛋白可用于预防和治疗疾病，其转运系统及口服用药引起的耐受性等问题都在作进一步研究。以转基因家畜生产珍贵的药用蛋白具有重大的经济价值和社会效益，这项生物技术最终将会得到广泛应用。

㈤ 8个月宝宝喝琥珀蛋白补铁口服液一天喝多少毫升

怎么护理新生儿 第1门课 哺喂母奶或配方奶小叮咛新生儿在喂食完后，拍打嗝的动作相当重要，可以有效地降低新生宝宝吐奶与溢奶的发生率。“吸吮”是宝宝具备的基本能力之一，通过吸吮，宝宝即可获取成长所需的营养。 无论是哺喂母乳或是配方奶的新手父母，都应该有基本的哺喂观念，才能让你的宝贝吃得顺利又健康。Tips哺喂母乳：约每2个小时哺喂1次。哺喂配方奶：约每4个小时哺喂1次。4种姿势正确喂母乳妈妈在哺喂母乳时，可尝试不同的姿势让宝宝吸奶。 1.坐姿(摇篮抱法)姿势提醒：以舒适的姿势坐在床上，或找一个有椅背及扶手的椅子靠着椅背坐下。 2.斜倚姿势提醒：以舒适的姿势斜倚床上，腿部及背部垫枕头，使宝宝的头部躺在手臂上。 3.橄榄球抱姿姿势提醒：此姿势适用于双胞胎、婴儿含乳有问题、乳腺管阻塞或是剖宫产的妈妈。妈妈的手臂环绕在宝宝身体的下方，用手掌及腕部拖住宝宝身体的下方，用另一只手掌及腕部拖住婴儿头部，以整双手臂支撑婴儿的身体。 4.侧躺(晚上哺乳或剖腹产后最好的姿势)姿势提醒：妈妈侧卧，与宝宝面对面，妈妈的腹部接触宝宝的腹部，宝宝头部靠近妈妈的乳房。 5步骤正确冲泡配方奶在喂食宝宝配方奶时，建议新手父母遵循以下5步骤，会让宝宝吃得卫生又安心。 1.准备器具消毒器及有盖的大锅、奶瓶、奶嘴、奶盖，宜准备6~8支奶瓶、洗奶瓶用毛刷(1支)、镊子(夹奶瓶、奶嘴用)。 2.消毒方法先用肥皂清洗双手，用干净的消毒锅加8分满的水，准备加热。耐热的玻璃奶瓶、镊子等器具于冷水时放入锅内煮10分钟，再将较不耐热的器具包括奶嘴、奶盖、奶圈等用纱布包着一起放入煮5~10分钟。再将消毒好的奶瓶放置于干净的地方晾干，以备使用。 3.温开水冲泡奶粉在奶瓶里倒入需要的温开水(煮沸过的热开水冷却至40℃左右)。不要用滚烫开水冲泡奶粉，易结成凝块，引起宝宝消化不良。 4.溶入奶粉用汤匙舀起奶粉，舀起的奶粉需松松的，不可紧压，再用“D形罐口”刮平，对准奶瓶口倒入。 5.套上奶嘴并检查温度及流速手不要碰到奶嘴，把它装上去并试试牛奶滴出的情形。在手内侧滴一滴，确定适当的温度。 第2门课 睡觉1个月大以内的新生儿，平均每天有15~20小时的睡眠时间，是成年人的2倍多。宝宝的睡眠周期循环相当频繁，约每2个小时会有短暂的清醒，一个晚上约有7、8个周期，浅睡和深睡交替进行。 Tips&#57348;新生儿每天约清醒2~3小时，之后又进入睡眠状态。宝宝夜夜难眠8项原因“夜啼”有时是宝宝身体不适的表现，以下为你提供8项检视新生儿夜晚哭闹的原因，排除这些原因，宝宝就可以一觉到天明。 1.肚子饿新生儿的胃部容量较小，进食变得较为频繁，有些新生儿在半夜还需要再喂一次奶，当爸妈忘了喂食自然会哭闹不止。 2.尿布湿了新生儿每天大概需要换掉10片尿片，半夜宝宝哭闹不安，可能就是尿布湿了。尿液跟粪便中含有尿素和尿酸等刺激性物质，容易使宝宝的小屁屁不舒服，换尿片不仅可以预防尿布疹，也可以减少宝宝半夜哭闹。 3.胀气奶嘴孔的大小不同、母亲喂奶的技巧不好、拍气的方式不对等都会令宝宝出现一阵哭闹一阵停止哭泣的胀气症状。这时，父母亲可以用手掌按摩小宝宝的腹部，来舒解宝宝因胀气带来的不适，若情况仍无法改善，则需要到医院请医生开药消除胀气。 4.皮肤痒、痛注意宝宝是否有被刺伤、被蚊虫叮咬等未被注意到的伤口，甚至连严重红肿的尿布疹及异位性皮肤炎，都会使宝宝突然造成身体上的不适而影响睡眠，这时，爸妈们最好详细检查宝宝的身体状况，了解使宝宝不适的原因。 5.白天睡太饱很多宝宝白天睡得十分香甜，半夜无法入眠。所以白天尽量不要让宝宝睡太久，以免晚上哭闹不休。 6.需要安全感宝宝太冷或太热、奶嘴掉了、心爱的玩具没在手边或心理上感觉需要爸妈的关爱时，都会以哭闹来表达自己的意见。所以宝宝的睡眠环境温度要适当，不要盖过量的被子，爸妈们适时地给予宝宝拥抱与安抚，让宝宝更有安全感，自然会减少哭闹。 7.维持睡眠环境安宁父母的脾气与生活习惯、家庭气氛、居家环境都会影响宝宝的睡眠，尽量维持一个安静、祥和的氛围，让宝宝带着好心情入睡。 8.宝宝生病了 (1).肠绞痛 由于婴幼儿在未满4个月之前，肠壁的神经发育尚未成熟，造成肠胃道蠕动不规则，蠕动过快，纠结在一起而导致痉挛疼痛。发作时间通常在傍晚4点到8点，以及半夜零时前后。 (2).胃肠道疾病 家长应留意宝宝的排便状况，是否好几天没排便 。(如粪便嵌塞、肛裂、肠胃炎、消化不良或腹股沟疝气。 (3).感染性疾病 宝宝若发烧，则可能是新生儿感染的迹象。常见的感染器官为呼吸道、肠胃道、泌尿道与脑神经系统

㈥ 蛋白质N端和C端的测定方法是什么基本原理是什么

(1)N-末端测定
A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要贡献之一。
DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后，通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。
B.氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法,步骤如下：
由于乙内酰脲氨基酸不带电荷，因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开，分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解，重新生成游离的氨基酸，鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸。
C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用，方法类似于Sanger的DNFB法，产物是磺酰胺衍生物。
丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍，样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。
(2)C-末端分析
A.肼解法：这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。
这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解，以免释出的氨基酸混淆末端分析。
B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

㈦ 三维和空间基因组学时代（上篇）

十多年前，高通量染色质构象捕获(Hi-C)技术的出现开启了三维基因组学的新纪元。从那时起，解析三维基因组的组织结构的方法与日俱增，使得人们越来越了解DNA是如何包装在细胞核中的，以及基因组的时空组织是如何协调其重要功能的。最近，随着新一代空间基因组学技术的出现，人们已经开始揭示基因组序列和三维基因组结构是如何在不同组织环境中的细胞之间变化的。在本文中，我们系统总结了用于解析基因组拓扑结构的技术和工具在过去十年中的发展情况，并讨论了新技术的发展如何推动三维和空间基因组学领域的发展。

与目前已被广泛接受[2]的“空间转录组学”[1]术语不同，“空间基因组学”这一术语只是最近才被提出的，且定义也不太明确。与空间转录组学相类似，术语“空间基因组学”可用于指示研究基因组序列如何在健康和疾病组织或器官的不同区域间的变化，例如使用多区域测序来研究肿瘤内的遗传异质性[3]。另一方面，自2009年高通量染色质构象捕获(Hi-C)技术问世以来[4]，空间基因组学领域的许多研究主要集中在绘制细胞核内基因组的3D组织结构图谱[5,6]。为了避免概念的混淆，我们提议使用术语“三维基因组学”来表示对细胞核中遗传物质的空间排列以及相对于核界标（nuclear landmarks），如核纤层和核体的研究，而术语“空间基因组学”则表示研究基因组序列或基因组在细胞核中的空间定位如何在多细胞生物体的组织或器官中的特定位置从一个细胞到另一个细胞(以及在不同细胞类型)之间的变化（Figure 1A、B)。在本文中，我们简要回顾了研究三维基因组学的关键方法，这些方法使得人们能够在细胞群体和单细胞水平研究三维基因组的组织结构，然后重点介绍了正在点燃空间基因组学领域的新兴技术，这些技术允许我们跨组织研究多细胞间的(3D)基因组组织结构的变化。关于推进三维基因组学领域的相关方法进行更详细的比较，我们参考了几篇优秀的近期综述[6–11]。并且，在本文中，我们也不讨论已被广泛用于研究基因组变异的多区域测序方法，该方法在肿瘤中可达到空间分辨率。

实际上，大多数早期的三维基因组学研究都采用了基于成像的方法[12,13]。因此，二十多年前开发的第一种解析三维基因组互作关系的方法 -- 染色质构象捕获(3C)技术[14]，在整个研究领域产生了巨大的连锁反应。3C技术及其后续的高通量测序版本-Hi-C[4]技术，是基于3C衍生的多种测序方法大家族中的两个主要成员[6,7,9]，这些技术都是利用近端连接探测空间上相互接近的DNA序列之间的染色质互作。使用这些方法解析多种细胞类型和模式生物的三维基因组结构，人们发现基因组会普遍组织成多种不同层级的结构单元，包括A/B区室(compartments)和子区室[4,15]，拓扑相关结构域(TADs) [16]，和染色质互作环(loops)[15]。然而，包括Hi-C在内的大多数基于3C的方法（Box 1），由于使用了邻近连接、甲醛交联和限制性连接酶等而具有若干固有的连接偏差[17–21]。为了克服这些缺点，研究人员进一步开发了各种替代技术，包括基因组结构映射(GAM) [22]，通过标记扩展对交互进行拆分-混池识别(SPRITE) [23]，通过基于液滴和条形码链接测序进行染色质相互作用分析(ChIA-Drop) [24]，DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam)C [25]，以及化学交联辅助邻近连接捕获技术(CAP-C) [110]等。

在这些技术中，GAM通过在交联核的冷冻切片中检测DNA位点的共测序频率来构建Hi-C样邻接矩阵，以规避邻近连接带来的偏差[22]。SPRITE通过连续几轮的拆分-混池添加条形码对交联的染色质复合物进行分割，在此期间，同一复合物中交联的染色质片段会混合到一起，并用同一系列的条形码进行标记[23]。类似地，ChIA-Drop依赖于使用微流体装置，通过液滴封装物理分离交联和DNase I消化的染色质复合物[26]。这样可以对不同液滴中的染色质复合物添加独特的条形码，并对共交联的染色质片段进行扩增测序[24]。相比之下，DamC代表了第一种基于3C技术且无需交联和连接的替代方法。DamC是DamID技术的一种改进，DamID是一种涉及将大肠杆菌Dam甲基化酶与感兴趣目的蛋白进行融合的方法，在表达时会导致空间上与融合蛋白接近的GATC序列中的腺嘌呤A进行甲基化，从而能够通过测序进行鉴定[27]。在DamC中，与反向四环素受体融合的Dam被条件性的(经多西环素处理后)招募整合到不同基因组位点的四环素操作子阵列中，之后通过测序检测DNA的甲基化来揭示染色质间的互作[25]。由于DamC是在非固定细胞中进行的，因此使用该技术证明了TADs和特定染色质环等结构不是因为细胞固定而产生的人工假象，同样可以在非固定的细胞内检测到[25]。最近，CAP-C [110]试图规避由蛋白质与DNA交联(在大多数基于3C的方法中发生在甲醛交联期间)时所引入的潜在偏差。这种偏差包括DNA结合蛋白在掩蔽限制性酶切位点和阻碍邻近连接中可能具有的潜在阻碍作用，其反过来会降低测序的分辨率和噪声。为此，CAP-C使用多功能化学平台和紫外线照射，通过直接交联DNA-DNA捕获染色质构象，以亚千碱基分辨率和低背景噪声生成基因组互作连接图[110]。此外，当在没有温和的甲醛预混合的情况下，CAP-C还能够检测天然的染色质构象[110]。除了检测成对位点之间的互作连接外，GAM，SPRITE，ChIA-Drop和其他几种3C方法[7,9]还可以检测揭示更高阶染色质结构的多重互作连接，特别是当应用于单细胞时，如单细胞SPRITE (scSPRITE) [28]等。

除了对DNA-DNA互作连接进行测序的方法之外，人们还开发了其他几种检测方法，它们可以根据核界标(nuclear landmarks)解析基因组的组织结构（Box 2）。例如，RNA和DNA (RD)-SPRITE允许同时捕获RNA-DNA、RNA-RNA和DNA-DNA之间的互作连接，从而能够检测由特定RNAs组成的核体相关的染色质互作中心，如核仁和核斑点[29]。同样地，根据转录组-基因组关联图谱的数据，如RNA-基因组互作图谱(MARGI) [30]，也可以用于鉴定这些与核体相关的基因组区域[31]。此外，另一种识别与核界标相关区域的方法是利用组成这些结构的蛋白质。其中，实现这一目标的最古老且可能最广为人知的策略是DamID，该方法需要异位表达Dam融合蛋白，正如前文所述[27]。例如，DamID技术可以用于揭示与核纤层互作较强的基因组区域，也就是所谓的核膜相关结构域(LADs)[32]，并且该技术最近也被提升到了单细胞水平，即scDamID[33]。此外，DamID还被定制到了scDAM&T-seq技术中[34]，这是一种多模态的方法，可以同时在同一个细胞中检测蛋白质-DNA互作和RNA的表达，因此可以在单细胞水平上探索3D基因组结构和基因表达之间的相互作用关系[34,35]。除了检测互作频率之外，人们还开发了酪胺酸信号扩增测序(TSA-seq)的方法来估计基因组位点与特定核体之间的细胞学距离[36]。在TSA-seq中，人们使用辣根过氧化物酶偶联的抗体靶向感兴趣的蛋白质，该抗体在酪胺底物存在的情况下会产生自由基梯度，这种自由基梯度以一种几乎均匀的方式标记周围的基因组区域，可以达到距离靶位点数百纳米至一微米的距离[36]。对标记后的DNA进行测序后，我们可以基于DNA荧光原位杂交(FISH)测量的物理距离将标准化后的读数频率转换为与靶蛋白结合的3D距离，并且可以同时使用多个探针靶向具有不同TSA-seq值的基因组区域[36]。通过TSA-seq测序，人们发现基因组并非随机地排列在核斑点周围，而是在这些核体周围形成高度保守的基因表达梯度[37]。最后，为了克服DamID和TSA-seq技术对融合蛋白表达和大量细胞的需求，研究人员最近还设计了另一种方法，名为“使用CUT&RUN技术解析基因组组织”(GO-CaRT)[38]。GO-CaRT是基于CTU&RUN技术的基础而建立的[39]，这是一种表观基因组学分析策略，通过使用与微球菌核酸酶连接的抗体原位切割相关的染色质，来解析体内与核体相关基因组区域的相互作用。将GO-CaRT应用于各种细胞类型，包括来自不同脑区和物种的神经前体细胞，结果发现了与先前由DamID鉴定出的LADs之间的差异，并发现它们在不同细胞类型之间的可变性高于之前所理解的[38]。此外，应用GO-CaRT技术解析人类前脑样本，人们还揭示了在所谓的核斑点相关结构域中存在转录活性的LAD亚结构域和精神分裂症遗传风险位点聚类域[38]。除了这三种主要的方法之外，通过在技术流程中加入免疫共沉淀步骤，研究人员还开发了SPRITE[40]和其他几种3C方法[7,9]，现在人们还能够选择性地捕获与感兴趣的特定蛋白质相关或依赖于该蛋白质的染色质互作。

尽管前文描述的技术主要探究了与选定的核界标相关联的基因组区域的特征，但这些技术并不能评估细胞核其余部分中的空间染色质结构的组织特征。因此，为了研究染色质穿过整个细胞核的辐射性，研究人员开发了一种通过测序定位基因组位点(GPSeq)的技术[41]。GPSeq在形态学上保留的交联核中，使用一段时间的限制性消化过程，对连续同心层中的染色质进行逐步标记。将层特异性的条形码连接到酶切的限制性位点后，对基因组DNA进行测序，并将基因组序列划分到合适大小的区域(通常为20–100 kb)。然后使用一种简单的数学计算方法，它比较了在不同的消化时间点上每个基因组区域内给定限制性酶切位点的消化概率[41]。通过将GPSeq获得的径向图谱与其他方法获得的多种全基因组染色质特征相叠加，如ATAC-seq [42]和ChIP-seq [43]，人们发现许多线性基因组和表观基因组相关特征，包括各种表观遗传标记、转录因子结合基序和复制时间区--沿着核半径进行空间组织[41,44]。在许多核RNA相关联的染色质区域，人们也发现了这种类似放射状组织结构的存在，表明径向梯度分布是三维基因组结构的重要设计原则[45]。值得注意的是，在计算机三维基因组建模中，通过Hi-C染色质互作图谱和GPSeq生成的径向图进行整合计算可以得到显着改善的建模结果[41]。除了这种方法之外，越来越多的计算方法集成了多模态组学数据集来模拟三维基因组结构，如核基因组的空间位置推断(SPIN) [46]，可用于探索三维基因组结构如何在遗传上相同的细胞之间的变化。此外，目前许多基于测序的检测方法已被改进提升至单细胞水平，包括单细胞高通量染色体构象捕获技术(scHi-C) [47,48]，Dip-C [49]，scSPRITE [28]，以及scDAM-ID [33]，通过这些技术我们可以研究不同细胞类型之间的三维基因组动态变化特征。由于对这些方法的描述超出了本综述的范围，我们建议读者可以参考最近发表的几篇介绍三维基因组学单细胞方法的优秀综述[50,51]。