非洲猪瘟血样检测方法和步骤

A. 非洲猪瘟的检测方法有哪些非洲猪瘟疫情防控方法是什么

荧光定量 PCR 方法，该方法是将光谱技术引入到PCR 反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，解决了常规 PCR 方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。

等温扩增法，该方法是一种新兴的分子生物学检测方法，等温扩增方法不需要 PCR 中的变性、退火步骤，即可完成对靶序列的循环扩增，大幅缩短了时间，整个扩增反应时间一般少于 60 min，而常规PCR 方法的反应时间一般需要 2 h 以上。等温扩增试剂盒适合现场检测，灵敏度高，能够大幅提高猪瘟防控的可行性。

要减少场外人员和车辆进入猪场，要对人员和车辆入场前彻底消毒，要对猪群实施全进全出饲养管理，要对新引进生猪实施隔离，要按规定申报检疫。

非洲猪瘟防控注意事项

养殖场应该坚持全进全出，自繁自育的养殖模式，构建完善的封锁隔离措施，避免猪和野猪直接接触。养殖场在生猪调运过程中，尽量不要跨省引进种猪，必须引种时，一定要进行严格的产地检疫、疫情检测，严格执行落地报告制度和隔离观察制度。

殖场内部如果发现非洲猪瘟可疑疫情，严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》进行处置，迅速采取应急措施，预防疫情传播和蔓延。

B. 非洲猪瘟抽血能查出来吗

你好，是可以的。唾液的早期可以检测到,血液的可能要晚几天才能检测到,其他的区别不大，需要看选择哪个厂家的试剂盒。选择检出率高的PC r检测。

C. 非洲猪瘟弱阳性能转阴性吗

非洲猪瘟疫病毒在刚被感染或发生时，其表现并不是完整的临床症状。并且在疫病发生的早期阶段或少数受感染猪只所表现出的症状容易与其他疾病的症状相混淆。而非洲猪瘟疫病毒至今仍没有可靠的预防免疫疫苗及防治药物，为了有效地防止疫病的传播，及早发现疫情并成功地进行＇拨牙式＇防控，这就得掌握并借助于成熟有效的临床检测枝术。那么，根据国外有效的防控检测经验及国内自18年8月本国发生疫情的八个多月来的临床成功防控及检测实践经验的技术推广，已经允许猪场进行非洲猪瘟疫病毒的自检自查，而在操作过程中通常会采用血液或唾液两种样本进行实验检测，为及早地进行成功防控，制止疫病的传播争取到最佳的时间。

非洲猪瘟弱阳性能转阴性吗唾液检测呈阳性就可以确定非洲猪瘟了吗？

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既然猪场可以通过血液及唾液样本进行非洲猪瘟疫的检测来发现病毒，那么锋哥就得先跟大家科普下关于通过这两种样本对非洲猪瘟疫病毒的检测技术及实验方法。1、在对病疫的科学实验中，采用肌肉接种的方法对猪进行病毒试验接种，猪在实验的临床表现下，最早先于三天即可在实验猪的血液中检测到病毒，而随后才能在唾液及粪便物中检出。

2、而猪场的猪在实际临床表现中，往往都是通过猪群之间的嘴鼻直接接触或间接接触而感染病毒，这便是自然感染的正常方式。而非洲猪瘟疫病毒在自然感染病毒的情况下，往往比在血液中检测出病毒早于3~18天，即在自然感染病毒的情况下，血液会在唾液的检测出病毒3~18天后才可能检测出来被感病毒。但实际猪场在血液中检测出非洲猪瘟疫病毒，已经可以断定为己有很大一部分猪已经受到病毒感染了。所以，猪群中一旦出现不食、厌食、轻微发热等疑似病症则应立即对病猪进行唾液及肛肠试纸混合检测，为及时发现非洲猪瘟疫病毒并及时地对猪场的进行防控，减少受疫感面积争取最有利的时间。

综上所述，根据在实验技术及临床表现对受感非洲猪瘟疫病毒的猪的病毒检测分析，在猪场的实际操作中，利用猪唾液来检测到病毒呈阳性不但可以断定为猪已经感染到了非洲猪瘟疫病毒，而且还为猪场及时发现病毒，及早进行非洲猪瘟疫的有效防控，争取到了最有利的黄金时间。

感染非洲猪瘟病毒到现在有2年多了，一听说到猪，就会想到非洲猪瘟，养猪人对其谈瘟色变，对我们的养猪行业影响巨大，猪

D. 测非洲猪瘟为啥要用抗凝管

在非洲猪瘟检测时，猪抗凝全血样品在经过水浴灭活后有时会产生凝胶，影响实验的开展。从保存时间及保存温度两个方面对380份猪抗凝全血样品的检测过程进行分析，发现样品保存于零度及以下环境和水浴灭活过程会对凝胶的产生有显着影响。

E. 2022-07-06

一、动物样品采集、保存和运输（猪、禽）

1.采样单需填写畜牧场的名称、地址、联系人、电话。动物的品种、日龄、数量。免疫情况，临床表现、发病死亡情况以及治疗用药情况等。

2.非洲猪瘟采血需采全血，抗凝血。不采血清。

3.采样后无法送检，需加缓冲液保存。

4.牛、羊选择颈静脉采血，于颈静脉沟上三分之一和中三分之一交界处。

5.猪采用前腔静脉采血，猪头向上提拉与地面呈30度以上，颈部气管两侧，最凹处进针。

6.禽翅静脉采血，在翅下静脉处消毒，手持采血针，从无血管处向翅静脉丛刺入，有血液回流即可。

7.血液倾斜放置2小时，一般血清就可析出。或使用4000转每分钟离心机离心10分钟，可得所有血清，血清放-20℃冻存，全血放4℃冰箱保存

8.组织样品采集，要采集病变的器官组织，或病变和健康组织交界处。先采集实质器官，后采污染的器官组织。

9.牛羊O-P液采集，待牛羊绑定后，用消毒过的探杯，随吞咽动作送入食道，轻轻来回抽动2-3次，然后取出探杯，即可采集到O-P液。

10.样品采集穿防护用具步骤：戴口罩---戴帽子---穿防护服---戴防护眼镜---穿鞋套或者胶鞋---戴手套

11.样品采集脱防护用具步骤：摘下防护眼镜---脱掉防护服---摘下手套---脱掉帽子---脱掉胶鞋或鞋套---摘下口罩

12.实验过程中所产生的废弃物应作无害化处理。实验室内部先进行消毒液浸泡消毒，再使用高压灭菌锅，预处理后，移交给专业的无害无害化处理公司处理。

13.客户寄送样品，需留样15天。

二、样品的接收、制备、留样

1.样品运输需密封、低温（24h内4℃快运、24h以上冷冻），细菌检测样品不能冷冻。

2.样品登记时登记信息应尽可能详细，方便检测出问题时溯源。需检测的项目也应尽可能的详细告知，形成书面报告，方便溯源。

3.血样送检时未放置填充物，可能导致样品溶血。寄送时血清未析出就用2个冰袋将血样包裹，会导致血样温度过低冷冻溶血。

4.新鲜组织不加冰袋会导致腐败。固定组织寄送时加冰，会导致细胞收缩，无法观察细胞状态。

5.样品制备：观察组织找到合适的部位，找到目标兵败你位置取样，3个地方，每个地方一分为二，一份检测，一份留样

6.血液样品：采集后，经离心机离心后，取血清，一分为二，血清量少时贴边吸出，对应编号。

7.废弃物及垃圾，经高压蒸汽121℃30分钟消毒过，交给无害化公司，做好记录。

8.实验结束后，对实验桌、操作台等进行清理与消毒。使用酒精及紫外线灯。

9.各样品按各自要求储存存放，出报告15天后可以处理掉。细菌检测的新鲜组织，不进行留样备份。

10.留样的作用：实验有问题时、客户对结果有异议时可以进行复查。

三、禽病检测

1.病毒仅在活细胞内增值。

2.灭活疫苗在体内无法增值，���产生表面蛋白抗体。弱毒疫苗在体内可以增值，产生表面蛋白抗体和非结构蛋白和内部蛋白抗体，

3.血清学检测技术：凝集实验、沉淀实验、中和实验、免疫标记技术。

4.凝集试验原理：颗粒型抗原或可溶性抗原，与相应的抗体结合后，在适量电解质存在的情况下，可以凝结成凝集块。

5.禽流感病毒可凝集红细胞，但有抗体存在的情况下，可与禽流感病毒结合，抑制这种反应，未血凝与血凝抑制实验。

6可溶性抗原与相应抗体结合后，在适量电解质作用下，可形成肉眼可见的沉淀物，为沉淀实.验。

7.病毒抗原与相应中和抗体结合后，使病毒失去吸附细胞的作用，使其失去感染力，称为中和实验

8.使用酶等示踪物，对抗原和抗体标记后，进行反应，借助于荧光显微镜、酶标仪等仪器，检查结果称为免疫标记技术

9.间接ELISA法优点为可用一种酶标二抗检测各种抗原相应的一抗，缺点是交叉反应高，反应本底高

10.竞争ELISA法的优点是特异性好，缺点是线性关系不好，进检测诱食表位抗体。

四、非洲猪瘟核酸检测原理、操作和全流程质控要点

1.科学流程：临床判断---采样---运输---制样---核酸提取---体系配置---核酸扩增---结果分析---解决方案

2.非瘟特点：所有猪都易感，出血热。特急型、急性、亚急性和无明显症状

3.非瘟抗原特点:潜伏期长，直接接触、基因组大、基因型多，I型和II型都多发，变异毒株多，流行范围广。

4.荧光PCR检测原理：核酸是遗传物质，核酸的结构是核酸检测的理论基础。特点是双螺旋结构、半保留复制、碱基互补配对。

5.PCR检测技术：普通PCR（定性）、荧光PCR（相对定量）、数字PCR（绝对定量）。

6.聚合酶链式反应五要素：DNA聚合酶，Buffer（缓冲液），dNTPs引物、模板

7.核酸检测注意事项：人、机、料、法、环、测

8.所有有可能产生气溶胶的都需要使用生物安全柜，不能使用通风橱。房间有正负压通风最佳，没有也可。做实验时，不要开启通风。

9.核酸检测操作五字诀：温、混、纯、准、稳

19.注意事项：分区、压力气流控制、缓冲走廊、缓冲间、传递窗、人流、物流。

五、血清学检测原理、操作和异常问题分析

1.酶联免疫吸附实验，广泛用于检测各种微量蛋白含量。

2.原理：待检物与固相载体表面，发生抗原抗体结合实验，洗板洗去结合物，假如显色剂，即可根据颜色深浅，进行定性或定量的分析。

3.测抗原方法：双抗体夹心法、双位点一步法、竞争法

4.测抗体方法：间接法、双抗原夹心法、竞争法、捕获法

5.试剂盒组成：抗原包被板、样品稀释液、20X浓缩洗涤液、阴性对照、阳性对照、酶标抗体、显色液A液、B液、终止液、封板膜

6.操作：加样---孵育---洗涤---显色---读数

7.病毒的血凝特性：病毒能使红细胞发生凝集的特性称为病毒的血凝特性。本质是病毒通过血凝素纤突与红细胞表面的相应受体发生特异性结合的过程

8.HA实验结果判断：完全凝集：红细胞呈伞状分布于孔底。不完全凝集：介于两者之间。完全不凝集：红细胞呈明显纽扣状孔底。

9.血凝效价：能使红细胞完全发生凝集的病毒的最大稀释倍数称为病毒的血凝价

10.血凝抑制原理：病毒表面的血凝素纤突遇到抗体相结合后，无法与红细胞表面的相应受体结合，所以不发生红细胞凝集反应。

六、药敏实验

1.目的：疫病检测与诊断，指导临床科学用药，防止抗生素乱用。

2.高压灭菌锅121℃ 15-20分钟。含糖多的话116℃。

3.培养基：给细菌生长繁殖的，由不同营养物质组合配置的营养基质，用于细菌的分离鉴定、纯化培养、传代、菌种保存等。

4.琼脂凝固临界温度42℃，固培养基制作完成后可放置50℃水浴锅中。

5.溶血能力：α：2mm、β：4-5mm、γ：无溶血环

6.细菌的分离鉴定：培养基选择---样本处理---平板划线与培养---菌落形态观察---革兰染色镜检---生化鉴定---PCR或测序---结果判定。

7.药敏实验方法：制片扩散法、稀释法、抗生素浓度梯度法、自动化仪器检测。

8.操作流程：抗生素选择---培养基选择及制备---菌悬液制备---平板涂布---贴药敏片与培养---结果观察及判定

9.质控菌株：对培养基、药敏片进行质控、验证操作技术是否合格。

10.组织不得直接做药敏实验。

F. 非洲猪瘟抽血一般抽多少毫升血液

非洲猪瘟抽检比例一般都是1:20，嗯，这个比例应该还是算可以的。
非洲猪瘟现场采样规程采样所需材料清单 一般材料⑴ 标签和记号笔; ⑵ 数据记录表、笔、写字板; ⑶ 盛放针头和刀片的锐器盒; ⑷ 高压灭菌袋; ⑸ 用于环境采样的拭子和盛放拭子

G. 非洲猪瘟检测曲线怎么看

非洲猪瘟简称ASFV，很多人尤其是养猪专业户提起非洲猪瘟就脸色大变，非洲猪瘟发病快、发病急、传染快，非洲猪瘟会导致养殖户钱财损失，非洲猪瘟是一种动物疫病，我们可以利用非洲猪瘟检测仪来检测，提前做好防范预防措施。非洲猪瘟检测仪是用于运行病毒检测实验，并对实验数据进行分析；仪器既可在实验室内操作，又可用于野外科学实验，配合相应试剂，对取自待检测样本的分析物或其他分析物中的目标核酸进行快速、准确的定性检测。

非洲猪瘟检测

免疫电泳试验抗原于待检血清间出现白色沉淀线者为阳性直接免疫荧光试验：在荧光显微镜下观察细胞，若细胞浆内有明亮的荧光团，则为阳性。间接酶联免疫蚀斑试验：直接用肉眼观察蚀斑，若颜色为棕色，则表示为阳性酶联免疫吸附试验：对照成立后，若待检样品的吸收值大于0.3，则可以判定为阳性。

H. DG55155Tl设置方法

团体标准T/CVMA 5—2018
非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法
Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus
中国兽医协会发布
前言
本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国兽医协会提出并归口。
本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。
本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。
1、范围
本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。
本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。
2、规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3、试剂
3.1 DNA提取试剂
DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。
3.2 2 × PCR缓冲液
2 × PCR缓冲液的配制见附录A。
3.3 引物探针
3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：
上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'
下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'
荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB--3'
3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：
上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'
下游引物ASF-OIE-rPCRR：
5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'
荧光探针ASF-OIE-Probe：
5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'
3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。
3.4 阴性及阳性对照
阴性及阳性对照的制备方法见附录C。
3.5 其他试剂
消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。
消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。
4、仪器和耗材
分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。
5、操作步骤
5.1 样品采集及运输
样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。
5.2 样品处理
检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。
5.3 样品保存
采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。
5.4 病毒DNA提取
5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。
5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。
5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。
5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。
5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。
5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。
5.5 实时荧光PCR操作
5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。
5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。
5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。
5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。
6、结果判定
6.1 结果分析条件设定
实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。
6.2 结果描述及判定
当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。
7、实验室生物安全要求
7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。
7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。
一
附录 A (规范性附录) 试剂的配制
A.1 DNA提取液1
PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。
A.2 DNA提取液2
1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。
即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。
A.3 2×PCR缓冲液
灭菌去离子水 70 mL
三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g
氯化钾 1.865 g
曲拉通X-100 0.5 mL
dATP (100mmol/L) 2.5 mL
dTTP (100mmol/L) 2.5 mL
dGTP (100mmol/L) 2.5 mL
dCTP (100mmol/L) 2.5 mL
六水氯化镁 0.61 g
盐酸 调pH至9.0
灭菌去离子水 加至100 mL
A.4 消毒液
8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。
A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方
A.5.1 A液
0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。
A.5.2 B液
0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。
A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制
取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。
A.6 无DNA酶的灭菌去离子水
无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。
二
附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列
1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA
61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT
121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT
181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT
241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT
301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT
361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC
421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT
481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC
541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA
601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA
661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT
721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT
781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT
841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC
901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT
961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC
1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG
1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT
1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA
1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC
1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA
1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA
1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT
1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC
1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA
1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT
1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT
1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG
1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA
1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG
1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT
三
附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照
C.1阳性对照
阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。
C.2 阴性对照
阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。
四
附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方
实时荧光PCR反应液配方见表D.1。
表D.1 实时荧光PCR反应液配方
组 分
1个检测体系的加入量
2×PCR 缓冲液a
12.5μL
dNTP（2.5 mmol/L）
1.0 μL
上游引物（10 μmol/L）
1.0 μL
下游引物（10 μmol/L）
1.0μL
探针（10 μmol/L）
1.0 μL
Taq 酶b（5U/μL）
0.5μL
去离子水
3μL
总体积
20μL
2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。
Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。
五
附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考
图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。
图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图
(资料来源：中国兽医协会）

I. 猪场怀疑发生非洲猪瘟有什么好的措施

怀疑是非洲猪瘟首先通过检测确诊，可以采取疑似病猪的唾液、鼻拭子，血样建议采尾根血送检。有条件的养殖场可以建立自己的实验室，采购肇庆大华农生物药品有限公司的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒，有专业的人士指点及培训。如果对我的回答满意的话，请采纳

J. 非洲猪瘟检测为什么不给检测单

首先，这本来属于外来病，传入国内，为了防止蔓延，控制疫病，检测抗原，是为了净化和消灭该病。

另外，这类病属于烈性病，抗体产生需要周期，相对而言，在疾病早期抗原检测优于抗体检测。
鼻腔拭子—对比耳尖血拭子可提前3-21天发现，为拔牙提供窗口期，但病毒载量较少，有时检测不出来

耳尖血拭子—病毒载量大，发病后比较容易检出，相对准确

保准确方案：选取几头猪鼻腔拭子+耳尖血拭子双采，提升准确度+提早发现

省钱方案：只采血拭子，发现较晚

环境试子—不做猪场环境非洲猪瘟病毒（ASFV）检测，复养就是赌博。

一、鼻试子采样

（一）、准备材料：

泡沫箱、冰袋，用于保存样本送检；棉签，用于采集唾液样本；封口袋，辅助保存棉签采集的鼻拭子样本；一次性手套；记号笔：用于样本编号。

（二）、鼻拭子采样方法：

医用棉签用生理盐水打湿，插入猪鼻腔3—5cm，转3圈。采样时，注意戴一次性手套，每采一头猪新更换一次手套，同时进入不同的栋舍要及时更换水鞋和衣服，防止交叉感染。每个棉签放入单独自封袋或者输精瓶中密封，在输精管上记上标号（数字）并记录每个输精管对应的猪，以便将检测结果与猪一一对应。

（三）、采样范围：

发病场:（已经发病有症状或复养场）发病猪每圈选1-2头或发病猪30%取样。

发病栋舍内其余疑似健康猪（没有症状）每圈选取1头或30%取样。其余舍门口风口选2-3头

疑似场：（周围有疫情压力，本猪场没有任何症状），每舍门口、风口位置选2-3圈，每圈2头或10-20%取样。

阴性场：（周围没有疫情压力，本场猪没有任何症状），每舍门口、风口位置选2-3圈，每圈1头或6-10%取样。