实验室分光度计使用步骤方法

‘壹’ 怎样用分光光度计测定菌体浓度详细一点，回答好的追加20分

风光光度计不同的话，使用方法也不同
首先，你需要一个对照，就是你培养菌液时所用的干净的培养
然后，将菌液和培养基分别放到两个比色皿中，一般的比色皿是3mL的
将对照的比色皿放到第一个样品池中，其余的比色皿按顺序放好
最后，就是调节分光光度计，就跟电脑操作差不多，先设定波长，然后对对照进行校对归0，然后就可以测量其它的样品，有的分光光度计是需要用手拉样品池，通过外面的那个好像叫做栏珊，有的是自动的。
差不多就这样，如果你想问分光光度计怎么用的话，实验室里应该有说明书，而且那上面的按钮就跟电脑上差不多，不难！

‘贰’ 紫外可见分光光度计可以测量哪些物质求详细步骤

能测得很多，甚至有本很经典的着作，就是专门讲分光光度计的原理和应用的，这本书里可以查到目前几乎所有能用分光光度计来测量的物质的测量方法和工作波长。
分光光度计是实验室的基础仪器，测定的方法和原理本身很简单。就是说化学物质对波，也就是光有一定的吸收，并且对不同波长的波的吸收程度不同。一般情况下会对某个特定波长（或者波长范围）的吸收达到峰值，那么对该物质的测定就在该波长下进行，因为这个时候吸光敏感，测量的灵敏度高。光波被吸收的量与物质浓度成正比，那么就可以根据光波被吸收的量计算出被测物浓度。
知道原理后，测定的方法就是对某种被测物进行适当的前处理，把该物质中的某代表元素转化为能够用分光光度法测定的形态，然后选择适当的波长（可以查标准方法，也可以自己扫描工作波长）进行测定。一般是要自己先用标准序列做出标准曲线或者工作曲线，明确吸光度与浓度的比例关系，然后再测定样品。根据不同的前处理及其他情况，注意选择合适的参比。

‘叁’ 谁能告诉我怎么用分光光度计测活性炭的亚甲基蓝值亚蓝溶液配好了，活性炭搅拌吸附也做好了，怎么测

这个标准的叙述是有点令人费解，关键之处没有说的很清楚（也许还有上下文，你没全部打出来）。

用滴定管加入适量的亚甲基蓝试验液，所谓适量，你开始时是不知道的（你做的多了，以后就心中有数了）。需要多次试验，越来越接近所谓的适量。假定这样最终得到的试液与硫酸铜标准滤色液的吸光度相同，则你最后一次试验中所加入的亚甲蓝试验液的消耗量就是吸附值。

标准硫酸铜在这里就起着一个标准色度的作用（其实也可以用相同吸光度的亚甲蓝标准溶液代替，但亚甲蓝试剂本身纯度不象硫酸铜那么高，并且不够稳定，容易发生氧化而变色，作为标准色度溶液不合适，每次需要新配）。亚甲基蓝吸附值就是用这个标准确定的。

当活性炭量一定的时候，并且它的吸附值一定的时候，它对亚甲蓝的吸附量是一定的，你加入的亚甲蓝越少，吸附后残留亚甲蓝的浓度越低，颜色越淡。如果它产生的吸光度比标准硫酸铜低的话，说明你加的亚甲蓝还不够，到了相同吸光度到时候，说明你加的正好。反过来说，要使残留液的吸光度和标准硫酸铜相同的话，对于某个0.100g活性炭样品，你加的亚甲蓝越多，就说明这个样品的吸附能力越强（吸附值越高）。

你用的应是较老式的分光光度计，调零（不透光）只要把样品室舱门打开（此时光路不通光电管不接受光）就可以了。调满度（全透光）样品室中放入装有蒸馏水的相同比色皿时进行。

还有一点补充一下，第一次做的时候，你对什么叫适量一无所知，你随便加一定量例如20ml，按照方法操作后得到样品液，去测一下它的吸光度，和标准硫酸铜比较一下，如果低了，下次就多加点亚甲蓝，低得多就加的多。如果高了，下次就减半。还高再减半，如此下去有个3-4次就心中有数了。

为什么我配的亚甲基蓝标准溶液（未经活性炭吸附的）上了分光光度计就超过满度了？

怎么可能超满度？你讲的满度是吸光度A，还是透光率T，如果前面调好的话，两个都不可能超满度。除非仪器坏了，仪器坏了，调满度T，根本调不了。另外这个原溶液是不测定的，测定的是经过吸附脱色的样品液，以及硫酸铜标准液。

如仍有不明，请追问。

‘肆’ 紫外可见分光光度计的用法

752紫外可见分光光度计
仪器的工作原理
分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光的

吸收效应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的

吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减

弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理—一比耳定律。
τ=I/Io
log I/Io=KCL
A= KCL
从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光径长度不变时．透过
的光是根据溶液的浓度而变化的，752紫外可见分光光度计的基本原理是根
据上述物理光学现象而设计的。
仪器的安装、使用
安装

1 仪器在安装使用前应对仪器的安全性进行检查，电源电压是否正常，接

地线是否牢固可靠，在得到确认后方和接通电源使用。

2 仪器经过运输和搬运等原因，会影响波长准确度，应进行仪器调校后使用。

使用：仪器使用前需开机预热30min。

本仪器键盘共有4个键，分别为； 1 A /τ/C/F

1SD

2 ▽／0％

3∆／100％

4 A /τ/C/F键：每按此键来切换A、τ 、C、F之间的值。

A——吸光度（Absorbance）

T——透射比（Trans）

C——浓度（conc）

F——斜率（Factor）

(2)F值 通过按键输入（后面介绍如何设置）

5SD键：该键具有2个功能

a)用于RS232串行口和计算机传输数据（单向传输数据，仪器发向计算

机）。

b)当处于F状态时，具有确认的功能，即确认当前的F值，并自动转到C，

计算当前的C值（C=F*A）。

6 ▽／0％键：该键具有2个功能

a）调零；只有在τ状态时有效，打开样品室盖，按键后应显示0.000。

b）下降键：只有在F状态时有效，按本键F值会自动减1，如果按住本

键不放，目动减1会加快速度；如果F值为0后，再按键它会自动变为1999。

而按键开始自动减1。

7 ∆／100％键；该键具有2个功能

a）只有在A、τ状态时有效，关闭样品室盖，按键后应显示0.000、100.0。

b）上升键：只有在F状态时有效，按本键F值会自动加1，如果按住本

键不放，自动加1会加快速度，如果F值为1999后，再按键它会自动

变为0，再往键开始自动加l。

例如：设置斜率为1500。

方法一

T）按 A／τ／C／F键切换到 F状态。

b）如果当前F值为1000，则按∆／100%键，直到F值为1500。

C）再按 SD键，表示当前的 F值为 1500，然后自动回到 C状态，假如所

测的 A值为 0．234，则此时显示 C值为 0351。

方法二

a）按A／τ／C／F键切换到F状态。

b）如果当前的 F值为 1000，则按∆／100%键，直到F值为 1500、再按 A／τ／C／F键切换到C状态，假如所测的A值为0.224，则此时显示C值为0351。

‘伍’ 分光光度计如何测量样品急急急急急急

分光光度计要测量的样品必须是均一的溶液，不能有沉淀，如果有沉淀的话就要摇匀。之于为什么这样做和可以做哪些测量、如何测量，下面详述:
分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。
而分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。 常用的波长范围为：(1)200～400nm的紫外光区,(2)400～760nm的可见光区,(3)2.5～25μm（按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>）的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。 单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式： 1 A=log — =ECL T 式中 A 为吸收度； T 为透光率； E 为吸收系数，采用的表示方法是(E1％ 1cm),即吸收度换算成溶液浓度为1％(g/ml)，液层厚度为1cm的数值； C 为100ml溶液中所含被测物质的重量，g(按干燥品或无水物计算）； L 为液层厚度 ，cm。 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
分光光度计的简单原理
分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。
蛋白质的直接定量（UV法）
这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller等测试人奶中的蛋白，结果Lowry，BCA 测出的浓度明显高于Bradford，差异显着。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA作标准品，浓度1.34mg/ml，以a球蛋白作标准品，浓度2.64mg/ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后1011分光光度计的重要配件—— 比色杯的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。
细菌细胞密度（OD 600）
实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。
分光光度计的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。
由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。
随着科技的发展，现在比色杯已经不是使用分光光度计时的必备物品。目前国外Nanodrop公司（现已被Thermo Fisher公司收购）生产的ND1000分光光度计与旧式分光光度计相比，已经可以做到无需稀释样品，无需使用比色杯，每次测量仅需1-2μl样品即可完成测量。

‘陆’ 分光光度计的原理是什么

在分光光度计中,将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时,便可得到与众不同波长相对应的吸收强度.如以波长(λ)为横坐标,吸收强度(A)为纵坐标,就可绘出该物质的吸收光谱曲线.利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法,称为分光光度法,也称为吸收光谱法.用紫外光源测定无色物质的方法,称为紫外分光光度法;用可见光光源测定有色物质的方法,称为可见光光度法.它们与比色法一样,都以Beer-Lambert定律为基础.
近年来,紫外及可见光分光光度分析已得到广泛的应用,它不仅可以用于物质的鉴定及结构分析,而且还可以用于某些物质含量的测定.
分光光谱技术可用于:
通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成.
通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或与其他物质混合存在的一种物质的含量.
通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系,追踪反应过程.
一、紫外及可见光分光光度法这是一种只在可见光及紫外光光谱应用范围内测量物质吸收辐射线的技术,应用十分广泛.其中分光光度计可用于精确测量特定波长的吸收值,而比色计则是一种较简单的测量仪器,其原理是利用虑光片来测量较宽波段(如可见光中的绿光、红光或蓝光范围)的吸收值.
光吸收法则:
溶液对光的吸收有两个基本法则:
透过溶液的光的吸收值同吸收溶质的分子数目(即溶质浓度[C])呈指数相关.
透过溶液的光的吸收值同透过吸收溶液的路径长度l成指数相关.
这两条法则包括在比尔-朗伯关系式中.通常以入射光(Io)和出射光(I)的光密度来表示:
ε其中ε对于吸收物质及波长是一个常数,称为吸光系数或吸收系数,[C]的单位为mol/L或g/L,l的单位为ml.这一公式非常有用,因为大多数分光光度计设计为直接测量log10(Io/I)的值(A)或消光值(E)(旧教材中可能使用以废除的术语:光密度).对于遵循比尔-朗伯关系的物质,A与C呈线性关系.吸收值常用下标表示其波长,如A550表示550nm处的吸收值.透过溶液的光的比例称为透光率(T),可由出射光和入射光的比值求得.
吸收值(A)(absorbance)--由公式得出:
透光率(T)(transmittance)--通常以百分数表示:T=(I/Io)×(一)比色计比色计用于测定颜色明显,并且是溶液主要组分的待测物,如血液中的血红细胞,也可以在待测物之中加入一种试剂,使其形成有色产物(一种生色团),如用茚三酮法测定氨基酸含量.定量分析某种物质要做标准曲线,标准曲线是在测定待测样品的同时测定已知含量的物质来制成的,而不是使用比尔-朗伯关系.
光源通常为钨丝灯泡,通过一个凸透镜聚焦后产生一束平行光,平行光穿过装有溶液的玻璃样品或小池,然后透过一个有色滤光片到达光电管检测仪,检测仪产生一个同落在光电管上的光密度成正比的电势,来自于光电管的信号被放大然后传递到电流计或数字读数器.
比色计的使用:
①接通电源使仪器稳定,使用前至少要让灯预热5min;② 选择一种同底物颜色互补的滤光器;③调零(用空白对照调零);④调整灵敏度;⑤分析样品及标准溶液;⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同,因此为了提高精确度,同一试验应用同一比色杯,且在比色槽中摆放的方位相同;⑦每次测样前清洗比色杯;⑧经常重复测定同一溶液检验比色计的可重复性;⑨用标准溶液绘制标准曲线.
由于大多数过滤器过滤出来的光的波带很宽,因而比色计既不能用于确定某种复合物,也无法分辨在混合液中吸收特性非常相近的两种物质.比色计所用光电管的变化系数为0.5%左右,因而不适合要求具有高度精确性的工作.使用这种最简单的仪器,由于仪表上对数测量刻度单位的随意性,即使是把表上的灵敏度/刻度调节到零控点,在一个仪器上获得的值不可直接同另一台仪器上测得的值相比较,同一仪器的不同设置之间也不可直接比较.比色计对于特定波长的量化工作是不合适的.
(二)紫外光/可见光分光光度计紫外光/可见光分光光度计基本装置中采用高强度的钨灯作为光源,能够在可见光范围(400~700nm)调节.氘灯用于紫外分光光度测量(200~400nm);使用氘灯时要用石英杯,因为紫外线不能透过玻璃.
分光光度计之所以优于比色计就在于使用了一个衍射光栅将光源的复色光转换为单色平行光束.实际上从这种单色一种产生的光不是某个波长的光,而是一段窄的带宽上的光,带宽是分光光度计的一个重要特性,这是由于它决定了吸收测量中所用的波长--普通分光光度计的带宽为5~10nm,用于研究的仪器的带宽小于因为光栅夹缝的宽度影响着带宽,带宽随光栅夹缝的宽度的减少而降低,要获得特定波长下的精确数据,尽可能使用最小的缝宽度.然而,减少了缝宽也会减少到达监测器的光度,降低了信/噪比.缝宽可减少的程度取决于检测/放大系统的灵敏度及稳定性于离散光的存在.
大多数UV/可见光分光光度计使用的比色杯的光穿过路径为10nm.一次性塑料杯适合于对水和乙醇溶液在可见光范围内的测量.玻璃比色杯的生产要求更加严格的标准,因而在精确研究中要使用玻璃比色杯,尤其当溶液的吸收值很低时(<0.1),即使盛对照液与待测样品液的比色杯在光学性质上有稍许不同,也会导致结果偏差.玻璃和塑料会吸收UV光,因此在测波长小于300nm的吸收值时要使用石英杯.
进行测量之前,比色杯要保证干净,无划痕,外表面干燥,盛液到适当高度,并放在了比色槽中的正确位置.生物样品中蛋白质和核酸可能会在玻璃/石英杯的内表面沉积,因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯内的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡过夜.腐蚀性及毒性溶液必须使用有盖子的比色杯,以防止溅出,破坏仪器.
基本分光光度计使用的光电管类似于比色计中所使用的光电管.许多情况下,当波长高于和低于550~600nm时必须使用不同的光电管,这是因为它们在可见光波长内的灵敏度不同,更精彩的仪器中所使用的是具有比光电管更高的灵敏度和稳定性的检测器.数字显示由于不易产生视觉错误和误读范围的错误,正逐渐代替指针读数.一些仪器可以直接给出所测定物质的浓度.
.紫外光/可见光分光光度计的类型:
基本分光光度计只产生单束光.这种仪器首先用空白对照调到零吸收值,然后取出空白液,加入待测液,测定待测液的吸收值.也有一种双束分光光度计,有单色光源产生的光束被分为两束,一束穿过待测液,另一束穿过空白液.吸收值由一个电子线路通过对比透过待测液及空白液的出射光进行测定.双光束分光光度计减少了由于光源输出的不稳定或检测系统灵敏度的变化而导致的测量错误,这时由于待测液与对照液是同时进行测量的.记录式分光光度计是一种双束测定仪,用于记录已知波段下吸收值随时间的变化(如用于酶分析).
.分光光度计的定量分析:
假如已知一种物质在某一波长下的吸光率(通常是该物质的最大吸收值,这时灵敏度最高),这种物质纯溶液的浓度可用比尔-朗伯关系式算出.摩尔吸光系数是指物质在1mol/L的浓度下,比色杯厚度为1cm时的吸收值.该值可以从光谱数据表中查到,也可以用实验方法通过测量一系列已知浓度的物质的吸收值来绘制一条标准曲线.这样,在所要求的浓度范围内,便可确定吸收值与浓度之间存在的线性关系,该直线的斜率即为摩尔吸光系数.
比吸光率是指物质质量溶液浓度为10g/L时,比色杯厚度为1cm时测定的吸光值.该值对于未知分子质量的物质如蛋白质核酸的测定很有用,这种情况下溶液中物质的含量以其质量表示而不用摩尔浓度表示.使用公式Log10(Io/I)=εl[C]时,比吸光率要除以10才可以得到一个以g/L为单位的浓度值.
这种简单的方法不能用于测定混合样品.在这种情况下,也许可以通过测量几个波长下的吸光度来估算每种成分的含量,如可用此方法在核酸存在下进行蛋白质含量的估算.
分光光度计的使用方法:
(1)接通电源;(2)使用前预热15min;(3)选择波长;(4)选择检测器;(5)如果可能的话,选择正确的缝宽;(6)插入适当的空白对照;(7)调解到0%的透过率;(8)将吸光值调到零;(9)分析样品;(10)每测量10个样品后,用空白对照校验零刻度;(11)检测仪器的可重复性.

‘柒’ 求紫外分光光度计的校正步骤

紫外分光光度计的校正方法：分光光度法的最重要的一个物理化学量是吸光度。为了获得准确的研究结果，准确测得样品溶液的吸光度是非常重要的。一般，分析结果的不可靠性与偶然误差和系统误差有关。

偶然误差影响测量的精密度，可通过足够数量测量的统计处理来减少;系统误差影响测量结果的准确度，可在大体相同实验条件下，用比较一种物质的准确测量结果，使系统误差统一起来。

而分光光度计的系统误差(波长校正、分光光度计的慢散光、放大器的线性响应、暗电流和比色皿的光程)和操作误差(温度改变、仪器读数、操作者的改变、使用物质的纯度、称量和浓度、pH)对测量吸光度的影响是可以检查和校正的。

关于操作误差，多数情况下，通过严格按操作程序测量、仪器调零、准确称量等来控制或减少这种误差的产生。关于仪器的系统误差，可通过对分光光度计的定期校正来克服，若所需准确度很高的测量，则必须天天校正。

(7)实验室分光度计使用步骤方法扩展阅读

紫外分光光度计主要应用

1、鉴定物质

根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长λmax和摩尔吸收系数ε是检定物质的常用物理参数。这在药物分析上就有着很广泛的应用。在国内外的药典中，已将众多的药物紫外吸收光谱的最大吸收波长和吸收系数载入其中，为药物分析提供了很好的手段。

2、与标准物及标准图谱对照

将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标 准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。

3、比较最大吸收波长吸收系数的一致性

4、纯度检验

5、推测化合物的分子结构

6、氢键强度的测定

实验证明，不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同，这可以利用紫外光谱来判断化合物在不 同溶剂中氢键强度，以确定选择哪一种溶剂 。