组织培养的步骤和方法

1. 简述植物组织培养的步骤

植物组织培养方法 1 MS培养基的配制包括以下步骤。
培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL），加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。
大量元素(母液Ⅰ) mg／L
NH4NO3 33 000
KNO3 38 000
CaCl2·2H2O 8 800
MgSO4·7H2O 7 400
KH2PO4 3 400
微量元素(母液Ⅱ)
KI 166
H3BO3 1 240
MnSO4·4H2O 4 460
ZnSO4·7H2O 1 720
Na2MoO4·2H2O 50
CuSO4·5H2O 5
CoCl2·6H2O 5
铁盐(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O 5 560
Na2-EDTA·2H2O 7 460
有机成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇 20 000
ⅣB
烟酸 100
盐酸吡哆醇(维生素B6) 100
盐酸硫胺素(维生素B1) 100
甘氨酸 400
以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。
上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。
各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、6-苄基嘌呤（6BA）等植物生长调节物质，并且分别配成母液（0.1 mg/mL）。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量（1 mL）无水乙醇预溶，将6BA用少量（1 mL）的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。
配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。
配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。
调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.4～7.0）测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8）。
2 BA为细胞分裂素 NAA 是萘乙酸，为生长素的一种
3 适于百合根的激素暂时没找到
以下是叶片和胚的激素：对麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)叶片进行离体培养 ,可成功获得无菌苗。试验结果表明 :培养基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L适于初代培养 ,有助于根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L适于增殖培养 ,利于愈伤组织的产生 ,并促进芽的分化 ;生根培养基为 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;当试管苗根长 1cm时移栽易成活
在含有1 mg/ L IAA,1 m g/ L GA3,6 0 0 m g/ L CH的 MS培养基上培养 ,蔗糖含量为 6 %～ 8%时 ,百合幼胚胚性生长最好 ,培养 30 d后可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA,1 m g/ L BA的 MS培养基上可以形成淡绿色的愈伤组织 ,将这些愈伤组织转移到 1 / 2 MS无激素的培养基上培养可以形成大量的不定芽 ,不定芽生根移栽后 ,其成活率可达90 %以上

2. 植物组织培养的步骤有哪些

准备无菌培养基，培养基里要有无机盐，水，糖类，生长素，细胞分裂素，95%的氧气和5%的二氧化碳
1.把植物的茎尖细胞放到培养基里
2经过脱分化到再分化，到再分化时就要放到阳光充足处，然后就让这棵小树苗沐浴在杰科的阳光下慢慢成长了。
唉~~~~甘都唔记得。。。。。。。。。。。。。

3. 组织培养的一般过程是怎样的

植物细胞组织培养
一．实验目的
植物细胞和组织培养的技术性强,要求无菌操作,通过本实验可初步掌握常规的组织培养技术,加深对无菌操作的了解.
二．实验原理
植物的全能性：植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力,称为植物的全能性.
植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术.植物组织培养按其原始意义,就是指愈伤组织培养.但发展至今,其范围日益扩大,已包括植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养.因此,拥有几种不同水平的培养技术,即整体的、器官的、组织的、细胞的和原生质的培养技术.它们的涵义是：
1．植株培养.指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）外植体的无菌培养.
2． 胚胎培养.指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养.
3． 器官培养.指以植物的根,茎,叶,花,果等器官为外植体的离体无菌培养,如根的根尖和切段,茎的茎尖,茎节和切段,叶的叶原基,叶片,叶柄,叶鞘和子叶,花器的花瓣,雄蕊（花药,花丝）,胚珠,子房,果实等的离体无菌培养.
4． 组织培养.指以分离出植物各部位的组织（如分生组织,形成层,木质部,韧皮部,表皮,皮层,胚乳组织,薄壁组织,髓部等）,或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养.这是狭义的组织培养.
5． 细胞培养.指以单个的游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞,或花粉细胞,卵细胞）为接种体的离体无菌培养.
6． 原生质体培养.指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养.
本实验选择烟草和豌豆为材料,烟草（Nicotiana）属茄科植物,是重要的工业原料,也是植物组织培养的四大典型实验植物（烟草、矮牵牛、胡萝卜、芸苔）中重要的一种,它的研究的最为广泛,也始终领先于其他的植物材料,目前,66个烟草品种中,再生成植株的有16个种,通过花药培养再生成花粉植株的有12个种,通过原生质体培养再生成植株的有20个种,通过烟草的种内和种间原生质体融合再生成杂种的植物分别为3个和12个种.豌豆（Pisum sativum）属豆科植物,是粮食、饲料和重要的蔬菜作物,也是遗传学家和植物生理学家感兴趣和乐于采用的实验植物,豌豆的根、茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植体,皆可形成愈伤组织,其中茎尖、幼胚、幼叶等器官可成功的再生成植株.茎尖培养可包括小至十几微米的茎尖分生组织（生长点）和大至几十毫米的茎尖或更大的芽培养.在实践应用上,常采用生长点的培养使患病植物去病毒,以达到挽救优良品种,提高产量和质量之目的.
三．实验材料
仪器设备
1．酒精灯、100ml三角烧瓶,9厘米培养皿；
2．镊子、剪刀、解剖针；
3．双筒解剖显微镜；
4．光照培养箱或温室；
材料和试剂
1．材料 烟草无菌苗、豌豆幼苗.
2．试剂
（1）MS培养基,植物激素：NAA、6-BA等；
（2）饱和漂白粉液（次氯酸钠）；
（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；
（4）无菌水
四．实验步骤
1．烟草无菌苗的快速切繁—继代培养：（要求完全无菌操作）
每组一瓶烟草无菌苗,请细心操作,以免污染.
（1） 在实验台上,点着酒精灯,将双手用酒精棉球擦拭消毒,打开生长好无菌烟草苗的三角瓶,三角瓶的瓶口使用前后需在酒精灯外焰上烧过灭菌.
（2） 用灭菌的镊子轻轻捏出1株幼苗,用灭菌的剪刀将无菌苗剪成0.5-1厘米的小段,要求每段至少包含一个生长点,直接剪入盛有MS培养基的三角瓶中,每一个切段必须直接接触培养基,三角瓶口重新烧过灭菌,并重新封好口.
（3） 在光照培养箱中15~25℃,16小时光照条件下培养4周,可长成完整植株,能用于田间移栽.
2．豌豆苗的茎尖培养
⑴ 取发芽6天的豌豆幼苗10株,简取1厘米左右的茎尖,浸入70%的酒精中1分钟,再浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒15分钟,（此步以后要求无菌）用无菌水中冲洗5次,在灭菌的滤纸上吸干水分,放入灭菌的培养皿中.
⑵ 在双目解剖镜下,用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长锥,用灭菌的解剖针挑取带着两至三个叶原基的生长锥.
⑶ 将挑好的茎尖移到MS+10.7μmol/L萘乙酸(NAA)+4.4μmol/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）的培养基上诱导愈伤组织形成,用封口膜将培养皿封好.
[4]在恒温培养箱中,26℃下,培养六周,形成愈伤组织,经继代后,可用于生根培养.
第46批a7 2014-12-06

4. 组织培养的具体方法是什么

一、培养基配制 配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。 自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。 1．配制几种母液 1．配制MS大量元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 2．配制MS微量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。 3．配制MS有机母液 一般配制成100倍MS有机母液。 依次称取 肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g 烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 4．配制MS铁盐母液 一般配制成100倍MS铁盐母液。 依次称取 EDTA二钠3.73g FeSO4·7H2O2.78g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。 激素母液的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。 2．配制培养基 以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作： 1．先在烧杯中放入一些蒸馏水。 2．分别取上面八种母液10ml倒入。 3．一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。 4．加蒸馏水用量筒定溶至1L。 5．按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。 6．用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。 1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。 7．称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。 8．稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。 9．放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。 10．灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。 二、灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。 灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1．培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。 按容器大小不同，保压时间有所不同，见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。

5. 组织培养怎么做，求步骤，求方法

要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方
面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取
材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消
毒作用，这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒

从外界或室内选取的植物材料，
都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带人培养基，
便会造成
培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。

第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材
料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料
清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加
入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的
物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质
—
吐温。

第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、
70%
酒
精、消毒液、无菌水、手表等。用
70%
酒精浸
10
～
30s
。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，
加之
70%
酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花
蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用
70%
酒精处
理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。

第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取
1
—
2
种使用见表。第四步是用无菌
水涮洗，涮洗要每次
3min
左右，视采用的消毒液种类，涮洗
3-l0
次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂
杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精
杀死植物细胞。②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡
5
分钟。③升
汞的渗透力弱，一般浸泡
10
分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿，所
以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为
0.08
—
0.12%
的吐温
20
或
80
（一种湿润剂），可以
降低植物材料表面的张力，
达到更好的消毒效果。
灭菌剂

使用浓度
(%)
持续时间
（
min
）

去除的难易

效
果

次氯酸钙

9~10 5~30
易

很好

次氯酸钠

2 5~30
易

很好

氯化汞

0.1~1 5~8
较难

最好

抗菌素

4~50mg/L 30~60
中

较好

制备外植体

将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，
叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手触动材料。

接种和培养

（一）接种

在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种
1
－
2
个，以防止交叉污染。（二）封口

接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。

（三）温度

培养基大多应保持在
25
℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。

增殖

外植体的增殖是组培的关键阶段，
在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，
需要继代培养。
把材料分株或切
段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖
1
个月左右
后，可视情况进行再增殖。

根的诱导

继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，
必须转到生根培养基上进行生根培养。
1
个月后即可获得
键壮根系。

组培苗的炼苗移栽

试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，
先将培养容器打开，于室内自然光照下放
3
天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再
栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度
（相对湿度
98
％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。

组织培养中的清洗、消毒灭菌技术

日期：
2010
年
4
月
1
日

来源：互联网

作者：植物组培网

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1
、
清洗

植物组织培养用的各种玻璃器皿，
特别是培养瓶和盛培养基的器皿，
一定要严格清洗，
以防油污、
重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗，先将污
物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采
用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌
体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定
的地方，便于取用。

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热
(
烘烧和灼烧
)
、湿热
(
常压或高压蒸
煮
)
、射线处理
(
紫外线、超声波、微波
)
、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲
醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要
根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的
24h
内完成灭菌工序。高
压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅
内温度也随之增加。在
o
．
1MPa
的压力下，锅内温度达
121
℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细
菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有
几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，
通电后，待压力上升到
O
．
05MPa
时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三
次放气后，关阀再通电，压力表上升达
0
．
1-0
．
15Mpa
时，维持
15-20min
。
•
对高压灭菌后不变质的
物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，
既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验
服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌
20-30min
。高压灭菌前后的培
养基，其
pH
值下降
0.2-0.3
单位。高压后培养基
pH
值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌
前用碱调高
pH
值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭
菌后的
pH
值变化幅度较大，甚至可大于
2
个
pH
值单位。环境
pH
值的变化大于
0.5
单位就有可能产生
明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，
从而改变培养基的渗透压。
在
8%-20%
蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高
0
．
43
倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使
15%-25%
的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于
5.5
，其水解量更多，培养基中添加
0.1%
活性炭
时，高压下蔗糖水解大大增强，添加
1%
活性炭，蔗糖水解率可达
5%
。

灼烧灭菌（用于无菌操作的器械

）
•
在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入
95%
的酒精中，使
用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用
250
或
500ml
的广口瓶，放入
95%
的酒精，以便插入工具。

干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到
160-180~C
的温度来杀死微生物。由
于在干热条件下，
细菌的营养细胞的抗热性大为提高，
接近芽抱的抗热水平，
通常采用
170
℃持续
90min
来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用
耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免
妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭
菌能源消耗太大，浪费时间。

过滤灭菌（不耐热的物质

）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，
不能用高压灭菌处理，
通常采用过滤灭菌方法。
可用无菌的孔径
0.20-0.45um
的硝酸纤维素膜过滤菌类，
当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，
常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过
滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。

紫外线和熏蒸灭菌（空间）
•(1)
紫外线灭菌

在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭
菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成
死亡。紫外线的波长为
200
—
300nm
，其中以
260nm
的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的
能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过
1.2m
为宜。

(2)
熏蒸灭菌

用加热焚烧、
氧化等方法，
使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，
以杀死空气和物体表
面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭
紧密，按
5
—
8ml
／
m3
用量，将甲醛置于广口容器中，加
5g/m3
高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预
先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多，它们使微生物
的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。
一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所
以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和
酒精例外

6. 组织培养的方法和程序有哪些

1.外植体的建立

（1）外植体的选取 组织培养的外植体，一般分为两类：一类是带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，在组织培养过程中可直接诱导促进丛生芽的大量产生，其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易于保持材料的优良性状。另一类主要为根、叶等营养器官及花药、花瓣、花托、胚珠、果实等生殖器官。这类外植体大都需要一个脱分化过程，经过愈伤组织阶段再分化出芽或产生胚状体然后形成再生植株。

在快速繁殖上，最常用的外植体是茎尖。通常切块在0.5厘米左右，太小，产生愈伤组织的能力较弱；太大，则在培养器皿中占空间太多。如果为培养无病毒苗而采用的外植体，通常仅取茎尖分生组织部分，其长度常在0.1毫米以下。

（2）外植体的消毒 由于外植体大都采用外界生长的植株，常带有各种微生物，如带入培养基，会迅速繁殖而形成污染，导致培养工作的失败。因此，外植体消毒是必不可少的工作，消毒既要杀灭外植体上的病菌，又不能伤害材料而影响其生长。由于材料不同，栽培条件、季节等不同，不同外植体消毒应选用各自合适的消毒剂种类、消毒剂浓度、消毒时间及处理程序。

理想的消毒剂应有较强的杀菌能力，并应具有易去除而不易伤害外植体的特点。常用的有次氯酸钠（0.5%～10%）和漂白粉（1%～10%）滤液，能分解产生具杀菌作用的氯气，并自行散发到空气中，只要浓度得当，一般不会伤害外植体。双氧水（3%～10%）也易分解而不易伤害外植体。酒精（70%）具较强的渗透力和杀菌作用，且易挥发，但会杀死组织细胞，所以消毒时间不宜过长。常用酒精先消毒几秒钟，有利其他消毒剂渗入材料发挥杀菌作用。

消毒方法和程序因材料不同而异。通常先用酒精（70%）浸数秒，取出后置于10%次氯酸钙饱和上清液浸10～20分钟或2%～10%次氯酸钠溶液浸6～15分钟，取出后用无菌水冲洗3次。

2.外植体的增殖

外植体的增殖是组培的关键阶段。接种后的培养容器在培养室中，一般每天光照16小时，1500～3000勒克斯，温度在25℃左右进行分化培养。在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，还需要进行继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖培养1个月左右后，可视情况进行再增殖，经一次又一次的继代，即可增加植株数量。

继代培养中由于外植体本身来自无菌环境，不需要消毒，操作较方便。但由于继代培养中外植体分化能力会逐渐下降，所以继代培养代数也不是无止境的。

3.根的诱导

继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转移到生根培养基上进行生根培养。生根培养基较多用1/2MS培养基，因为降低无机盐浓度有利于根分化。此外，生根培养基在激素种类和浓度上与增殖培养基有较大差异，主要如细胞分裂素、生长素等，一般细胞分裂素抑制生根而生长素促进生根。

一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。此外，生产中也有用具根原基试管苗，即只在生根培养基中培养7～10天，诱导根原基或小于1毫米的幼根后即用于移植。由于其基部切口已愈合而形成根原基，不易感染，且栽后能很快生根，具较高的成活率。

4.组培苗的炼苗移栽

生根或形成根原基的试管苗从无菌，光、温、湿稳定环境中进入自然环境，从异养过渡到自养过程，必须经过一个驯化锻炼过程，即所谓炼苗。

一般移植前，先将培养容器打开盖子，于室内自然光照下放3天，然后取出苗，用自来水将根系上琼脂冲洗干净，再栽入已准备好的基质中。基质常用泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等或适当加部分园土，使用前最好用高温或药物消毒。移栽前期要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度90%左右）。但注意基质不宜过湿，更不能积水，以防烂苗。此外，温度对成活率影响也很大，以15～25℃最适宜，夏季温度过高，水少小苗易萎蔫，水多又易腐烂，管理较困难，成活率下降。炼苗4～6周，新梢开始生长后，小苗即可转入正常管理。

7. 植物组织培养一般的的流程

植物组织培养的流程：

第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。

第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10～30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。

第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1～2种使用见表。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3～10次左右。

(7)组织培养的步骤和方法扩展阅读

组织培养技术是在人为创造的无菌条件下将生活的离体器官（如根、茎、叶、茎段、原生质体）、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。

组织培养技术原理

植物组织培养的原理是细胞全能性。也就是说每个植物细胞里都含有一整套遗传物质，只不过在特定条件下才会表达。

组织培养基于此原理就可以将已处于分化终端或正在分化的植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成新的丛生芽。

组织培养技术的应用

（1）改良作物：增加遗传变异性。

（2）繁殖植物：组织培养中从一个单细胞，一块愈伤组织，一个芽（或其它器官）都可以获得无性系。无性系就是用植物体细胞繁殖所获得的后代。

（3）有用化合物：有用化合物包括药物、橡胶、香精油、色素等。这些化合物许多都是高等植物的次生代谢物，有些化合物还不能大规模地人工合成，而靠植物产生这些化合物来源有限。因此，利用组织培养方法，培养植物的某些器官或愈伤组织，并筛选出高产、高合成能力、生长快的细胞株系，以进行工业化生产，是一条行之有效的途径。

8. 组织培养的步骤

专家解答

组织培养繁殖法是利用细胞的全能性和组织的再生能力，切取草莓植株的部分组织或器官，在无菌条件下，接种到人工配置的培养基上，使之发育成完整的植株。草莓组织培养繁殖的优点是：

（1）植株健壮结果好任何植物在长期的无性繁殖过程中都容易感染病毒，受到病毒感染的植株生活力衰退，产量降低，品质变劣。而组织培养繁殖的整个过程是在无菌环境中进行的，对于做繁殖材料的茎尖也要进行脱毒处理，这样所得的秧苗不含或少含病毒，比一般秧苗叶片大而厚，叶色浓绿；生长健壮且整齐一致；结果期延长3周，平均增产20%左右；果个大，品质优。

（2）繁殖速度快利用组织培养法繁殖草莓，一年内一个分生组织可获得几千株甚至几万株秧苗，这种繁殖方法对加速新品种推广，特别是对抽生匍匐茎低的品种的繁殖更为有利。

（3）繁殖不受季节限制组织培养是在操作室和配套温室中进行的，不受外界环境条件的影响，一年四季均可生产，在人工控制条件下，可进行工厂化育苗。

（4）节省土地，利于种质保存用组织培养法繁殖是在实验室中进行的，对露地占用少。所以，不仅节省土地，便于管理，而且对保存种质资源更加安全。

组织培养繁殖有以下几个步骤：

（1）配制培养基常用的培养基是MS培养基、怀特培养基，其配方见表11。

①配制母液。将营养成分中大量元素扩大10倍，微量元素扩大100倍。把大量元素、微量元素、有机生长物质分别贴上标签，放在3～5℃环境中待用。植物生长调节剂如6-苄基嘌呤、激动素用少量0.5摩尔/升的盐酸溶解，萘乙酸用酒精溶解，溶解后加水稀释。

②培养基配制。将所要用的琼脂加热溶解，加入蔗糖搅拌，配制成琼脂-蔗糖液。然后按量把配制好的母液置入准备好的容器中，接着把琼脂-蔗糖液也置入同一容器中，充分搅拌，定容到规定的体积。

③调整酸碱度。琼脂培养基加热灭菌时，pH会降低0.1～0.3，所以在加热前用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠液调整培养基的pH。

④高温消毒。把培养基趁热注入试管或三角瓶内，注入量为容器容积的1/3左右，塞上棉塞，缚紧，放入高压蒸汽锅内灭菌。蒸汽锅压力维持在78.5～98千帕，时间为10～20分钟。

单位：毫克/升序号化合物MSWhite1硝酸钾（KNO3）1900802硝酸铵（NH4NO3）1650-3四水硝酸钙[Ca（NO3）2·4H2O]-3004硫酸钠（Na2SO4）-2005七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）3707206七水磷酸二氢钠（NaH2PO4·7H2O）-16.57磷酸二氢钾（KH2PO4）170-8氯化钾（KCl）-659一水氯化钾（KCl·H2O）440-10四水硫酸锰（MnSO4·4H2O）22.37.011七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.63.0表11营养基配方序号化合物MSWhite12硫酸铁[Fe2（SO4）3]-2.513五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.0250.00114氧化钼（MoO3）-0.00115硼酸（H3PO3）6.21.516碘化钾（KI）0.830.7517六水氯化亚钴（CoCl2·6H2O）0.025-18二水钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25-19肌醇10010020烟酸0.50.321盐酸硫胺素0.40.122盐酸吡哆醇0.50.123甘氨酸2.0324蔗糖300002000025琼脂100001000026pH5.85.6表11营养基配方（续）-1（2）选材与消毒选取健壮植株上充实、小叶尚未展开的匍匐茎先端3厘米左右的幼嫩组织作培养材料。将材料用洁净流动的清水冲洗0.5～1个小时，然后用70%的酒精浸泡1分钟，再用0.1%升汞水浸泡7分钟，最后用无菌水冲洗2～3次。

（3）接种在无菌的超净工作台上，用镊子去掉茎尖组织的叶片，在解剖镜下，用消过毒的刀片切取茎尖分生组织0.3～0.5毫米大小，放入备用的培养基上。

（4）初代培养将接过种的试管或三角瓶放置在温度25～28℃，光照强度2000勒克斯，每天照射10小时的无菌条件下进行培养。10～15天接种物开始萌发，再经7～10天接种物产生很多小芽，形成芽丛；3个月后，无根苗长至3～4厘米。这时初代培养结束。

（5）继代培养当初代培养的无根苗长到3～4厘米时，将其取出进行生根培养。把剩下没达到3～4厘米的芽，按3～4个芽为一个芽丛重新分开，再重新植入同种培养基（初代培养基）上进行增殖培养，这种增殖培养称继代培养。1个月左右新的一批无根苗又繁殖出来，再用同种方法进行下一次继代培养。

（6）生根培养将初代培养或继代培养的高度已达到3～4厘米的无根苗，扦插到珍珠岩内进行生根培养。生根培养的苗床温度保持在18～20℃，空气湿度在80%以上，珍珠岩中要喷洒营养液和生根素。20天以后，当秧苗长出3～4条，长度达1.5～2.5厘米的根系时，可进行移栽锻炼。目前国内比较常用的营养液配方见表12。

化合物名称园试配方化合物用量毫克/升毫摩/升元素含量（毫克/升）大量元素总计（毫克/升）Ca（NO3）.7P41MgSO4.7H2O4932Mg48S64Na2Fe-EDTA20-Fe2.8H3BO32.86-B0.5MnSO4·4H2O2.13-Mn0.05ZnSO4·7H2O0.22-Zn0.05CuSO4·5H2O0.08-Cu0.02（NH4）6Mo7O24·4H2O0.02-Mo0.01N243P41K312Ca160Mg48S64表12营养液配方注：参引2001年张福墁主编《设施园艺学》。

（7）移栽当秧苗已长出3～4条1.5～2.5厘米长新根时，可移栽到室外进行土壤育苗。移栽后的前两周应覆盖薄膜与覆盖遮阳网，保持土壤和空气湿度，缓苗后撤除覆盖物。

提示板

组织培养能培育优质的壮苗，但技术要求比较严谨，目前还只在科研院所进行。随着科技的进步，大型繁育场将逐步得到推广。无毒育苗将是草莓苗木繁育的主要手段。

9. 植物组织培养的流程

植物组织培养的流程：

第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。

流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。

(9)组织培养的步骤和方法扩展阅读

培养材料采集：

要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合作用、呼吸作用旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。

培养材料的消毒：

从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。