切蜡的方法和步骤

‘壹’ 石蜡切片的制作方法

肠道的石蜡切片的制作
（1）
取材：用锋利的刀切取罗非鱼的一小段前肠（据胃5cm左右位置的前肠），组织块的规格为
3～5mm×3～5mm×10～15mm。
（2）
固定：采用Bouin氏固定液装瓶固定，固定液用量一般为组织块体积的10～20倍。
（3）
冲洗：固定12～24h后，将材料自固定液中取出后，在70%酒精中换洗几次，可在酒精中加几滴氨水至洗去黄色为止。
（4）
脱水：70%酒精（1h）→80%酒精（1h）→90%酒精（1h）→95%酒精（1h）→无水乙醇Ⅰ（1h）→无水乙醇Ⅱ（1h）
（5）
透明：无水乙醇与二甲苯溶液（1:1）（1h）→二甲苯Ⅰ（1h）→二甲苯Ⅱ
（1h）
（6）
浸蜡：浸蜡的全过程应在恒温设备中进行，将恒温箱调至58℃。
二甲苯与石蜡混合液（1:1）（1h）→石蜡Ⅰ（1h）→石蜡Ⅱ（1h）
浸蜡必须彻底，否则组织内残留透明剂会造成切片过程的困难和影响切片
的质量。
（7）
包埋：在小纸盒内注入溶化的石蜡，将已浸蜡的组织块置入其内，使蜡块迅速冷却硬固，组织块在蜡块中可长期保存。
（8）
切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5~7μm的石蜡带。
（9）
粘片：将组织石蜡带在50摄氏度的温水中展片，然后用经1%HCl溶液处理干净的载玻片捞片，组织带即可粘在载玻片上。
（10）
烤片：将粘好的载玻片置于35℃左右的温箱中烤干，待2~3小时后，即可取下编号。
（11）
苏木精—伊红染色：将烤干的片进行染色。
①脱蜡：将烤干的切片放入二甲苯(I)10min→二甲苯(Ⅱ)10rain。
②复水：将脱蜡后的切片移入100％酒精5min→95％酒精5min→85％酒精5min→70％酒精5min→蒸馏水5min
③HE染色显示肠道黏膜上皮内淋巴细胞：将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中，10min，使细胞核着色；用自来水洗去切片上残余染液；用1％的盐酸酒精分色3秒；用自来水浸洗3h，显微镜下观察，直到胞核蓝化为止；然后切片入曙红溶液中染色5min，使细胞质着色。经95％酒精与100％酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片。
④奥新兰一沙黄染色显示肠道内肥大细胞：切片常规脱蜡下行至蒸馏水→奥新兰一沙黄液染色15～20min→蒸馏水速洗，镜检→95％和100％酒精分色脱水1—2min→二甲苯透明→中性树胶封片。
⑤阿利新兰醋酸染色显示肠道内杯状细胞：切片经脱蜡下行入蒸馏水→阿利新兰醋酸染色10min→蒸馏水洗→1％高碘酸水液氧化5min→蒸馏水略洗一Schiff试剂染色（37℃恒温箱）30min→普通水洗3次→蒸馏水2min→Ehrlich苏木精染色5min→95％酒精和100％酒精脱水→二甲苯透明，中性树胶封片。
切片经脱蜡下行入水：二甲苯(30
min)一二甲苯(10
min)一无水乙醇(5
min)一无水乙醇(5
min)一
95％
乙醇(5
min)一85％乙醇(5
min)一70％
乙醇(5
min)一流水冲洗(20
min)。人Ehrlich苏木精染
色12
min，蒸馏水速洗。盐酸酒精分色，镜检控制时间。入伊红染色2
min，蒸馏水略洗。盐酸酒精分色，镜检控制时间。经95％酒精与无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
阿利新兰—番红复合染色液的方法称Scaba法
阿利新兰—番红分别染色的方法称Spicer法

‘贰’ 石蜡切片制作过程是怎样的

1.取材
确定所取材料的来源及部位，纵切还是横切；
取材要迅速，防止阻止发生进一步变化，材料体积要适宜。
2.固定
（1） 固定液的选择
最常用的固定液为FAA（万用固定液）。
它的优点是材料固定时间不受限制，固定时间短则数小时，长则数月或数年。（可做材料保存液）
配方： 50％或70％酒精 90ml
冰醋酸 5 ml
福尔马林 5 ml
(柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制)
（2）材料固定后的处理
冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。
(材料固定后，若暂时不能进行下一步操作，可于70%的酒精溶液或直接与FAA固定液中，于冰箱中4℃存放。)
下图为固定液浸泡的组织切块。3.脱水
目的：水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。
试剂：梯度酒精溶液
流程：70%---85%---95%--100%---
100% 每步1h-2h左右。
注意事项：保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但也不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩，这个时间大家可以根据自己的实验来摸索一下，不必完全按照本操作来）。
下图为自动组织脱水机，适于大量样品组织脱水用。如果材料体积及样品量较少可用小烧杯做容器来进行逐级脱水。04
4.透明
目的：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。
(二甲苯是最常用的透明剂，可以很好地与石蜡互溶)
流程：二甲苯与酒精的等体积混合液1h---纯二甲苯1h---纯二甲苯1h。

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5.浸蜡与包埋
目的：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。
浸蜡程序:(恒温)
（1）低温浸蜡（36℃）：接上步，在有二甲苯和材料的烧杯中逐步加碎蜡至过饱和（石蜡不能溶解），过夜12-24h。
（2）高温浸蜡（55-60℃，高于石蜡熔点3℃ ）：
将上步二甲苯与石蜡的混合液倒出，不要倒掉材料，将烧杯中加入纯石蜡，共5-24h。纯石蜡需要更换三次。
关于石蜡的选择石蜡熔点：
对于较硬的材料，用熔点较高的石蜡进行包埋；
当切片较薄时（在8μm以下），选用熔点较高的石蜡包埋；
夏季宜采用熔点较高的石蜡（56,58℃）,冬季宜选用熔点较低的石蜡（52,54℃）。切片
传统的切片方法是将包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小木块上，上机切片。
新型的切片方法是将包埋框（见下图）代替木块的支撑作用，上机切片。
切片的厚度可以根据自己的实验要求来确定，一般在8μm-20μm范围内。
（下图为传统切片机与新型自动切片机）07
7.粘片与烤片
粘片：用粘片剂将蜡片牢附于载玻片上，防止在后续的操作中材料脱落。
在载玻片上涂抹粘片剂（甲液），再滴蒸馏水（乙液），放上蜡片，用滤纸吸取多余的水分。
烤片：将载玻片放于40℃展片台中烤干。
常用的粘片剂为郝伯特(Haupt) 配方：
甲液：明胶 1g 乙液：甲醛 4 ml
蒸馏水 100ml 蒸馏水 100ml
甘油 15 ml
苯酚 2g08
8.脱蜡与复水、染色
脱蜡目的：干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。
复水目的：脱蜡后的材料，如果不经过复水，直接进入染色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。
染色目的：使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。
总体流程：二甲苯1/2 二甲苯+1/2纯酒精100%酒精95％酒精85％酒精番红（4h以上）95％酒精固绿（迅速）95％酒精（迅速）100%酒精1/2 二甲苯+1/2纯酒精二甲苯二甲苯，以上各级约需5～10分钟，已注明时间的除外。
染色剂：1%番红（85%酒精配制）
0.5%固绿（95%酒精配制）09
9.切片脱水、透明和封固
接上步，在载玻片上滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，进行封片。
切片放入42℃温箱中干燥过夜。镜检，将合格的切片贴上标签。
封固剂选择加拿大树胶（Canada balsam）或中性树胶
至此，植物组织的石蜡切片大功告成！

‘叁’ 石蜡切片法的详细过程 和注意事项

中药材石蜡切片制作方法：1、药材先于水中浸润；2、石蜡置于空烧杯中，置于加热器上加热至融化；3、将药材擦干表面水分，将其竖直置于一小容器内；4、将融化液体石蜡倾入容器中，注意要一次性加入；5、放置，待液体石蜡凝固；6、用切片机或徒手切片切制薄片
7、制片

‘肆’ 求助植物组织石蜡切片的正确方法

1、切片机应放置平稳，切片刀、蜡块应安装牢固，否则因震动而出现切片褶皱或厚薄不均。2、切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起切片破碎。3、切片刀与蜡块切面的倾斜角以5°-10°为宜，过大则切片上卷，不易连接成蜡带；过小则切片皱起。4、切片时摇动旋转轮速度不可过快，用力均匀、平稳。5、展片时的水温在42-48℃之间，一般以45℃最宜；另外，还应及时清洁水中的蜡屑等杂物，防止污染切片。

‘伍’ 如何制作石蜡切片

1. 取材：切取一小段需要的组织，组织块的规格为 3-5mm×3-5mm×10-15mm。
2. 固定：固定液用量一般为组织块体积的10-20倍。
3. 冲洗：固定12-24小时后，将材料自固定液中取出后，在70%酒精中换洗几次，可在酒精中加几滴氨水至洗去黄色为止。
4. 脱水：70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精→无水乙醇Ⅰ（→无水乙醇Ⅱ
5. 透明：无水乙醇与二甲苯溶液（1:1）→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ
6.浸蜡：浸蜡的全过程应在恒温设备中进行，将恒温箱调至58℃。
二甲苯与石蜡混合液（1:1）→石蜡Ⅰ→石蜡Ⅱ浸蜡必须彻底，否则组织内残留透明剂会造成切片过程的困难和影响切片的质量。
7. 包埋：在盒内注入溶化的石蜡，将已浸蜡的组织块置入其内，使蜡块迅速冷却硬固，组织块在蜡块中可长期保存。
8. 切片：包埋后的组织块经修正后，用切片机切成5-7μm的石蜡带。
9. 粘片：将组织石蜡带在50摄氏度的温水中展片，然后用经1%氯化氢溶液处理干净的载玻片捞片，组织带即可粘在载玻片上。
10. 烤片：将粘好的载玻片置于35℃左右的温箱中烤干，待2-3小时。
11. 苏木精—伊红染色：将烤干的片进行染色。

‘陆’ 简述石蜡切片术的制作过程

石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤。
1．取材
材料的好坏直接影响到切片的质量，无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的。
（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。
（2）取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。
（3）切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。
（4）切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。
2．固定
组织和细胞离开机体后，在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，阻抑上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理，还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。
固定剂的作用对象主要是蛋白质，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作时不加考虑，如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来。
固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小，都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的，但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织的速度快。，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质，不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中，增加细胞内含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存剂作用。 固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。
简单固定剂即单一的固定剂，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。

‘柒’ 石蜡切片的石蜡切片制作基本技术

染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，掌握适宜的染色时间，才能达到较好的染色效果。
石蜡制片程序及环节繁多，需数日才能完成1个周期，但切片可长期保存，供教学、科研及病理诊断及复察，并可利用蜡块作其他项目的回顾性研究。病理常规制片过程中已简化了一些细的环节或缩短了部分处理时间以适应临床需要（可缩短至2天）。虽然冰冻切片大大快于石蜡切片，但所显示的形态结构却不如前者，因此病理医生最后还需要根据石蜡切片作出准确诊断。近些年来，在病理常规制片过程中采用了微波技术，从而大大缩短了制片过程，而且对形态结构并没有影响。微波是一种波长很短、频率却很高的高频电磁波[波长为1米 ～1毫米，频率为300兆赫（MHz）～300千兆赫（GHz）]。组织经微波辐射后加速组织内部分子的高速运动，以使液体的运输加快，增加弥散、渗透和交换效率，从而加速组织的固定、脱水、透明、包埋和染色各个环节。例如常规福尔马林固定需数小时～1天，而且能引起组织收缩及某些抗原成分不同程度的受到破坏，微波固定仅需1～2分钟，且可减少抗原的丢失和损害。选择适当的档次（功率）、辐射时间和温度是极为重要的。目前微波技术的应用在国内尚处于起步阶段，许多技术应用环节尚需进一步摸索。 石蜡切片不仅是经典的方法，又是最基本的方法，它与其他新的技术方法相结合，使传统的老技术扩大了应用范围，开辟了许多新领域，增加了许多新的研究、观察内容。随新的仪器及新的研究技术的不断问世及使用，使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，又从定性转向定量计测，使细胞组织的形态，功能及代谢三结合，从而达到定性可靠、定位准确及定量可测。

‘捌’ 切蜡不均匀怎么避免

不均匀的原因及避免和解决的办法：
1、刀口锋利不一，局部产生差异。可移动刀片或改用新刀口。
2、切片刀未覆盖整个蜡块。需调整刀口位置至刀片能切到整个蜡块。
3、蜡块左右硬度不一致。尽量使用锋利的新刀口，减轻干扰。
4、组织未居蜡块正中央。可用刀片切去部分石蜡使组织居中，或重新包埋。
5、蜡块冷冻过度。可适度升温，用毛笔将蜡片摊开压住，切2至3片即成带。
6、石蜡过硬。可加软蜡。
7、刀口太钝。需换新刀口。
8、刀的倾角太大。需减小倾角。

‘玖’ 石蜡切片制作过程有哪些步骤

石蜡切片操作步骤：

1、取材

2、固定

3、脱水：30%--50%---70%（每步60分钟）---85%---95%--100%---100%（每步30钟）。

4、透明：转入1/2二甲苯＋1/2无水酒精混合液20ml透明1h，纯二甲苯20ml透明1h，再用纯二甲苯20ml透明40min，并回收各液。

5、浸蜡：

（1）将材料分别放入25%、50%、75%的石蜡-二甲苯溶液中，每级30分钟。该过程在高于石蜡熔点3℃的温箱中进行；

（2）将材料放入溶解的纯蜡中，时间为30分钟，该过程再重复两次。在高于石蜡熔点3℃的温箱中进行。

6、包埋

（1）将溶解好的石蜡在加入预先折好的纸船中，石蜡溶解后应过滤后使用，以免含杂质影响切片；

（2）材料放入纸船，并摆好在蜡中的位置，如果包埋的组织块较多，应进行编号；

（3）将纸船放置在冷水上加速冷却过程。

7、切片

（1）修整：用刀片修成方形或长方形蜡块；

（2）以少许热蜡液，将蜡块底部粘附于小木块上，以少许石蜡融化在蜡块边缘，加强粘附的强度；

（3）木块粘附于切片机上，调整切片机，使蜡块切面与切片刀刃平行；

（4）切成连续的蜡带，切片刀的锐利度、蜡块的硬度都会影响切片质量，可用热水或冷水适当改变石蜡的硬度，也可在冰箱中放置一段时间；

（5）分割蜡带，分开的蜡片放在45℃温水上，使蜡片展开。

8、粘片与烤片

（1）可用粘片剂防止蜡片滑脱，但粘附剂通常容易被染色而使切片背景有颜色，影响观察，实验表明，载玻片洗的足够干净，一般不会滑片；

（2）用载玻片捞取展开后的蜡片，调整蜡片的位置使位于载玻片中央，自然干燥。

9、脱蜡与醇化

（1）将切片放入纯二甲苯溶液中10分钟，使石蜡完全溶解，共2次；

（2）溶去石蜡的切片依次放入75%、50%、25%二甲苯-乙醇溶液中，每级10分钟；

（3）再将切片依次放入100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%的乙醇溶液中进行醇化，每级10分钟。

10、染色

（1）将切片放入番红染液中30分钟，番红染色后，将切片依次放入50%、60%、70%、80%的乙醇溶液中分级洗脱，每级10分钟；

（2）洗脱后的切片放入固绿染液中染色1分钟；

11、脱水、透明与封片

（1）染色后的切片依次放入90%、90%、95%、100%乙醇溶液中分级洗脱，每级10分钟；

（2）洗脱后的切片依次放入25%、50%、75%、100%、100%二甲苯溶液中透明，每级10分钟，出现浑浊表示脱水不彻底，需重来；

（3）滴1-2滴中性树胶，将洁净的盖玻片倾斜放下，封片，镜检，选择好的贴上标签，性切片制作完成。

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