固定化酶常用的方法與直接使用

① 固定化酶的各種方法（如：包埋法和交聯法等）的具體操作流程～～～ 謝謝！！！『『『『『

包埋法、交聯法對細胞、酶的固定化操作及其比較

一． 實驗目的
通過用聚丙烯醯胺包埋法和明膠——戊二醛交聯法兩種方法固定枯草桿菌菌體和細胞色素C，掌握細胞和酶的一些固定方法，並對它們進行固定效果的比較，了解這些固定方法的特點。

二．實驗原理
酶的固定化技術是用物理或化學的方法將水溶性的酶與固態的水不溶性載體結合，使之成為一種不溶於水的仍具有酶活性的物質。固定化酶的優點在於：1）可以反復使用；2）易與產物分離，便於產物的純化處理，提高產物的產量和質量；3）多數情況下，比水溶性的酶穩定；4）適於裝柱使用，有利於生產的連續化。細胞的固定是將產酶的微生物細胞直接固定在固態的水不溶性載體上，省去了細胞破碎以及酶提取等復雜的步驟。但要求所固定的微生物能讓底物和產物易透過細胞膜並且細胞內不存在產物的分解系統。所以，要固定的細胞應該是有選擇性的。本實驗主要是學習固定的方法，並通過比較了解這些方法的特點。丙烯醯胺在一定條件下經催化可形成凝膠，把酶或細胞包埋在凝膠的網路空隙中，形成不溶性的酶的載體。明膠是一種惰性蛋白，當與細胞或酶蛋白混合後，就把酶或細胞包埋在明膠聯成的網架之中。由於菌體細胞或酶蛋白的表面都有蛋白質游離氨基，當加入雙功能團試劑戊二醛以後，戊二醛即和蛋白質游離氨基形成Schiff鹼，因此，在明膠表面與菌體或酶蛋白表面之間發生錯綜復雜的交聯，從而使酶或細胞固定化。

三．主要儀器與試劑
儀器：滅菌鍋，搖床，冰箱，離心機，水浴鍋，紫外-可見分光光度計等。
試劑：蛋白腖，牛肉膏，明膠，戊二醛，丙烯醯胺（Acr），過硫酸銨（AP），甲叉雙丙烯醯胺（Bis），四甲基乙二胺（TEMED），過氧化氫，鄰苯二胺，細胞色素C等。

四．操作步驟
1．枯草桿菌細胞的培養
在超凈台上將已滅菌的培養液（見實驗二十七）5ml移置已滅菌的試管中，接種純的枯草芽孢桿菌。在37℃搖床快速振盪培養8-10小時（培養液較混濁為止）。離心收集菌體，加3ml蒸餾水輕攪使菌細胞懸浮。
2. 丙烯醯胺凝膠固定細胞色素C和菌細胞
取50ml燒杯三隻，各加入3ml 29%Acr-1%Bis混合液，2ml水。輕攪勻後，於1號燒杯中加入1ml菌細胞懸浮液、2號燒杯中加入1ml 0.13%細胞色素C液和在3號燒杯中加入水1ml作為對照，然後都加入10％過硫酸銨液70μl和TEMED8μl，輕攪勻後待凝。將凝固後的凝膠用水浸泡5分鍾，其中換水3次。把凝膠放置濾紙上，用濾紙輕吸干，觀察凝膠顏色。（可能的話，將包含菌細胞的凝膠切成較薄的薄片與對照一起在顯微鏡下觀察）。將這幾種凝膠切成小顆粒，分別取約0.5克放置於有濾紙的漏斗中，用水淋洗數次後移置試管中，各加入20mmol/L鄰苯二胺4ml浸泡2分鍾後加入10%過氧化氫0.04ml，混勻反應30秒，倒出上清液，以水為空白測定428nm處的吸光值，分析測定結果並解釋。
3. 明膠包埋—戊二醛交聯法制備固定化細胞色素C和固定化菌細胞
取50ml燒杯二隻，各加入明膠1克，水4ml，於80℃水浴熔化，冷卻至60℃左右分別加入2ml菌細胞懸浮液或0.13%的細胞色素C液，在攪動下迅速加入25%的戊二醛0.5ml，置於—20℃，三天後取出融化，觀察比較。

② 酶的固定化方法主要有哪些

一、包埋法 定義：將酶、細胞或原生質體包埋在各種多孔載體中，使其固定化的方法。 分類：根據載體的材料和方法的不同分為凝膠包埋法（網格型包埋法）、半透膜包埋法（微囊型包埋法）。 1、凝膠包埋法：應用最廣泛的固定化方法。

③ 什麼是固定化酶有何優點如何制備固定化酶

什麼是固定化酶？有何優點？如何制備固定化酶
1固定化酶的傳統制備方法
1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法,將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式.
顯著特點是：
工藝簡便及條件溫和,包括無機、有機高分子材料,
吸附過程可同時達到純化和固定化；
酶失活後可重新活化,
載體也可再生.
但要求載體的比表面積要求較大,有活潑的表面
1.2包埋法
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結構或微囊結構等多空載體中,而底物仍能滲入格子或微囊內與酶相接觸.這個方法比較簡便,酶分子僅僅是被包埋起來,生物活性被破壞的程度低,但此法對大分子底物不適用.
(1)網格型
將酶或包埋在凝膠細微網格中,製成一定形狀的固定化酶,稱為網格型包埋法.也稱為凝膠包埋法.
(2)微囊型
把酶包埋在由高分子聚合物製成的小球內,製成固定化酶.由於形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米,所以也稱為微囊化法.
1.3結合法
酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過離子鍵結合而使酶固定的方法,叫離子鍵結合法.其間形成化學共價鍵結合的固定化方法叫共價鍵結合法.共價鍵結合法結合力牢固,使用過程中不易發生酶的脫落,穩定性能好.
該法的缺點是載體的活化或固定化操作比較復雜,反應條件也比較強烈,所以往往需要嚴格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶.
1.4交聯法
交聯法是用多功能試劑進行酶蛋白之間的交聯,使酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵,得到三向的交聯網架結構,除了酶分子之間發生交聯外,還存在著一定的分子內交聯.多功能試劑制備固定化酶方法可分為：
(1) 單獨與酶作用；
( 2) 酶吸附在載體表面上再經受交聯；
( 3) 多功能團試劑與載體反應得到有功能團的載體,再連接酶.交聯劑的種類很多,最常用的是戊二醛,其他的還有異氰酸衍生物、雙偶氮二聯苯胺、N,N-乙烯馬來醯亞胺等.
交聯法的優點是酶與載體結合牢固,穩定性較高；缺點是有的方法固定化操作較復雜,進行化學修飾時易造成酶失活
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競爭性抑制劑與被抑制的酶的底物通常有結構上的相似性,能與底物競相爭奪酶分子上的結合位點,從而產生酶活性的可逆的抑製作用.與酶的活性中心相結合.與酶的結合是可逆的.
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增大底物濃度可以減弱競爭性抑制劑的影響.

④ 固定化酶的制備方法

固定化酶的制備方法有物理法和化學法兩大類。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的優點在於酶不參加化學反應,整體結構保持不變,酶的催化活性得到很好保留。但是,由於包埋物或半透膜具有一定的空間或立體阻礙作用,因此對一些反應不適用。
化學法包括結合法、交聯法。結合法又分為離子結合法和共價結合法。是將酶通過化學鍵連接到天然的或合成的高分子載體上,使用偶聯劑通過酶表面的基團將酶交聯起來,而形成相對分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.
其中吸附法和共價鍵法又可統稱為載體結合法。 吸附法
利用各種吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和離子吸附法。
常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
採用吸附法固定酶，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得，可反復使用。
載體結合法
最常用的是共價結合法，即酶蛋白的非必需基團通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。在溫和的條件下能偶聯的蛋白質基團包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價結合的基團，不能是酶表現活力所必需的基團。以中國首先採用的雙功能團試劑「對位-β-硫酸酯乙碸基苯胺」偶聯載體和酶為例，載體結合的步驟如下頁反應式。
此法曾先後用於3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖澱粉酶等的固定化。此外酶通過物理吸附或離子吸附於載體制備固定化酶也是常用的方法。
交聯法
依靠雙功能團試劑使酶分子之間發生交聯凝集成網狀結構，使之不溶於水從而形成固定化酶。常採用的雙功能團試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯反應。
包埋法
酶被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細胞，製成固定化細胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有青黴素醯化酶活力的菌體，可連續水解帤基青黴素，工業生產6-氨基青黴烷酸。
酶經過固定化後，比較能耐受溫度及pH的變化，最適pH往往稍有移位，對底物專一性沒有任何改變，實際使用效率提高幾十倍（如5′-磷酸二酯酶的工業應用）甚至幾百倍（如青黴素醯化酶的工業應用）。 特點 吸附 共價鏈接 包埋 膜限制 制備 簡單 難 難 簡單 費用 低 高 中等 高 結合力 易變 強 弱 強 損失 有 無 有 無 適用性 廣 有選擇性 廣 非常廣 運轉問題 高 低 高 高 基質效應 有 有 有 無 溶解度 無 無 有 有 抗微生物特性 無 無 有 有

⑤ 酶的固定化方法有哪些各有何分缺點

固定化酶的制備方法有物理法和化學法兩大類。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的優點在於酶不參加化學反應,整體結構保持不變,酶的催化活性得到很好保留。但是,由於包埋物或半透膜具有一定的空間或立體阻礙作用,因此對一些反應不適用。化學法是將酶通過化學鍵連接到天然的或合成的高分子載體上,使用偶聯劑通過酶表面的基團將酶交聯起來,而形成相對分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.

⑥ 直接使用酶,使用固定化酶和固定化細胞催化反應,都有哪些缺點

各自的缺點如下：
直接使用酶：對環境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難被回收，不能被再次被利用，提高了生產成本；反應後酶會混在產物中，可能影響產品品質。
使用固定化酶：一種酶只能催化一種化學反應，而在生產實踐中，很多產物的形成都是通過一系列的酶促反應才能得到的。
使用固定化細胞：固定後的細胞與反應物不容易接近，可能導致反應效果下降。由於大分子物質難以自由通過細胞膜，因此固定化細胞的技術也受到限制。

⑦ 把酶固定化有什麼好處和用處固定酶的方法有那些

酶工程的實現，體現在酶的半衰期的延長和酶活的穩定性。採用固定化可以顯著提高這兩個指標，固定化酶所用載體是比較多的，比如樹脂等。
是指利用酶催化劑所具有的特異催化功能，藉助工藝學手段和生物反應器裝置來生產所需的生物化工產品的過程，與發酵過程相比，它採用了反應專一性的酶為催化劑,無副產品,過程精製和產物分離純化較方便。在生物反應器及操作方式上有較大的選擇餘地，除分批釜式反應外，可考慮用膜式反應器進行連續操作。在應用固定化酶為催化劑時，更可採用各種固定床和流化床的連續操作反應器。
沿革 古代人類雖不知道酶的存在，但是自古以來就知道利用植物和微生物的酶來催化反應生產各種食品。如利用麥芽中的麥芽糖酶來制備飴糖，利用酒葯中的微生物產生的澱粉酶和酒化酶來生產酒釀、黃酒和白酒等。隨著科學技術的發展，人們認識到，雖然酶是活細胞產生的，但是許多酶可以單獨分離得到，在分離的狀態下，酶仍然能繼續它的生物催化作用。20世紀40年代，以生產抗生素為代表的深層液體通氣純種培養技術獲得成功，從生產技術方面為酶制劑工業的形成創造了條件。以後，酶的生產、分離、精製，酶在游離狀態下的利用，固定化酶的制備和利用，酶反應器的應用等技術的發展，導致70年代初人們將酶反應過程（有時也稱酶過程）從發酵過程中分出去，單獨成為酶工程中的核心部分。
分類 以酶為催化劑的酶反應過程，可根據作用於底物的酶性質決定。以單一酶為催化劑的反應稱單酶反應；以兩個酶或兩個以上酶參與反應的過程稱多酶反應；或稱多酶串聯反應。從化學反應工程角度出發，可分為單（液）相催化反應以及多相催化反應，後者以液固相催化反應為主。游離酶的反應常屬前者，而固定化酶的反應則屬後者。
組成步驟 以工業生產為目的的酶過程可由以下五個步驟所組成：
①產生酶的微生物發酵過程。
②胞內酶的微生物細胞破碎過程。可用機械研磨、高壓勻漿器進行破碎;也可用加入溶菌酶的方法處理,或用超聲波、反復凍融的物理方法。胞外酶則不需上述操作，直接將發酵液過濾除去菌體即可。
③酶的分離純化過程。根據酶分子與其他蛋白質之間性質的差異，例如分子的大小、溶解度的不同，用鹽析法、有機溶媒沉澱法、電滲析法、離子交換層析和電泳法等技術，將酶進行分離純化。
④為了提高酶的催化性能，將酶固定在載體上的固定化過程（見固定化酶）。
⑤酶反應器的設計和酶反應控制。對於游離酶反應，通常採用分批攪拌槽反應器；對於固定化酶反應，則常用連續柱式反應器（見生物反應器）。
典型過程 有單酶反應和多酶反應。
①單酶反應 用氨基醯化酶對醯化DL－氨基酸進行水解,析出為L-氨基酸和醯基-D-氨基酸是典型的單酶反應。

若採用液相催化反應，當間歇反應結束後，給產物的提取帶來困難。由於缺乏適當分離手段，酶使用一次就被棄掉，很不經濟。目前，工業上採用液固催化反應，即用固定化氨基醯化酶進行連續生產（見圖）。底物乙醯-DL-氨基酸溶液以一定流速進入酶反應柱，反應過程中對溫度、pH進行控制，經過濃縮後，利用溶解度不同進行分離得到產品L－氨基酸。醯化-D-氨基酸用化學方法進行消旋化反應後，作為基質循環使用。該法與用液態酶間歇式反應相比較，有操作穩定、分離簡便、收率高、成本低等優點。

②多酶反應 以DL-α-氨基-ε-乙內醯胺為原料通過由L-α-氨基-ε-已內醯胺水解和α-氨基-ε-已內醯胺消旋酶共同固定的酶柱後，即可獲得最終產品L-氨基

⑧ 固定化酶的方法

固定化酶是藉助於物理和化學的方法吧酶束縛在一定的空間內並仍具有催化活性的酶制劑。
制備方法有：1、吸附法 是酶分子吸附於水不溶性的載體上，有物理吸附法及離子交換劑吸附法。
2、共價結合法 將酶通過花些反應以共價結合與載體的固定化方法。
3、交聯法 用多功能試劑與酶蛋白分子進行交聯的一種方法。其基本原理是酶分子中有力的氨基、酚基及咪唑基均可與多功能試劑之間形成共價鍵，得到三相的交聯網狀結構。
4、包埋法 是將酶物理包埋在高聚物內的方法。

⑨ 簡述酶的固定的方法及優點

與自然酶相比，固定化酶和固定化細胞具有明顯的優點（也就是為什麼要進行酶的固定化）： 一、可以做成各種形狀如顆粒狀、管狀、膜狀，裝在反應槽中便於取出，便於連續、反復使用。
二、穩定性提高，不易失去活性，使用壽命延長。
三、便於自動化操作，實現用電腦控制的連續生產。
方法：物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化學法包括結合法、交聯法。
各種方法優缺點
1·吸附法 ：利用各種吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。 常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 採用吸附法固定酶，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶邊形或失活，且載體廉價易得，可反復使用。
2·包埋法 酶被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。優點酶包埋在聚合物中不易漏出;操作條件溫和、對外界環境的緩沖作用大，可防止酶體的機械損傷,易於再生,產物分離提取容易。3·共價結合法（屬化學法中的結合法）即酶蛋白的非必需基團通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。共價結合法酶與載體之間結合緊密，不易脫落，穩定性好，但反應條件激烈，操作復雜，控制條件苛刻，活力損失較大
4·交聯法 依靠雙功能團試劑使酶分子之間發生交聯凝集成網狀結構，使之不溶於水從而形成固定化酶，此法制備的細胞與載體結合緊密，但制備麻煩，活力損失較大