常用的食用菌菌種保藏方法

A. 如何保藏草菇菌種

草菇是食用菌中需求溫度最高的品種。草菇菌種不耐低溫，較長時間保藏在10℃以下環境會失去活力，甚至死亡。所以，不能像其他品種的菌種一樣利用冰箱在0～4℃條件下保藏，很多菌種生產者還未掌握這項技術。草菇菌種的保藏方法有：傳代培養保藏法、液體石蠟覆蓋保藏法、栽培保藏法、冷凍乾燥液態氮超低溫保藏法、懸液保藏法、自然基質簡易保藏法等。生產上最常用的保藏方法是傳代培養保藏法。根據培養基成分的不同，傳代培養保藏有兩種方式：

（1）試管斜面接種培養保藏

將需要保藏的草菇菌種接到PDA試管斜面，在30℃下培養，菌絲長滿培養基後，在20℃左右溫度下存放，最低不要低於15℃。為減少保藏過程中基內水分的散失，通常將菌種放在塑料袋中，亦可用橡膠塞封緊管口，並每隔2～3個月轉管1次。

（2）稻草斜面接種培養保藏

稻草粉95%，石膏2%，麩皮或米糠3%，用石灰調節pH 8～9，含水量55%～60%。將配好的培養基裝入直徑25毫米、長250毫米的試管中，裝料量為試管長度的2／3，用棉塞封管口。滅菌後，接上草菇菌種，33℃下培養，待菌絲長滿試管時，用橡膠塞代替棉塞封緊管口。置15～20℃下保藏，每隔3～6個月轉管1次。

B. 厭氧微生物菌種的保藏方法

厭氧是在封閉條件下，將污水或廢水中的有機物，轉化為CH4、CO2、H2O、NH3、H2S，並為細胞合成提供能量，少量有機物被轉化、合成新的原生質。但是採用厭氧處理污水，極易受到鹼度、溶解氧、揮發性脂肪酸（VFA）、氧化還原電位、有毒物質、溫度、有機負荷、水力停留時間等對微生物生長繁殖的影響和抑制，設計人員往往採取加大厭氧池，增加污水或廢水在池中的停留時間，來解決厭氧微生物生長繁殖不及造成數量不足等技術問題。
加大厭氧池給不但增加了佔地面積和工程投資，而且無法解決春夏秋冬季節變化所引起的溫差，影響厭氧微生物生存繁殖，進而造成污水處理效果不好，引發城市、醫院、工業等污水處理升級改造，有的還升了又升，改了又改。
厭氧微生物發生器能在24小時內產生72代高密度的厭氧微生物菌群，這些高密度的厭氧微生物群能迅速將污水中的污染物分解成CH4和CO2，從而減少厭氧池體積、降低厭氧池投資，是理想的厭氧生物強化處理設備。
採用厭氧池+厭氧微生物發生器，對污水進行生物強化處理，在消化污染物的同時，脫除污水中的氮、去除污水中磷、消除污水中的味、吃掉污水中的淤泥。厭氧微生物發生器主要應用行業如下：
1、醫院、療養院、醫院院校、農村衛生院、醫療診所等含菌污水處理；
2、城鎮、村鎮、農村、住宅小區及開發區生活污水處理，賓館、飯店、學校、商場及辦公樓污水處理，車站、航空港、碼頭等污水處理；
3、化工、制葯、印染、腌制、畜禽養殖、製糖、釀酒、石化、焦化、農葯、味精、紙漿、毛紡、橡膠、餐飲廢水處理；
4、城鎮污水處理廠升級改造及中水回用處理；
5、有脫氮除磷需求的廢水處理；
6、江河、湖泊等河道、景觀治理；
7、濕地公園生態修復；
8、污水處理廠污泥減量，實現無泥外排處理。

C. 母種的保藏方法有哪些

母種保藏的方法有很多種，具體採用哪種方法應根據實際情況而定。常用的基礎方法有：斜面繼代低溫保藏、自然基質保藏（麥穀粒保藏、發酵糞草保藏、木屑保藏、麥麩+木片保藏、木塊+瓊脂保藏、稻草粉保藏草菇菌種、枝條保藏）、液體保藏[礦油保藏、菌絲球生理鹽水保藏、蒸餾水保藏、營養液保藏、液氮保藏（圖2-12）]、孢子濾紙保藏、真空冷凍乾燥保藏、液氮超低溫保藏、孢子沙土管保藏、梭氏真空乾燥保藏等方法。專門保藏菌種的機構為確保保藏效果，每一品種都要同時用至少三種方法保藏，即長期方法、中長期方法和短期方法。限於篇幅，不再一一介紹。下面僅針對菇農介紹常用的低溫和基質保藏法及幾種土法保藏方法。

圖2-12 母種的液氮保藏法

（1）斜面繼代低溫保藏

這是一種傳統的、普遍應用的簡易保藏方法，它簡單易行，不需特殊設備，並能隨時觀察所保藏菌種的情況。其缺點是轉管頻繁，營養生長過多，易發生退化，在操作中發生技術錯誤的機會多；可能會因未及時轉接、培養基幹縮而引起菌種老化、死亡等。

這種方法是根據低溫能抑制菌絲生長的原理，將需要保藏的菌種接種在斜面培養基上，適溫培養，當菌絲健壯地快長滿斜面時取出，放2～5℃低溫乾燥處或冰箱、冰櫃中保藏。每隔一定時間要移植轉管、繼代培養1次（一般4～5個月），具體應根據菌種特性來確定。食用菌中有的中高溫和高溫型品種，不適於該法，如毛木耳多數品種保藏的適宜溫度在10℃左右，中華靈芝在6～10℃，草菇在10～12℃。可在草菇菌落上灌注3～4毫升的防凍劑（10%的甘油）。

用於保藏的培養基，不宜用營養過貧或過富的合成培養基，一般採用天然培養基，如馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、馬鈴薯綜合培養基（CPDA）等。為防止產酸，糖應少加或不加，而需添加緩沖劑，如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈣等，以中和菌種在保藏過程中產生積累的有機酸。同時，每1000毫升還需加 10毫克維生素 B₁，加大瓊脂用量至25克，以防止培養基中水分蒸發過快。如保藏香菇和黑木耳菌種，把配方中的葡萄糖更換成麥芽糖更有利。棉塞稍長，入管內達3厘米左右，製成半高層培養基，即斜面小、短，管底1.5厘米的培養基呈柱狀。

橡皮塞密封保藏：選用與試管口相應大小的白橡皮塞，清洗、曬干，放入低壓聚乙烯袋內，於0.137兆帕下滅菌1小時。在無菌條件下，將培養合格的斜面菌種用無菌橡皮塞取代原棉塞，置4～6℃冰箱內保藏，保藏時間可達6個月以上。這種方法能隔絕空氣，防止蒸發，達到液體石蠟相似的效果。而且放置、郵寄、攜帶等很方便。

注意事項：

①保藏菌種必須是發育健旺的菌種，培養時間不可過長，以免降低菌種生活力。

②制種時要貼好標簽，每次移接時要細心核對菌種號及標明時間，做到准確無誤，若發現錯誤，應立即糾正，無法確認的，剔除不要。

③定期檢查保藏情況，一旦發現污染或培養基失水干縮現象，應立即移接、剔除。

④盡量少啟用冰箱，以免產生冷凝水而引起污染，開啟時應做到邊開、邊取、邊關，最好設置一個永久性的保藏冰箱，與常用菌種的冰箱分開。

⑤保藏菌種在冰箱中不可過分擁擠；保藏溫度控制在3～5℃，不宜過高或過低。

⑥冰箱要定期排霜，清除積水。保藏時要注意環境濕度不能太高，濕度太高，黴菌容易在棉塞上生長，並通過棉花纖維進入管內。所以，最好用橡皮塞或硅氧海綿塞代替。若用棉塞，可用干凈的紙（硫酸紙、牛皮紙均可）包紮好，也能起到減少污染、延緩培養基幹縮的作用。

⑦所保存的菌種在使用時，要提前12～24小時從冰箱取出，經適溫培養恢復活力後，方能轉管移接。

（2）自然基質保藏

即利用食用菌自然生長的培養基來保藏菌種的方法。常用的有麥粒、穀粒培養基、發酵糞草、木屑木片、麥麩米糠等基質。

①麥（谷）粒保藏 此法利用麥粒、穀粒或玉米粒（碾碎）等作為培養基，進入顆粒的菌絲體，在表皮的保護和穀粒中有限水分的供給下，保藏期可達1～2年。現以麥粒為例介紹如下：

先將麥粒洗凈，用20℃左右溫水浸泡5小時後撈出晾乾表面的水分（或置水中煮沸5分鍾至不破皮），裝入試管長度的2/3～3/4，塞好棉塞，置於1.18×10⁵帕壓力下滅菌30分鍾。處理後麥粒的含水量不要超過25%，滅菌過程中勿使表皮破裂，以保護進入麥粒的菌絲體。滅菌後趁熱搖散麥粒，冷卻後，接種孢子液或菌絲懸浮液或菌絲塊，然後置25℃下培養，當試管快發滿菌絲後，即停止培養，保藏在乾燥冷涼處。

②木屑保藏 用闊葉樹木屑、麥麩加糖和石膏各1%，混合拌勻，加適量水後，裝入試管長度的2/3，稍壓緊，洗凈管口，塞上棉塞，用紙包好，置1.18×10⁵帕壓力下滅菌40分鍾，冷卻後接種，置25℃條件下培養，菌絲長滿後將棉塞蠟封或換橡皮塞，再包紮塑料袋置4℃冰箱中可保藏1～2年。

（3）井底低溫保藏

即利用井底具恆溫且溫度低的原理進行菌種保藏的方法，適用於不具備保鮮冰箱的菇農。將要保藏的試管母種，用無菌橡皮塞醮石蠟封口，裝入密閉的廣口瓶或塑料袋中，扎緊，沉入井底貯藏，可保藏2～5個月。

（4）石蠟封口保藏

把蠟紙裁成6～8厘米見方，放75%酒精中浸泡1分鍾。將已培養好試管種的管口在酒精燈火焰上方旋轉滅菌後，用鑷子取出蠟紙，扎緊管口。再將包好蠟紙的管口浸入熔化的石蠟中，將蠟紙完全浸入為止，使蠟紙緊緊封包在管壁上，絕不漏氣。待石蠟冷卻凝固後，置冰箱或室溫下保存。

（5）玻璃紙封口保藏

用明膠15克（粘合劑），硫酸銅2克，美藍1～2滴（指示劑），溶於100毫升熱水中，配製成封口劑。將新長滿的母種拔去棉塞，管口朝下，蘸上封口劑，貼上用95%酒精浸泡過的玻璃紙（賽珞璐），再用石蠟熔封。在室溫下，菌種至少可保存8個月，並能防止黴菌或蟎的侵染。在斜面注入無菌礦油（液體石蠟），可大大延長保藏時間。

（6）廄肥保藏

此法適合保藏雙孢菇等草腐菌類。將腐熟牛糞等堆肥曬干、打碎，取300克干堆肥，用5毫米孔徑篩過篩，加1000毫升水調濕，裝入試管，占管深1/3～1/2，在0.15兆帕壓力下滅菌2小時。確認無菌後，接種，菌絲長滿後，放在3℃冰箱內保藏，每隔2年移植一次。在長期保藏中，如培養基失水，應將保藏菌種及時接種在瓊脂斜面上進行活化，再繼續保存。此法連續保藏4年後，其生產性狀未出現明顯變化。

D. 為什麼要進行菌種的保藏工作

菌種保藏是食用菌菌種生產中的一項必不可少的重要環節。獲得一株優良的菌株是很不容易的，但又不可能一勞永逸。因為一個優良菌株在長期保存和應用過程中，如果保藏設備和手段不適宜，或傳代次數過多，培養時間過長，或因受不利外界環境條件的影響，常會導致種性衰退甚至死亡。因此，需在一定時間內使菌種的生活力、純度和優良性狀穩定地保存下來，就必須採取相應的措施，認真做好菌種的保藏工作。菌種保藏前，必須種性清楚、來源正宗、名稱准確，具一整套有關技術數據和資料，並處於良好狀態。

菌種保藏工作要有專人負責，每個生產單位都要有自己的菌種檔案，詳細記錄菌種來源、移植經過、保藏情況和在生產上使用的結果。管理人員要定期檢查保藏情況，及時清除已被污染的菌種。使用菌種時，在任何情況下，都不應將保藏的菌種全部用完。菌種的標簽，要字跡清楚，可長期保留，字跡模糊或沒有標簽的菌種最好不要使用。對保藏的菌種，至少兩年要做1次出菇試驗，從生長情況和經濟性狀上綜合考察保藏效果。

作為普通菌種生產企業和食用菌栽培者，由於條件、設備和技術水平的限制，常常只是菌種的貯藏。

E. 食用菌菌種的基本要求是什麼

使優良菌種的性狀保持穩定，人為地創造條件，使菌種的新陳代謝活動處於不活潑狀態。

食用菌菌種為食用菌菌絲體及其生長基質組成的繁殖材料，菌種分為母種（一級種）、原種（二級種）和栽培種（三級種）三級。使優良菌種的性狀保持穩定，人為地創造條件，使菌種的新陳代謝活動處於不活潑狀態即選取優良菌種的休眠體或富有生命力的懸浮液在低溫或脫水狀態下保存。

通過切取菌索、子實體、菌核的新鮮幼嫩的組織進行分離，以獲取純菌絲的方法，是最常用的菌種分離法之一 。子實體、菌索等實際就是雙核菌絲的紐結物，具有很強的再生能力。因分離時所 選擇的材料不同 ，該方法又可分為菌索組織分離法、子實體組織分離法及菌核組織分離法。

(5)常用的食用菌菌種保藏方法擴展閱讀：

食用菌菌種的相關要求規定：

1、菌種經營單位和個人應當建立菌種經營檔案，載明菌種來源、貯存時間和條件、銷售去向、運輸、經辦人等內容。經營檔案應當保存至菌種銷售後2年。

2、菌種生產單位和個人應當按照農業部《食用菌菌種生產技術規程》生產，並建立菌種生產檔案，載明生產地點、時間、數量、培養基配方、培養條件、菌種來源、操作人、技術負責人、檢驗記錄、菌種流向等內容。生產檔案應當保存至菌種售出後2年。

F. 食用菌栽培有哪幾種方法

微生物的培養方法有三種，即純培養法、選擇性培養法和優勢培養法。
一、 菌種製作的基本設備
1、 食用菌菌種製作的工藝流程 培養料的貯備和預處理------- 容器、工具的洗滌------ 配料、培養基製作------ 滅菌------ 冷卻------ 接種------ 培養------- 貯存 2、 基本設施 ① 廠房：② 原料庫③原料預處理場地④ 洗滌室：5配料室⑥ 滅菌室⑦ 接種室⑧ 化驗室 ⑨ 培養室⑩貯存室 二、 純種分離 菌種的分離方法主要有：孢子分離法、組織分離法、基內菌絲分離法和土中菌絲分離法。
1、 孢子分離法：屬有性繁殖。對於香菇、平菇異宗結合的菇類，為避免產生單孢不孕現象，必須採用多孢分離法。單孢分離法主要用於雜交育種的研究。
⑴ 種菇的選擇和處理 種菇選擇的標准：必須純正，具有本菌株性狀，發育健壯，無病蟲害，成熟度適當。種菇選定後，首先除去附著在菇體表面的雜物，如蘑菇、草菇可用0.1%升汞浸泡消毒2-3分鍾，然後用無菌水漂洗3次，以洗除表面附著的葯物，最後用無菌紗布吸干水分。香菇、平菇可用75%酒精進行表面消毒。
（2）多孢分離法 ① 整菇播種法② 鉤懸法③ 貼附法 4菌褶上抹取孢子法⑤ 孢子印分離法 ⑥ 空中孢子捕捉法
（3）單孢子分離法 一般採用方法：平板稀釋法、連續稀釋法、毛細管法等。
2、 組織分離法
（1） 子實體分離法
（2）菌核分離法
（3）菌索分離法：對一些不易找到子實體及菌核的菌類
3、基內菌絲分離法 對於子實體只有在特定的季節下出現，平時不易採到，或子實體小而薄或呈膠質狀態
（1）菇木（或耳木）分離法 在食用菌繁殖旺盛期
（2） 代料基質分離法 分離前，選擇一批子實體發生早、產量高、菇體尚幼嫩且生活力強而無病蟲害的栽培袋，待子實體將近成熟時，去掉子實體，然後用75%酒精將培養袋進行消毒後，在培養料下1.5cm處挑取0.3cm的培養料小方塊組織，接入試管培養基的中央，置於恆溫下培養。
3、 土中菌絲分離法： 用於採集生長在土中的菇類菌絲體
三、制種技術 採用孢子分離、組織分離和基內菌絲分離等方法分離培養而獲得的純菌絲，經過原種的擴大培養和母種、栽培種的製作，即可作為食用菌生產用的菌種。
1、 菌種的類型 母種、原種、生產種
2、 培養基的種類 天然培養基、合成培養基、半合成培養基
3、 原種製作 從擔孢子或菇體組織直接分離培養獲得的原種或引進的原種
4、 母種及生產種製作 將原種菌絲體移植到由糞、草、木屑、棉籽殼或麥粒等原料配製成的培養基上，而製成的菌種稱母種。將母種再擴大繁殖製成的菌種，稱栽培種或生產種。
5、 培養基滅菌
（1）高壓蒸汽滅菌法 瓊脂培養基採用1.05kg/cm2 壓力，溫度121℃ ，滅菌45-60分鍾；母種和栽培種固體培養基採用1.2-1.5kg/cm2 壓力，溫度123-129℃ ，滅菌1-1.5 小時。 （2） 常壓蒸汽滅菌
6、 接種室消毒滅菌 熏蒸消毒法：甲醛與高錳酸鉀混合熏蒸法
（2）紫外線消毒：（3）石碳
酸滅菌
7、 接種 在無菌條件下，將原種或母種菌種移接到經過嚴格滅菌的培養基上，稱為接種。 8、 菌種培養
四、菌種保藏方法及復壯技術
1、 菌種保藏方法 菌種保藏的基本手段是採用低溫、冷凍、乾燥、減少供氧量等方法，終止其繁殖，降低其代謝強度，使之處於休眠狀態。

G. 常用的食用菌菌種分離方法有哪幾種各有何優缺點

1. 組織分離法：簡便、易成功，保持原菌種性狀，重復易退化，不適於耳類。

2. 孢子分離法：菌齡小，生命力強，變異率高。

3. 基內菌絲分離法

H. 食用菌制種技術的菌種保藏

一個優良菌株被選育出來以後，必須保
持其優良性狀，防止雜菌污染，才不致降低生產性能。因此保藏好菌種，對研究和生產食用菌都具有十分重要的意義。菌種保藏的方法有斜面低溫、沙土管、液體石蠟封藏、冷凍真空及液氮超低溫等。
斜面低溫保藏法
這是最簡單最普通的保藏方法，即將菌種在適宜的斜面培養基上培養成熟後，置於4—5'C的低溫下保藏，以後每隔2～3個月轉管一次。此法適用於除草菇外的所有食用菌菌種。草菇對低溫忍耐力差，它的菌絲體在5 0C下即易死亡，因此草菇菌種應保藏在lo～13'(2的環境中。若需置於4～5℃的低溫下保藏，應在草菇菌苔上灌注3～4mL的防凍劑。一般生產上，草菇多採用室內常溫保藏。
低溫保藏菌種的培養基一般用營養豐富的天然培養基，如馬鈴薯—葡萄糖—瓊脂培養基等。為防止菌種在保藏過程中產生酸過多，在配製保藏用培養基時需添加少許緩沖鹽，如磷酸二氫鉀(KH2P04)或碳酸鈣等。
斜面低溫保藏菌種雖然簡便，但保藏時間較短，需經常轉管，故容易發生退化現象。為了彌補這一缺點，在生產上，最好把斜面低溫保藏法與其他保藏法結合起來，以減少轉管次數。母種在第一次轉管時，盡量多移斜面試管，部分用第一次生產，取幾管作礦油保藏(或冷凍乾燥、液氮低溫保藏)，其餘則作為以後幾批生產用的母種，暫存於4～6'C低溫處，待低溫保存的菌種用完後(或超過儲存期後)，再從第一代礦油保存的菌種移出殖。這樣做能使每批生產使用的菌種都保持在前幾代的水平上，有利於菌種優良性狀的保持(圖3—1)。
液體石蠟保藏法
食用菌菌絲均可用石蠟保藏，一般可保存3年以上，但最好1—2年移接一次，即使不移接，室溫下可保藏6～8個月。用此法保藏的菌種不必置於冰箱內，室內比冰箱內保藏效果更好。
液體石蠟又名礦油，是一種導瀉劑，在醫葯商店有售。分裝於三角瓶中加棉塞封口，高壓蒸汽滅菌2～3次(每次30min)，然後經無菌檢查合格後方可使用。由於高壓蒸汽滅菌常有水蒸氣滲入，需在4'C溫箱或烘箱中烘烤8～10h，使水分蒸發。用無菌吸管將滅菌石蠟加入要保藏菌種斜面試管內，用量要高出斜面尖端約lcm。將棉塞齊口剪平，再用蠟密封管口。
使用礦油保藏菌種時，不必倒去礦油，用接種工具從斜面上取一小塊菌絲先在無菌水
中洗滌，然後移接於斜面培養基上即可。原母種可重新封口繼續保藏。
沙土保藏法
此法是將食用菌孢子保藏於乾燥的無菌沙土中，保藏期為2一10年。具體方法如下：
1．取河沙過篩(60～80目篩子)，除去大沙粒，用10%的鹽酸浸泡以除去有機物。鹽
酸用量以淹沒沙面為宜。浸泡2～4h後，倒去鹽酸，用水洗幾次，直到接近中性，烘乾或曬
干。
2．沙與土比例以2 ：l～4 ：1為宜，沙過多影響菌種保藏質量，土過多時易結塊，接
種後抽干困難。
3．把干沙、土按比例混合壓裝於安瓿管或小試管，裝入量以0.5～lcm為宜，加棉塞，
高壓蒸汽滅菌(壓力在0．15MPa)滅菌3次，每次30min，乾熱滅菌(160℃，2h)。待無菌檢
查合格後(取少許干沙土放入牛肉湯培養液中，無菌生長)方可使用。
4．用接種環將孢子接於沙土管中拌勻即可。或將孢於接於5mL無菌水的試管中，
充分播勻成孢於懸液，然後用lmL無菌吸管吸取孢子懸液加入沙土管中(每管加0.2mL)
即可。
5．將接種後的沙土管置於盛有乾燥劑(生石灰、氯化鈣或硅膠)的容器內，接上
0．5KW的真空泵抽氣約8h，使沙土基本乾燥。
6．經抽樣檢查，證明無雜菌生長，即可封口進行保藏。
四，真空冷凍乾燥保藏法
此法是採用真空、乾燥和低溫三種手段來保藏菌種，因此菌種保藏期長達10～20年 後仍不降低其原有性能。
冷凍乾燥保藏的基本方法是將需要保藏的孢子懸液裝在特製的安瓿管中，然後驟然 冰凍，並立即抽成真空，使培養物以固體形態升華脫水，熔封後在低溫或室溫下保藏。
試驗證明，用此法保藏蘑菇、香菇、側耳和金針菇等食用菌的孢子和銀耳的芽孢子3 年，全部存活，直至8年後仍有90%存活。可見用此法保藏食用菌孢子至少可存活8年。 但此法不能用來保藏不長孢子的菌類。
其他保藏方法
（一）液體超低溫保藏法
試驗證明，用一130～一196℃液體氮超低溫冰箱能保藏所有食用茵菌種，包括一些不 能用冷凍乾燥保藏的菌種，甚至「怕冷」的草菇以10%甘油和5%～10%二甲基碸做保護 劑，居然也能在超低溫冰箱中保藏。由於超低溫能使代謝水平降到最低限度，因此菌種基 本上不發生變異。
在啟用液氮超低溫保藏的菌種時，應先將安瓿管置於35～40℃的溫水中，使管中的 冰塊迅速溶解，然後再啟安瓿管，取懸浮的菌絲塊移植在培養基上活化培養。
（二）菌絲球生理鹽水法
先將食用菌菌種用液體振盪培養3～7天，然後將形成的菌絲球吸入裝有5mL無菌 生理鹽水的試管中，每管約移人4—5個菌絲球。試管用無菌橡皮塞塞上，並用蠟封口，置 室溫或4℃下保藏。一般可保藏1～2年。
（三）麥粒菌種保藏法
麥粒菌種保藏法是利用麥粒作培養料。用於保藏菌種的麥粒，含水量在25%左右， 這樣的麥粒，在滅菌後種皮不破裂。製作方法；先將小麥浸水5h，濾去水後晾乾麥粒表面 的水分，裝入小試管，裝入量為試管高的l/3；高壓蒸汽滅菌(壓力0.15MPa)滅30min；冷卻後接人孢於液或菌絲懸浮液，搖勻後置於適溫培養。當試管中的麥粒發滿菌絲後，放人 裝有氯化鈣的乾燥器內，進行抽氣乾燥，乾燥後，將乾燥器放於低溫(20℃以下)處保藏。 此法保藏菌絲，經1～2午後，再接到培養基上，菌絲生長仍然良好。

I. 常用的菌種保存方法有哪些

菌種保藏是食用菌產業的一項基礎工作，是確保野生種質資源基因留存和現有生產用種遺傳性能相對穩定的必要手段。菌種保藏的方法多種多樣，有的雖然保藏效果好，但投資高或操作繁雜。在生產實踐中，更需要設備投入少，能保障菌種不死亡、不污染、最大限度地保持優良種性的簡便方法，如斜面低溫短期保藏和自然基質較長期保藏相結合的方法。

一般而言，對母種進行長期保存，對原種進行短期保存。須保證優良菌種的性狀和活力不發生變異，不死亡，不被污染，確保其純度。因此，保存方法應具備取材容易、操作方便、菌種不易退化、長期保存不污染雜菌等優點。常用的菌種保存方法如下：

（一）斜面低溫保藏 該法的優點是保藏方便且所佔空間較小。具體做法是：菌絲長滿斜面後，放在0～5℃保存。以後每隔一定時間（2～3個月）轉管一次。轉管保存不能長期用PDA培養基，否則種性易退化，灰樹花降解木質纖維素的能力減弱。因此隔一定時間（1年左右）須把菌種轉接到木屑培養基上復壯，之後挑選健壯無污染的菌絲再轉回PDA培養基保存。在長期保存過程中，要防棉塞受潮滋生雜菌。菌種試管口最好用蠟燙封，以防培養基內水分過快蒸發。增加瓊脂用量（2.5%～3%）可減緩水分蒸發。還要防止菌種管上的標簽脫落而造成種系混雜。

斜面低溫保藏方法簡便易行，能隨時觀察保藏菌株的活力和純度，一旦染雜，肉眼能及時發現。

（二）自然基質保藏 此法是根據灰樹花的特性，利用自然基質保藏其菌種的方法。灰樹花是木腐菌，可以採用以木屑為主料的培養基。自然基質營養全面，且大部為緩釋養分，不易產生營養過剩或飢餓；其次，培養基理化性狀好，可吸收或緩沖菌絲代謝出的有害物質，水分與通氣協調平衡，部分菌絲扎入基質內生長，不裸露於空氣中，菌絲呼吸強度低，生命力強。

1.原料與配方 粗、細木屑比例適當，採用板栗樹木屑最佳，粗木屑粒徑為2毫米左右，細木屑為一般圓盤鋸屑，粗、細的比例為1∶2，添加干木屑重量20%的麩皮和1%的糖，含水率為60%左右。這樣的基質通氣性好，營養豐富且供菌絲分解利用的時間長，長到基質內部的菌絲比包裹在基質外部暴露於空氣中的菌絲耐受性強。不同粒徑的基質比例適當，還能協調氣與水的矛盾。粗粒過多，架空菌絲多；細粒過多，透氣性差，菌絲生長慢。應用配方如下：

栗木屑78%，麩皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，裝入較粗大的試管中，裝料量為試管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2滅菌1.5小時。冷卻後，接入需保藏的菌種，在28℃下培養，待菌絲長滿木屑培養基時取出換上無菌橡皮塞，在0～5℃冰箱內保藏1～2年轉管一次。

2.容器與裝量 採用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗潔凈，裝量一般不超過玻璃瓶容量的3/5，填料不能過滿，瓶壁所殘留的顆粒須擦拭乾凈，否則保藏的菌種易引起污染。

3.滅菌和冷藏 滅菌時若採用棉塞封口，基質表層易失水，接種成活率低，即使菌絲復活，生長也很緩慢，所以最好採用聚丙烯膜封口，接種後換用無菌棉塞培養，待菌絲長滿後再換成有孔滅菌膠塞冰箱保藏。

用上述方法保藏的菌種經3年貯放後，接出成活率均達90%以上，出菇驗證產量及子實體形態特徵均無明顯變化。因此，自然基質保藏法具有保存期長，菌種遺傳性能相對穩定的特點。

（三）木粒PDA斜面保藏 灰樹花在自然狀態下易發生於栗樹根部，這說明其營養需求較為特殊。根據灰樹花這種習性，在PDA基礎上添加適量的栗樹木粒製成母種培養基。在多年的使用中發現，用該培養基培養的母種生長勢好，在轉接原種時，適應能力強，萌發定植快；用作菌種保藏基質時，保藏時間長，並能很好保持菌種的優良性狀。

1.木粒PDA的製作 選取栗樹邊材，加工成0.3～0.5厘米的顆粒，及時烘乾或曬干備用。稱取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解於1升清水中配製成營養液。將營養液倒入盛有木粒的小鋁鍋中，營養液以完全浸沒木粒為准。煮沸10分鍾，以加快木粒對營養液的吸收速度，起鍋靜置30分鍾讓木粒吸足營養液。撈出木粒，瀝掉表面的水，裝入試管，裝量為試管長的1/6，最多不得超過試管長的1/5，否則在擺制斜面時，不易使木粒均勻分散於斜面的表面上。

選取新鮮的馬鈴薯，去皮並切成薄片，稱取200克放入小鋁鍋中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁熱過濾取汁，並補足1升的體積。稱取瓊脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先將瓊脂剪碎，加入到馬鈴薯濾液中，繼續用文火加熱，使瓊脂溶化。待瓊脂完全溶化後，加入稱好的其他3種營養成分，攪拌使這些物質溶解均勻，趁熱裝入已裝有木粒的試管中，裝至試管長的1/3處，塞上棉塞。

在0.8～1千克/厘米2蒸氣壓下滅菌40分，待氣壓降至0時，開蓋取出，趁熱輕輕抖拍試管，使木粒分散後即可擺制斜面，並使木粒呈半裸狀分布於斜面上，待凝固後便製成了木粒PDA培養基。

2.生長及保藏效果 木粒PDA斜面上培養的灰樹花母種，菌絲生長迅速、良好，12天即可長滿試管，但菌絲的後期生長勢更為粗壯、濃密，後勁足。轉接原種時，菌種適應力強，定植快。這表明，灰樹花菌絲的生長速度、生長勢不僅取決於本身的遺傳性，而且很大程度上取決於培養基的營養。常規PDA的營養成分，主要是可溶性的速效性營養，前期營養豐富，營養利用直接，因而前期菌絲生長迅速、良好，後期營養則不足，菌絲生長不良，長勢欠佳。木粒PDA由於在增添了木粒這一緩效性營養，就木腐性的灰樹花而言，營養配伍合理，補充了菌絲生長後期所需的營養，因此後勁足。

菌絲體對基質的分解利用是通過菌絲細胞分泌的胞外酶，將基質中的大分子營養分解成小分子營養後才被吸收利用的，而這些胞外酶大多為誘導酶，其合成與分泌受基質的誘導和分解產物阻遏機制調節。就纖維素酶而論，許多易代謝碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同時伴隨著菌絲體的旺盛生長，酶的大量合成則出現在易代謝碳源基本耗盡之後，且受到基質纖維素的誘導，常規PDA基質，到葡萄糖等易代謝碳源基本耗盡的後期，由於營養的缺乏，菌絲生理機能下降，酶的合成量減少。而木粒PDA不僅含有易代謝碳源——葡萄糖，又含有木粒這一緩效性營養，前期葡萄糖促進了菌絲體旺盛生長，獲取了大量的菌絲體，表現為菌絲粗壯、濃密。到了易代謝碳源耗盡的後期，木粒一方面補充了後期所需的營養，使菌絲的生埋機能維持在一定的水平；另一方面木粒的纖維素激活菌絲細胞纖維素酶的誘導機制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰樹花較強的分解木材的能力，因此，用該培養基培養的母種在轉接原種時適應力強，萌發定植快。因部分菌絲長入木粒內部，抵抗不良環境的生存能力增強，種質不易退化。木粒PDA灰樹花菌種，在0～5℃保藏2～3年再轉管活化，成活率仍達到90%左右。此外，木粒PDA應用於木腐性灰樹花種的提純復壯，效果也較理想。

（四）石蠟隔氧封藏 具體做法是將液態石蠟分裝入三角瓶內，裝量達瓶空間的1/3，塞好棉塞，於121℃滅菌2小時，然後置40℃溫箱中，使其水分蒸發，或置於乾燥器內數日以除去水分，石蠟呈透明狀為宜。在無菌條件下，用無菌吸管裝入已長好菌絲的斜面試管，使液面高出斜面頂部1厘米左右。塞上無菌橡皮塞，豎直保存。此法可使菌種存活3年以上，但以1～2年移植一次為好。移植時不必倒出石蠟，用接種鉤取一塊菌絲即可。因轉移時帶有石蠟，菌絲生長弱，需要再轉管1～2次，方能復壯。