elisa常用方法

『壹』 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

• 也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，操作步驟如下：

• 
  

• 1） 將特異性抗體與固相載體聯結。RF是一種自身抗體，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

• 
  

• 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇。

• 
  

• 2;夾心復合物"，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去，以提高試驗的特異性.間接法測抗體

• 
  

• 間接法是檢測抗體常用的方法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。

• 
  

• 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，測知標本中抗原的量，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。

• 
  

• 3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。

• 
  

• 4.競爭法測抗體

• 
  

• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質;（conjugate）：

• 
  

• 1）將特異性抗原與固相載體聯結，故稱為間接法。操作步驟如下，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。此法中受檢標本不需稀釋。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

• 
  

• 5.競爭法測抗原

• 
  

• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，應注意可測范圍的最高值，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質;（immunosorbent）、ayr，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.雙抗原夾心法測抗體

• 
  

• 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

• 
  

• 1.雙抗體夾心法測抗原

• 
  

• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果、adw，固相載體上只留下特異性抗體；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"：（1）固相的抗菌素原或抗體，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，在檢測過程中標本須先行稀釋（1。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

• 
  

• 4）加底物顯色

• 
  

• 本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

• 
  

• 間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，可直接用於測定，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

• 
  

• 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

• 
  

• 3） 加酶標抗體。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，已被列為這類試劑的一項考核指標。

• 
  

• 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。

• 
  

• 3。

• 
  

• 4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色、AFP。

• 
  

• 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，尋找合適的標記方法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，試驗中也發生假陽性反應:40~1:200）。IgG的吸附性很強，即"免疫吸附劑"，例如HBsAg，但應盡可能予以純化。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，從而消除RF的干擾。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。競爭法測抗體有多種模式，因此其敏感度相對高於間接法；（3）酶反應的底物、ayw4個亞型，因其不能形成兩位點夾心，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

• 
  

• 2）加稀釋的受檢血清、HBeAg，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

• 
  

• 2） 加受檢標本、葯物等ELISA測定多用此法。

• 
  

• 6.捕獲包被法測抗體

• 
  

• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。

• 
  

• 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

• 
  

• 7.ABS-ELISA法

• 
  

• ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性

• 
  

『貳』 ELISA方法的優缺點

• ELISA方法：操作簡單、快速、敏感性高、特異性強、實驗設備要求簡單、應用范圍廣泛、無放射性污染、能定性及半微量、微量、超微量定量分析，是目前應用最廣，發展最快的酶免疫學技術方法。

• 
  

• 競爭法：可測Ag，也可測Ab，特點是：結合於固相的酶標Ag/Ab量與受檢Ag/Ab的量是呈反比的。

• 
  

• 夾心法：是測Ag最常用的方法，特點是：非競爭結合反應，適用於分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，不能用於小分子半抗原的檢測。

• 
  

• 間接法：是測Ab最常用的方法，特點是：敏感性高、酶標抗抗體具有通用性，即制備一種酶標抗抗體可以用於測定，一個種系內各種抗原的相應抗體。

• ELISA實驗所有方法的缺點很明顯：

• 1、重復性不好；

• 2、收自身抗體、嗜異性抗體等干擾，易出現假陽性；

• 3、不論儀器和手工操作，干擾因素較多。影響最大的是溫度和時間。

『叄』 ELISA法的分類

夾心法

夾心法常用於檢測大分子抗原，一般之操作步驟為:

將具有專一性之抗體固著（coating）於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘抗體

加入待測檢體，檢體中若含有待測之抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結

洗去多餘待測檢體，加入另一種對抗原專一之一次抗體，與待測抗原進行鍵結

洗去多餘未鍵結一次抗體，加入帶有酵素之二次抗體，與一次抗體鍵結

洗去多餘未鍵結二次抗體，加入酵素受質使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果

間接法

間接法常用於檢測抗體，一般之操作步驟為：

將已知之抗原固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘之抗原。

加入待測檢體，檢體中若含有待測之一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結。

洗去多餘待測檢體，加入帶有酵素之二次抗體，與待測之一次抗體鍵結。

洗去多餘未鍵結二次抗體，加入酵素受質使酵素呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。

競爭法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用於檢測小分子抗原，其操作步驟為：

將具有專一性之抗體固著於塑膠孔盤上，完成後洗去多餘抗體

加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結

加入帶有酵素之抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結，由於塑膠孔盤上固著的抗體數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酵素之抗原可鍵結的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結，即所謂競爭法之由來。

洗去檢體與帶有酵素之抗原，加入酵素受質使酵素呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下之帶有酵素的抗原越少，顯色也就越淺。

當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著於孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。

『肆』 如何正確進行ELISA操作

臨床ELISA測定現通常為採用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑准備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現分述如下。 一.臨床標本的收集和保存 用於ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨床上使用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療葯物等。對用於激素和治療葯物測定的血清標本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現：生長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內採取數份血樣本，以其中間值為測定值。又如當從卧位變為站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療葯物的檢測，應根據葯代動力學選擇服葯後的最適時間抽血檢測。用於傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面： （1）要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附於固相，從而與後面加入的HRP底物反應顯色。 （2）樣本的採集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用；二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。 （3）血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。 （4）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振盪，反復顛倒混勻即可。 （5）標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉澱後取上清檢測。 二、試劑准備 在臨床實驗室，對試劑准備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響後面溫育時間不夠的問題，其直接的後果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的准備最為關鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鍾以上後，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在後面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配製，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨時配製。 三、加血清樣本及反應試劑 在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是唯一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的准確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的加入在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現重復滴加或加在兩孔之間的現象，這樣就會在孔內的非包被區出現非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。 四、溫育 溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。 溫育這一步是臨床ELISA測定中最容易出現問題的步驟。通常目前國內ELISA商品試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鍾～1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時才能有較完全的結合，低於1小時，可能會影響測定下限。因此，關於溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點： （1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。一般來說，加完樣本和/或反應試劑後，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個問題，就是在每一年的冬季總有那麼一個多月的時間，在做HBsAg測定的室內質控中，測定由衛生部臨床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽性樣本時，總是測不出來，不知原因為何？這可能就與南方冬天室內溫度較低有關，此時微孔板轉入溫箱後37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱後需要多長時間孔內溫度才能達到37℃，從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。 （2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時，另一種則為43℃下45分鍾。從免疫測定的抗原抗體反應的本質來看，在較低的溫度下反應較長的時間最為完全。如2～8℃下反應24小時。較高的反應溫度，由於分子運動的加憐惜，反應時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。 （3）「邊緣效應」的排除。以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發現有「邊緣效應」，即外周孔顯色較中心孔深，產生這種「邊緣效應」的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學特徵的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置於37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除「邊緣效應」，並且可提高測定的重復性。 總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可採用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量採用水浴，溫育中讓微孔板浮於水面上，或將浸透水的沙布放入一大飯盒中成一濕盒，放於溫箱中，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內的高溫度，而使反應溶液的溫度迅速與溫室平衡。 五、洗板 固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合於固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對於ELISA測定來說，也是極其關鍵的一步。以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機理是，藉助其疏水基團與經疏水性相互作用被動吸附於聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結合作用下，促使蛋白質脫離固相而進入液相，這樣就可達到去掉非特異吸附物的目的，但由於抗體或抗原的包被通常也是通過在鹼性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附於固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中Tween20濃度高於0.2%，可使包被於固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗的測定下限。 在臨床實驗室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。手工洗板即是在每次反應溫育後，將反應液吸出或甩干，然後在板孔中加滿洗液，放置2～3分鍾後，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。重復上述洗滌步驟3～4次，最後在吸水紙上拍干，即可進行下一步測定操作。洗板機洗板則是將上述手工操作改由洗板機進行，使用洗板機洗板的一個特點是，每次洗板後不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機洗板至徹底所需的次數要少於殘留量大的洗板機。在特定臨床實驗室所使用的洗板機，到底洗中國次能達到要求，可進行下面這個簡單的實驗：選擇4×8 HBsAgELISA包被板條，每2×8孔分別加入相同一份弱陽性和一份陰性樣本，按試劑盒說明加入酶結合物並完成溫育後，洗板孔時按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物顯色測定，如洗3次後，顯色不再改變，即洗3次的板孔比色測定與4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，陽性/陰性值保持最大不變，則可以認定該實驗室所用洗板機3次洗板即可達到要求。 六、顯色 在目前的以HRP作為標記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配製。一般商品試劑盒顯色反應條件為37℃或室溫反應15～30分鍾。從理論上說，37℃30分鍾才可以使HRP的底物催化反應完全，盡管在最初的10分鍾內，絕大部份催化反應即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應25～30分鍾後，終止反應比色測定。 此外，在加入底物開始顯色反應前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴於清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現，如有，則說明底物已變質。以OPD為底物，配好後應為無色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應過程無需避光，而以OPD為底物，則需避光進行。關於TMB和OPD的顯色反應特點及注意點可參考前面有關章節內容。顯色反應完成後，加入酸終止反應，振盪混勻後即可進行下面的比色測定或肉眼判斷結果。 七、比色 ELISA的比色測定由酶標儀進行，有的同行可能會認為，既然由酶標儀進行，那麼此時便可以萬事大吉了，其實不然，因為當代較為先進的酶標儀器儀表，均有較多的功能，使用不當，會得到令人難以理解的結果。如使用酶標儀比色測定後，有許多陰性測定孔的吸光度值為負數或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標儀所致。至於如何正確理解和使用酶標儀詳見後面有關章節。此處，只是強調下面兩點： （1）比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否已調至合適或所用濾光片是否正確。由於有的臨床實驗室在進行ELISA測定時，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，後者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。 （2）單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最後酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優點，一般不必設空白孔。如在使用雙波長比色時，仍設空白孔，就可能會造成前面提到的測定孔吸光度為負數的現象。由於ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。 八、結果判定 臨床ELISA測定按其表示測定結果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對標本中是否含有待測抗原或抗體作出「有」或「無」的結論，分別用「陽性」和「陰性」來表示。可見定性測定通常是用於傳染性病原體的抗原或抗體的測定，以判斷特定病原體感染的存在與否。而定量測定則是對標本中待測抗原的中國進行量值測定，以具體數值表示。定量測定基本上是用於非病原體抗原物質的測定，如激素、細胞因子、腫瘤標志物、小分子葯物等。目前國內在臨床上應用的ELISA試劑盒絕大部份是用於傳染性病原體的抗原或抗體的定性測定，也有少部份用於αFP、hCG、細胞因子等的定量測定。ELISA定性測定的「陽性」和「陽性」的判定依據是試劑盒所確定的陽性判定值（Cut-off）。定量測定的「量值」依據是試劑盒中所帶標准品同時測定得出的劑量反應曲線（又稱標准曲線）。有關ELISA定性和定量測定結果的數據處理後面將有專門章節討論。本處只想強調的一點是，ELISA定性測定的「陰性」和「陽性」結果的判定依據只能是試劑盒本身所確定的Cut-off值，而不能以衛生部臨床檢驗中心供應弱陽性定值質控血清。為什麼要強調這一點呢？主要是因為以前有很多基層實驗室均使用部中心供應的弱陽性定值質控血清（以前也稱「臨界值」血清）的測定吸光度來判定結果，高於其判為陽性，反之為陰性，而不管試劑盒Cut-off值為何。到目前為止，仍有一些實驗室在堅持這種錯誤的做法。試劑盒的Cut-off值的設立是建立在一系列科學試驗及統計學研究的基礎上的（詳見後述），而部中心供應的弱陽性定值質控血清主要是供臨床實驗室進行室內質控時使用。 下面再解釋一下在ELISA定性測定結果判定中常用的一些縮寫。 （1）S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標本)的簡寫，表示的是標本測定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡寫。除競爭抑製法外，其它ELISA定性測定模式中，當S/CO值大於或等於1時，標本的測定為陽性，小於1時為陰性。 （2）S/N或P/N：其中S同（1），N為Negative(陰性對照)的簡寫，P為Patient（患者）的簡寫。較早的試劑盒很多都使用S/N或P/N≥2.1為陽性判定標准，現仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無根本性區別，只不過是前者將陰性對照（N）的2.1倍視為Cut-off值而已。 九、結果報告及解釋 臨床ELISA測定結果的報告較為簡單。定性測定報陰性或陽性即可；定量測定則報出具體的數值。結果解釋比較起來要復雜的多，它要求實驗室技術人員對所測定的項目有較為全面的知識基礎。例如，對乙肝「兩對半」結果的解釋，不但要求檢驗者要知道不同的結果模式的臨床意義，而且必須對乙肝病毒的分子生物學、分子的變異及其對表型的影響有更深層次的了解。現在，檢驗不再是單純的實驗室測定，而已成為一門臨床醫學學科，即檢驗醫學，這就要求從事醫學檢驗工作的檢驗醫師，對所做的測定項目除了知其然，還要知其所以然，否則就難免為時代所淘汰。 綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結於下表。 臨床ELISA測定中可能會出現的問題及可能的原因 問 題 可能的原因（非試劑盒本身的原因） 1．弱陽性質控樣本檢測不出 溫育的時間或溫度不夠；顯色反應時間太短；所用配製緩沖液的蒸餾水有問題 2．測定的重復性差 （相同樣本兩次測定結果不一致） 這是典型的由測定操作引起的問題，包括 （1）加樣本及試劑量不準；孔間不一致； （2）加樣過快，孔間發生污染； （3）加錯樣本； （4）加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區； （5）不同批號試劑盒中組分混用； （6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致； （7）孔內污染雜物； （8）酶標儀濾光片不正確； （9）血清標本未完全凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現假陽性反應等。 3．白板 （陽性對照不顯色） （1）漏加酶結合物； （2）洗板液配製中出現問題，如量筒不幹凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。 （3）漏加顯色劑A或B； （4）終止劑當顯色劑使用。 4．全部板孔均有顯色 （1）洗板不幹凈； （2）顯色液變質； （3）加底物的吸光受酶污染； （4）洗板液受酶等污染

『伍』 測細胞因子含量常用的 elisa 方法為

有一個朋友來找我咨詢用流式檢測細胞因子的問題，他之前用ELISA 檢測細胞因子的話，發現樣本量需求很多，然而有些樣本量又比較少怎麼辦呢，那麼接下來我來對比幾種檢測細胞因子的優缺點，供各位大大們閱讀參考啦~

細胞因子（cytokine，CK）：是由免疫細胞（如單核、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等）和某些非免疫細胞（內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等）經刺激而合成（一般是免疫細胞）、分泌的一類生物活性物質分泌的蛋白質，在體內廣泛參與免疫調節及炎症反應、組織修復、刺激造血系統、刺激細胞的增殖與凋亡等重要生理活動，在抵抗外來病原及維持機體內環境平衡中均起重要作用。

細胞因子的作用方式：自分泌作用、旁分泌作用、內分泌作用。

細胞因子的作用特點：多效性、重疊性、協同性、拮抗性和雙重性。

根據產生細胞因子的細胞種類不同分類：白細胞介素（interleukin, IL)、干擾素（interferon, IFN)、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF)、轉化生長因子-β家族（transforming growth factor-β family, TGF-β family)、集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF)、趨化因子（chemokinefamily)、生長因子（growth factor,GF）等。

細胞因子的檢測方法一般分為生物學、分子生物學測定法及免疫學（重點介紹）

1、生物學測定法 其原理是根據細胞因子對特定的依賴性細胞株(即靶細胞)的促增殖作用,以增殖細胞中的DNA的合成或酶活性為指標,間接推算出細胞因子的活性單位,如對IL-1、IL-2等細胞因子活性的檢測。亦可根據某些細胞因子對特定靶細胞的殺傷效應或對病毒的抑製作用進行測定,如對腫瘤壞死因子及干擾素的生物活性測定。

2、分子生物學測定法 目前採用的技術有各種印跡法、斑點雜交、原位雜交和PCR等。通過檢測細胞內細胞因子的基因組成或mRNA量,推算出細胞因子的合成量。

3、免疫學檢測法 其基本原理是將細胞因子作為抗原進行定量檢測。如免疫斑點法、ELISA法、免疫印跡法和流式細胞儀等均已用於細胞因子的檢測。

細胞因子的檢測方法對比

1、酶聯免疫吸附實驗（ELISA）

原理：使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由於酶的催化頻率很高，故可放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

優點：避免特異性抗體直接標記，便宜。

缺點：所需樣本量多、每次僅能測定一項細胞因子、操作步驟和測定時間過長、酶聯反應所致的人工假象

2、流式細胞儀（CBA）

原理：利用微小、分散的顆粒捕獲液體待測物，並利用流式細胞儀檢測類似「三明治」的顆粒——待測物復合體所散發的熒光，從而測定待測物的數量。

優點：所需樣本量少、快速（實驗6-8h可以完成）操作簡便、靈敏度高、重復性好、高效（同一個樣品可以同時檢測多個因子）、安全、接近生物體的分析條件（全血檢測保留細胞及生化微環境更准確反應了體內狀況）。

『陸』 ELISA法的基本原理

它採用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然後通過酶與底物產生顏色反應，用於定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。
在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） ②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）
測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然後加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯物（標記物），此偶聯物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯物與固相載體上的抗原（抗體）反應結合後，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。
其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。

『柒』 elisa步驟

方法一：用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法：
1.包被：用0.05M PH9，碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鍾。
2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3.加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定後的稀釋度）0.1ml，37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4.加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鍾。
5.終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以「+」、「-」號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，於450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零後測各孔OD值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二：用於檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時，洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30～60分鍾，洗滌，最後一遍用DDW洗滌。其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6。

『捌』 elisa法檢測hbsag常用什麼方法

如果指的是ELISA的模式，那麼是雙抗體夾心法常用。

目的探討溫度、孵育時間、振盪對ELISA法檢測HBsAg的影響,以期進一步優化檢測條件。

方法採用HBsAg含量約為1ng/mL的血清標本，在4種不同條件(37℃振盪、37℃不振盪、25℃室溫震盪、25℃室溫不振盪)下的3個不同反應時間(10、20、30min)測定HBsAg，記錄吸光度值。

結果除10min37℃不振盪和25℃不振盪差異無統計學意義(P0.05)外，其餘各組差異都有統計學意義(P0.05)。結論37℃振盪20min為ELISA檢測HBsAg的較佳條件。

(8)elisa常用方法擴展閱讀：

ELISA檢測試劑盒應用定性夾心免疫檢測技術，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是中國型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強的肽段，分別來自於該毒株的開放閱讀框2和開放閱讀框3。

將樣品或標准品加入孔中並孵育，如果其中存在HEV IgM抗體，這些抗體就會與HEV 的多肽抗原結合，並固定在上面，洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。

『玖』 ELISA技術中，最常用來檢測抗原的方法是

正確答案:A
解析：ELISA技術中，最常用來檢測抗原的方法是雙抗體夾心法
。