制備轉基因動物常用的方法

A. 轉基因動物基因轉移方法

1. 哺乳動物的基因轉移技術主要通過顯微注射等手段，將改造後的基因或基因組片段注入受精卵或早期胚胎細胞，然後將這些細胞植入受體動物的輸卵管或子宮，以培育出轉基因動物。
2. 目前，常用的轉基因動物製作技術包括顯微注射法、反轉錄病毒法、胚胎幹細胞法、電脈沖法以及精子載體導入法等。顯微注射法因其高成功率而成為最常用的方法之一。
3. 制備轉基因小鼠的過程包括：首先，選擇適宜年齡的雌性小鼠，通過注射PMSG和HCG促進排卵，與雄性小鼠交配。次日，取出受精卵並培養。其次，在顯微鏡下選擇核清晰的受精卵，注入DNA溶液。最後，將2細胞受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的輸卵管中，完成轉基因小鼠的培育。
4. 轉基因動物是指將外源重組基因轉染並整合到受體細胞基因組中，使其表達外源基因的動物。轉基因動物表達系統包括外源基因、表達載體和受體細胞等。基因組的轉移是細胞核移植和動物克隆技術的基礎，同時也是合成生物學中人工合成與設計基因、全基因乃至基因組的轉基因技術的關鍵。

B. 轉基因動物的制備方法有哪些

根據外源基因導入的方法和對象的不同，製作轉基因動物的方法主要有顯微注射法、反轉錄病毒法、胚胎幹細胞（embryonic stem cell，ES細胞）法、電脈沖法、精子載體導入法等。

1、顯微注射

是最常用且成功率較高的方法。基因顯微注射法的特點是外源基因的導入整合效率較高，不需載體，直接轉移目的基因，目的基因的長度可達lOOkb（10萬個鹼基對）。

它可直接獲得純系，所以實驗周期短。但需要貴重精密儀器，技術操作難度大，並且外源基因的整合位點和整合的拷貝數都無法控制，易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應的性狀改變，重則致死。

2、反轉錄病毒感染法

該法整合率較高，目的基因不易破壞，多是單拷貝、單位點整合，適合於難以觀察到原核的禽類受精卵。由於病毒衣殼大小的限制，目的基因不宜超過10kb，否則影響活性和穩定。此外，病毒DNA可能影響外源基因在宿主動物的表達。

3、胚胎幹細胞法

胚胎幹細胞（ES細胞）指從囊胚期的內細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，具有發育全能性，能進行體外培養；擴增、轉化和製作遺傳突變型等遺傳操作。

本法外源基因整合率高，植入囊胚前篩選合適的轉化的ES細胞，克服了以前只能在子代選擇的缺點，並能充分利用分子生物學發展起來的各種先進方法，是很有前途的技術。缺點是不易建立ES細胞系。並且由於通過嵌合體途徑，所以實驗周期長。

4、電脈沖法

電脈沖法（electroporation）又稱電穿孔法，是將供體DNA與受體細胞充分混勻，在外界的高電壓短脈沖下改變細胞膜結構，使細胞膜產生瞬間可逆性電穿孔，從而使一定大小的DNA可以通過細胞膜進入細胞，運送到細胞核。

5、精子導入法

利用精子作為外源基因載體，藉助受精作用把外源基因導入受精卵，整合到受精卵的基因組中，稱之為精子載體導入法，是構建轉基因動物的一種新嘗試。

該法簡單、方便，依靠生理受帶過程，免去了對原核的損傷。但在實踐中成功率較低，對於精子是否可作為外源DNA載體也存在爭論。這項技術尚處在探索階段。該法可以將人工授精、體外受精與轉基因結合起來。

安全管理

在我國，先後頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》、《農業轉基因生物安全評價管理辦法》等法律法規。在管理范圍、安全性評價、管理措施等方面做了一系列規定，以確保使用安全。

轉基因技術正在領導一場新的農業科技革命。我國公眾對轉基因技術和轉基因食品還存在一些疑慮，應該採用多種形式進行普及生命科學知識的教育，使公眾對轉基因技術有一個較為科學的認識，主動地接受轉基因食品。使轉基因技術貼近民眾，造福於人類。

以上內容參考：網路-轉基因動物、網路-動物轉基因技術

C. 轉基因動物基因轉移方法

哺乳類動物基因轉移方法主要涉及將改建後的目的基因或基因組片段通過顯微注射等技術注入實驗動物的受精卵或著床前胚胎細胞中，隨後將這些細胞植入受體動物的輸卵管或子宮，以實現轉基因動物的產生。

當前，製作轉基因動物的技術手段包括顯微注射法、反轉錄病毒法、胚胎幹細胞法、電脈沖法以及精子載體導入法等。其中，顯微注射法是最為常用且成功率較高的方法之一。

在轉基因小鼠制備過程中，具體步驟如下：

一、採集受精卵

• 超數排卵：選擇適宜年齡的雌性小鼠，通過注射PMSG和HCG促進排卵，隨後與雄性小鼠交配。雌性小鼠陰道栓的出現是交配成功的標志。


• 取受精卵：次日上午，剖殺雌性小鼠，取出輸卵管，置於培養液中。小心切開壺腹部，用酶液沖洗，分離受精卵至培養液。在顯微鏡下篩選出核清晰的受精卵，移入裝有培養液的胚胎培養皿，覆蓋礦物油並放入CO2孵箱培養。

二、向受精卵注入DNA溶液

通常向較大、能容納更多外源DNA的雄性原核注入DNA溶液。在瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA純度後，將含有受精卵和DNA溶液的培養液滴共同放置在載玻片上，固定在顯微注射儀的載物台上，通過吸管將DNA溶液注入雄性原核。為確認注入情況，觀察雄性原核是否膨大。隨後收集未受損的卵子，繼續在CO2孵箱中培養。

三、移植2細胞受精卵

選擇發育成2細胞的受精卵，移植到假妊娠雌性小鼠的輸卵管中，以完成轉基因小鼠的培育過程。

將外源重組基因轉染並整合到動物受體細胞基因組中，從而形成在體表達外源基因的動物，稱為轉基因動物。轉基因動物表達系統，包括外源基因、表達載體和受體細胞等，基因組的轉移則是細胞核移植和動物克隆技術，人工合成與設計基因、全基因乃至基因組的轉基因技術是合成生物學。