發光劑常用的標記方法是

『壹』 化學發光免疫分析技術的類型

化學發光免疫分析法以標記方法的不同而分為兩種:
(1)化學發游標記免疫分析法;
(2)酶標記、以化學發光底物作信號試劑的化學發光酶免疫分析法 從標記免疫分析角度, 化學發光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,
CL E IA ) , 應屬酶免疫分析, 只是酶反應的底物是發光劑, 操作步驟與酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體) 進行免疫反應, 免疫反應復合物上的酶再作用於發光底物, 在信號試劑作用下發光, 用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP) 和鹼性磷酸酶(AL P) , 它們有各自的發光底物。 常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲醯肼,lum ino l) , 或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲醯肼) , 是一類重要的發光試劑。魯米諾的氧化反應在鹼性緩沖液中進行, 在過氧化物酶及活性氧[ 過氧化陰離子(O 2- ) , 單線態氧(1O 2 ) , 羥自由基(OH·) , 過氧化氫(H2O 2) ]存在下,生成激發態中間體, 當其回到基態時發光, 其波長為425nm。
早期用魯米諾直接標記抗原(或抗體) , 但標記後發光強度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體, 進行免疫反應後利用魯米諾作為發光底物, 在過氧化物酶和起動發光試劑(N aOH2H2O 2) 作用下, 魯米諾發光, 發光強度依賴於酶免疫反應物中酶的濃度。Kodak Am erliteTM 半自動分析系統就是利用這一體系專門設計的。 (enhanced lum ines2cence enzym e imm unoassay, ELEIA )
在發光系統中加入增強發光劑, 如對2碘苯酚等, 以增強發光信號, 並在較長時間內保持穩定, 便於重復測量, 從而提高分析靈敏度和准確性。在全自動分析儀上, 還可通過計算機嚴密控制, 進行自動操作, 如加試劑, 混合, 溫育, 洗滌, 加發光試劑, 發光計數, 數據處理, 繪制標准曲線, 直至完成病人血清樣品的分析並列印出結果。Am erliteTM 發光增強酶免分析系統用熒光素、噻唑等增強劑, 其發光時間可持續長達20m in, 試劑盒有甲狀腺功能檢測的
促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白、游離甲狀腺素, 與性激素有關的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。 所用底物為環1, 22二氧乙烷衍生物, 這是一類很有前途的發光底物 , 用於化學發光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩定作用的基團——金剛烷基, 其分子中發光基團為芳香基團和酶作用的基團, 在酶及起動發光試劑作用下引起化學發光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2』2 sp iroadam an2tane ) 42m ethoxy242( 3』2 pho spho ryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名為: 32(2』2 螺金剛烷) 242甲氧基242(3』2 磷醯氧基) 2苯基21, 22環二氧乙烷)。在鹼性磷酸酶(AL P) 作用下, 磷酸酯基發生水解而脫去一個磷酸基, 得到一個中等穩定的中間體AM PD (半壽期為2～ 30m in) , 此中間體經分子內電子轉移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處於激發態的間氧苯甲酸甲酯陰離子, 當其回到基態時產生470nm 的光, 可持續幾十分鍾(如圖5)。AM PPD 為磷酸酯酶的直接化學發光底物, 可用來檢測鹼性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結合物。可檢測到鹼性磷酸酯酶的濃度為10- 15mo l?L 。
美國DPC 公司的Imm u lite 全自動酶放大發光免疫分析儀, 以鹼性磷酸酶為標記物, 以金剛烷作發光底物, 測定靈敏度相當於10- 21mo l?mL 的酶, 採用聚苯乙烯珠作載體, 其檢測水平已能達到10- 12g?mL。

『貳』 免疫分析方法有哪些

（1）放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）。RIA技術是使用以放射性同位素（如125I、32P、3H等）作標記的抗原或抗體，用γ－射線探測儀或液體閃爍計數器測定γ－射線或β－射線的放射性強度，來測定抗體或抗原量的技術。它包括以標記抗原為特點的放射免疫分析和以標記抗體為特點的免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。前者以液相競爭結合法居多，既測大分子抗原又測小分子抗原；後者以固相法測大分子抗原為主。

RIA在早期建立的農葯免疫分析方法中佔了很大比重，建立了狄氏劑、艾氏劑、2，4－D和2，4，5－T、對硫磷和百草枯等農葯的放射免疫分析法。盡管該方法靈敏度非常敏銳（RIA通常為10-9g、10-12g，甚至10-15g），應用范圍廣，但進行RIA需使用昂貴的計數器，也存在放射線輻射和污染等問題，因此在農葯殘留檢測領域的應用和發展受到了一定的限制，並逐步為其他免疫分析方法所取代。

（2）酶免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）。EIA是繼RIA之後發展起來的一項免疫分析技術。其檢測原理與放射免疫法類似，但所用的標記物為酶，它將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來，通過測定結合於固相的酶的活力來測定被測定物的量。用做標記物的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）和鹼性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GO）、脲酶（urease）等。酶標記反應的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多數採用96孔酶標板（MTP）作為固相支持物。這種板的檢測容量大，樣本數量多，只需有台簡單的酶標儀就可得出准確的檢測數據。也有學者採用磁珠作為固相材料進行EIA研究，其原理是將高分子材料（聚苯乙烯、聚氯乙烯等）包裹到金屬小顆粒（Fe2O3，Fe3O4）外面，再通過化學方法鍵合上氨基（－NH2）、羧基（－COOH）、羥基（－OH）等活性基團，再與抗體或抗原耦聯，製成免疫性微珠。該方法的優點是微珠比表面積大，吸附能力強，能懸浮在液相中快速均勻的捕獲樣品中的待測物，通過外加磁場後能夠實現微珠與樣品液的快速分離，從而減少檢測時間、提高檢測靈敏度。

由於酶標試劑制備容易、穩定、價廉，酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術，故近年來EIA技術發展很快，已開發了多種EIA方法。其中酶聯免疫法（，ELISA）是目前農葯殘留檢測中應用最廣泛的酶免疫分析技術。

（3）熒光免疫分析法（fluorescenceimmunoassay，FIA）。FIA檢測的基本原理是將抗原抗體的高度特異性與熒光的敏感可測性有機地結合，以熒光物質作為示蹤劑標記抗體、抗原或半抗原分子，制備高質量的特異性熒光試劑。當抗原抗體結合物中的熒光物質受到紫外光或藍光照射時，能夠吸收光能進入激發態。當其從激發態回復基態時，能以電磁輻射形式放射出所吸收的光能，產生熒光。繪制農葯濃度－熒光強度曲線，可以定性、定量檢測樣品中的農葯殘留量。

適用於抗體、抗原或半抗原分子標記的熒光素須符合要求：①應具有能與蛋白質分子形成穩定共價鍵的化學基團，或易轉變成這類反應形式而不破壞其熒光結構；②標記後，熒光素與抗體或抗原各自的化學結構和性質均不發生改變；③熒光效率高，與蛋白質結合的需要量很少；④熒光素與蛋白質結合的過程簡單、快速，游離的熒光素及其降解產物容易除去；⑤結合物在一般儲存條件下性能穩定，可保存使用較長時間。

（4）化學發光免疫分析法（luminescentimmunoassay，LCIA）。LCIA又可分為化學發光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLCIA）和生物發光免疫測定（bio-luminescentImmunoassay，BLCIA）。

1976年，Shroeder首先用生物素（B）－親和素（A）系統建立了均相化學發光免疫測定技術，爾後Halman和Velan又將其引伸到非均相體系，現已滲入到生物學研究的各個領域。其原理是以發光指示抗原與抗體的結合，當發游標記物與相應的抗體或抗原結合後，底物與酶作用，或與發光劑產生氧化還原反應，或使熒光物質（例如紅熒烯等）激發，釋放光能。最後用光度計測定其發光強度，進行定量分析。常用發游標記物有辣根過氧化物酶（HRP）、魯米諾（luminol）、異魯米諾（isoluminol）、咯粉鹼（lophine）、光澤精（lucigen）、雙（2、4、6－三氯苯）草酸酯、聯苯三酚和6[N-（4－二氨基丁基）－N－乙基]－氨基-2，3－二氫吩嗪-1，4－二酮（ABEI）等。用上述發游標記物標記的抗體（或抗原）在一定的pH緩沖溶液中與相應的抗原（或抗體）結合時，在協同因子（例如H2O2等）的作用下發光，其發光強度與被測物的濃度成正比，故可以用於定量分析。

發光免疫測定具有特異性強、靈敏度高（檢測限量達10-15mol/L）、快速（1～3h）、發光材料易得等優點。但其發光過程和強度常受到發光物質本身的化學結構、介質的pH、協同發光物質和金屬離子雜質等影響。

（5）金免疫層析分析法（goldimmuno-chromatographyassay，GICA）。GICA檢測原理是將配體（抗體或抗原）以線狀包被固化於硝酸纖維素膜等微孔薄膜上，膠體金標記另以配體或其他物質並以干態固定在吸水材料上，通過毛細作用，使樣品溶液在層析條上泳動，當泳動至膠體金標記物處時，如樣品中含有待檢受體，則發生第一步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物繼續泳動至線狀包被區時，發生第二步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物被截留在包被的線狀區，通過標記的膠體金而顯紅色條帶（檢測帶），而游離的標記物則越過檢測帶，與結合的標記物自動分離。通過檢測帶上顏色的有無或色澤深淺來實現定性或定量測定2。

2金標試紙條檢測

GICA法具有快速（5～20min）、廉價、結果明確、無需復雜操作技巧和特殊設備、攜帶方便等優點。但相對於其他免疫分析方法，該方法檢測靈敏度稍低，主要適合現場快速定性或半定量測定。目前該方法已被應用於醫學和生物學等眾多研究領域，尤其在發達國家已經得到了廣泛的應用。

（6）免疫分析與儀器分析技術的聯用技術。使用單一的IA技術進行農葯殘留分析獲得的信息量少，而理化分析方法的選擇性又比較差。Kramer等人將免疫分析法和液相色譜法（LC）聯合起來使用，從而簡化了分析方法，提高了檢測效率。LC-IA的聯用，將LC的高分離能力和IA的高靈敏性和高特異性融為一體。該分析法尤其適合多組分殘留分析和微量分析。免疫分析與氣相色譜/質譜（GC/MS）的聯用可減少結構相似的農葯或代謝產物分析中的交叉反應，以降低假陽性。

『叄』 化學發光免疫分析法有哪三類

1、化學發光免疫分析，是用化學發光劑直接標記抗體或抗原的一類免疫測定方法。目前常見的標記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學發光劑。標記物為吖啶酯（雅培）或者ABEI（新產業）；

2、化學發光酶免疫分析，是以酶標記生物活性物質進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用於發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶（HRP ）和鹼性磷酸酶（ALP ），它們有各自的發光底物。HRP 最常用發光底物是魯米諾及其衍生物 。標記物為鹼性磷酸酶（廈門波生）或者辣根過氧化物酶（強生）；

3、電化學發光免疫分析，電化學發光是指由電化學反應引起的化學發光過程。標記物為三聯吡啶釕（羅氏）。