蛋白質測序的常用方法

1. 蛋白測序技術有哪幾種

Sanger法：用於鑒定蛋白質和多肽的N－末端氨基酸殘基。
Edman降解：是氨基酸序列的測定技術，但是它不能測超過40個殘基的序列。

2. sanger 求蛋白質測序法的原理，越詳細越好！

sanger 法是指 用二硝基氟苯(DNFP)與多肽鏈上的 N端 氨基酸 的氨基反應 生成DNP-氨基酸 在酸性條件下水解 多肽鏈, DNP-氨基酸斷裂下來,其餘的是多肽鏈,然後通過紙層析DNP-氨基酸,確定是那種氨基酸.(當然某些氨基酸中的R基上氨基和羥基也可與 DNFP反應,但可通過有機溶劑除去).
ps 1953年 英國人sanger用測定了牛胰島素的氨基酸序列,聞名於世.

3. 常用的蛋白質含量測定方法有哪些

①凱氏定氮法
原理：蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉化為銨鹽，在強鹼性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最後用標准酸滴定硼酸，通過標准酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。
②雙縮脲法
原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在鹼性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵，故多肽、蛋白質等都有雙縮脲（biuret）反應，產生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質含量。
缺點：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg)，且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 准確度 較高，不受蛋白質的種類影響。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑（鹼性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在鹼性條件下，蛋白質中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+， Cu+能定量地與Folin－酚試劑反應生成藍色物質，600nm比色測定蛋白質含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg)，但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算：
蛋白質濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260為角標）
⑤色素結合法（Bradford 法）
直接測定法：利用蛋白質與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
考馬斯亮蘭（CBG）染色法測定蛋白質含量。CBG 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的CBG也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。
間接測定法：蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素，以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4』-二羧-2,2』-二喹啉）法與Lowry法相似，主要差別在鹼性溶液中，蛋白質使Cu2+轉變Cu+後，進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產生深紫色，在波長562 nm有強的吸收。
它的優點在於鹼性溶液中BCA 比Folin試劑穩定，因此BCA與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，並能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色，顏色的改變與蛋白質有定量關系，可用於蛋白質的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘)，則可追蹤該金屬。

4. 請教蛋白質質譜測序

蛋白質譜一般來講是用來對某個蛋白質進行鑒定的方法
而蛋白質測序實際上就是檢測蛋白質的多肽鏈數目，不一定要用到質譜技術

簡單說，蛋白質測序的方法有很多，一般是在構建完成後，通過測序來對比之前的預測的序列是否正確。
而質譜檢測一般是用在蛋白質表達純化完成後，用來鑒定是否是最初設計的那個蛋白。

5. 蛋白質測序的測序要求

●1 樣品必需純（>97%以上）；
●2 知道蛋白質的分子量；
●3 知道蛋白質由幾個亞基組成；
●4 測定蛋白質的氨基酸組成；並根據分子量計算每種氨基酸的個數。
●5 測定水解液中的氨量，計算醯胺的含量。

6. 蛋白質測序的測定步驟

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈藉助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).
2 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。
3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然後用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。
二硫鍵的切割與保護（元素後數字為下標）
a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆
－CH2SO3H
b、還原+氧化 不可逆
[ 巰基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等
－S-CH2-COOH
c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 + HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。
巰基（-SH）的保護

作用：這些反應(見右圖）可用於巰基的保護。
4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，並計算出氨基酸成分的分子比（如右圖）
5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端
多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。
6 多肽鏈斷裂成多個肽段。可採用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，並將其分離開來。
7 測定每個肽段的氨基酸順序
8 確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。
9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
一般採用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理後，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然後同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。

7. 蛋白質測序的概念

當前，所謂蛋白質測序，主要指的是蛋白質的一級結構的測定。蛋白質的一級結構(Primary structure)包括組成蛋白質的多肽鏈數目。很多場合多肽和蛋白質可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。
蛋白質氨基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現在已經知道約十萬個不同蛋白質的一級結構。

8. 蛋白質N端測序的測定蛋白質N端序列的方法

目前對蛋白N端測序主要分類兩大類，其一為非質譜技術，例如經典的Edman降解法、利用反轉錄RT-PCR得到對應蛋白的cDNA，再來反推得到蛋白序列；其二為質譜技術。各自都有其使用的長處和制約之處，目前，市面上採用的，依然是基於經典的Edman降解法原理，利用美國ABI公司Procise491蛋白序列測序系統進行蛋白N-端測序。

9. 蛋白質序列測定的原理與方法

網路"蛋白質測序"詞條下有詳細介紹
1肽鏈的拆開和分離
●2測定蛋白質分子中多肽鏈的數目
●3二硫鍵的斷裂
●4測定每條多肽鏈的氨基酸組成，並計算出氨基酸成分的分子比
●5N端、C端的測定
●6多肽鏈斷裂
●7測定每個肽段的氨基酸順序。
●8確定肽段在多肽鏈中的次序。
●9確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。

10. 蛋白質測序的介紹

所謂蛋白質測序，主要指的是蛋白質的一級結構的測定。蛋白質的一級結構(Primary structure)包括組成蛋白質的多肽鏈數目。很多場合多肽和蛋白質可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。