流式細胞儀使用方法

⑴ 如何用流式細胞儀分析熒光強度

流式細胞儀都是檢測相對熒光強度的。所以第一，一定要有對照。
有幾個常用的方法來分析：
1.
先用對照設置好閾值，然後分析各個組超過熒光強度閾值的百分數的變化
2.
如果沒有明顯的陽性，陰性閾值，可以比較整體的熒光強度的均值，中位數等等，具體採用哪個指標，要看實驗目的。

⑵ 流式細胞儀測定細胞周期各時相的原理和基本步驟（不用說具體使用的量）

在細胞培養液中加入模擬核苷酸EdU （比較老的方法也可以用BrdU）。培養一小時 後，更換為正常的培養液繼續培養。模擬核苷酸可以像天然核苷酸一樣被細胞攝取並整合入新合成的DNA。

培養一段時間後（一般小於一個細胞周期），固定細胞。根據所使用模擬核苷酸的不同，使用不同的方法。EdU，改變緩沖液的pH值，就會發出熒光。而BrdU則需用熒光抗體識別，需要對細胞膜和核膜進行通透處理。

再加入PI對DNA染色。

在二維坐標圖上，橫坐標設為線性PI熒光強度，縱坐標設為模擬核苷酸的熒光強度（log）。

典型的圖就像下面一樣：

G1, G2 和S期就按照圖中的劃分來做。G1期的細胞沒有新合成DNA，所以BrdU信號是陰性，而PI的信號位於1倍體期。S期是正在合成DNA，所以BrdU都是陽性。G2期是已經合成好了2倍的DNA，所以位於2倍體期，信號是G1期的一倍。這個圖中，G1 PI信號是300， G2就是600.

⑶ 如何用流式檢測細胞凋亡

前言

細胞凋亡通常稱為細胞程序性死亡，是由基因控制的主動性細胞死亡過程。越來越多數據發現，細胞凋亡與多種疾病密切相關，如癌細胞具有連續增殖、抵抗細胞凋亡能力，利用流式細胞儀分析細胞凋亡可為腫瘤診斷，療效評價和預後預測提供了重要的參考指標。然而很多實驗的同學們，常會碰到上機檢測時細胞死亡太多卻檢測不出凋亡，多次重復結果不一致等現象，本文就一起看看如何把細胞凋亡的數據變的更加漂亮，准確！

首先，明確一下細胞凋亡和壞死的區別

細胞凋亡(apoptosis) 是一件主動性細胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控，是細胞為更好地適應環境而主動爭取的一種死亡過程。 具體表現為： 出芽形成凋亡小體、核小體間DNA的切割，凋亡小體被吞噬和消化等幾個連續過程等[1]（如下圖所示）。

圖1：細胞凋亡的發生過程[1]

細胞壞死（necrosis） 則是一件被動的過程，是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程，即病理條件下，自體損傷的一種現象。 具體表現為： 細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，會引起局部嚴重的炎症反應（如下圖所示）。

圖2：細胞壞死的發生過程[1]

一、流式檢測細胞凋亡的原理

Annexin V和PI雙染法是流式檢測細胞凋亡的經典方法 ，它是基於凋亡的早期細胞膜上的磷脂醯絲氨酸（phosphotidylserine, PS）從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面這一原理來實現的（如下圖3）。

圖3：凋亡早期 PS從細胞膜的內側外翻

該方法簡便、快速、准確區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，具體原理如下：

因此，將Annexin V與PI聯合使用時，便可用來鑒別活細胞，凋亡細胞及死亡細胞。

二、實驗操作步驟

三、數據分析

Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針，FITC最大激發波長為488 nm，最大發射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。通過軟體分析，繪制雙色散點圖，FITC為橫坐標，PI為縱坐標。

如下圖所示：細胞可以分為4個象限：

圖4：4個象限的細胞分布圖

舉例：如常用於研究葯物或者基因等對細胞凋亡的影響。 通過比較Control組和葯物組，發現化合物可以誘導前列腺癌細胞系PC-3M的細胞凋亡，處理組（20μM）的晚期凋亡細胞比例與Control組（0μM）相比，從1.79%上升到11.39%。進而還可根據每個象限的數據計算出活細胞、凋亡細胞和壞死細胞百分率。

圖5. 葯物濃度梯度依賴性的誘導PC-3M細胞凋亡[2]

四、常見問題解答

1. 如何避免出現假陽性結果？

2. 為什麼必須收集細胞上清？

因為凋亡的細胞可能會脫壁，懸浮於培養基，所以必須收集上清再離心取沉澱，合並胰酶消化下來的細胞，不然檢測出來的凋亡比例可能會減少。

3. 為什麼在染色後1h內就要上機檢測？

由於細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色後1小時之內進行分析；PI受時間的影響很大，因標記了PI後會加大細胞毒性，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯加大，所以建議在一個小時內檢測。

4. 其他注意事項

參考文獻：

[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.

[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.

⑷ 如何用流式細胞儀分析熒光強度

熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激光激發後產生，發射的熒光波長與激發光波長不相同。每種熒光染料都有特定的激發波長，激發後又產生特定波長熒光。通過一些波長選擇通透性濾光片，可將不同波長的散射光、熒光信號區分開。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料可以利用流式細胞儀同時測定一個細胞上的多個不同特徵。

（一）熒光信號測量與放大器

線性放大器用於測量信號強度變化范圍較小的信號或具有生物學線性過程的信號，如前向散射光的測量與CD3+細胞DNA指數的測量。

對數放大器用於測量信號強度變化范圍較大且其光譜信號較復雜的信號，在免疫測量中最常使用。

（二）熒光補償

依靠濾光片是不能完全阻擋干擾信號，在每兩種熒光的發射光信號中仍有不可避免的重疊現象。該重疊區越大，信號檢測的准確性越差。通常採用熒光補償的方法來消除重疊信號，保證檢測信號的准確性。