㈠ 如何評估Real-time qPCR定量檢測(經驗總結）
一、Real-time qPCR定量方法
可以分為絕對定量和相對定量。
絕對定量是用一系列已知濃度的標准品製作標准曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標准曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標准品可以是純化的質粒DNA，體外轉錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。
相對定量可以分為比較Ct法和其他一些相對方法。比較Ct指的是通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,也稱之是 2-∆∆Ct 。
1. 絕對定量
Y=-3.432X+34.638;R2= 0.995, E=95%，所以可以進行數據分析。如果未知樣品的 Ct=25， 代入方程：25=-3.432X+34.638, 所以：X=2.8 Copies=10^2.8
2. 2-∆∆Ct定量
3. 其他定量方法
二、 影響Ct值的關鍵因素
1. 模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間。
2. 反應液成分的影響
任何分子的熒光發射都受環境因素影響—-比如溶液的pH值和鹽濃度。
3. PCR反應的效率
在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標准曲線。PCR效率取決於實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
三、如何評估實時定量PCR反應的效果
1. PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數量級倍數(5 logs)連續梯度稀釋模板濃度。
2.R2值：另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等於1，那麼你可以用Y值（Ct）來准確預測X值（量）。如果R2等於0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大於0.99時，兩個數值之間相關的可信度很好。
3.精確度: 標准偏差（standard
deviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值，那麼標准偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標准偏差就大。實際上，足夠多重復次數產生的數據組會形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變數在無限多時趨向於正態分布。如果PCR反應效率是100%，那麼2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標准偏差就必須小於等於0.167。標准偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標准偏差必須小於等於0.250。
4.靈敏度：無論CT絕對值是多少，任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數為1的系統都達到了靈敏度的極限。PCR效率是決定反應靈敏度的關鍵因素。在檢測極低拷貝數時的另一個重要的考慮因素是，低拷貝時的模板數量不能按普通情況來預期。相反，它會遵循泊松分布，即進行大量的平行重復，平均應該含有一個拷貝的起始模板，實際上約37%不含有拷貝，僅有約37%含有1個拷貝，約18%實際上含有兩個拷貝。因此，為了更可靠地檢測低拷貝，必須做大量的平行重復實驗來提供統計顯著性，並克服泊松分布的限制。