篩選單抗的常用方法

1. 抗原抗體反應的應用

（1）抗原：免疫動物是制備抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、細菌或者其他蛋白質抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必須與大分子載體連接。抗原的用量視抗原種類及動物而異，—次注射小鼠可以少至幾個微克，免、羊甚至更大的動物每次注射的量就相應增加，從幾百μg/次至幾mg/次。
〔2）佐劑及乳化：佐劑可以幫助抗原在注射部位緩慢釋放，以增加免疫刺激的效果。佐劑有完全和不完全佐劑之分。完全佐劑加有滅活的分枝桿菌（如卡介苗）或棒狀桿菌。福氏佐劑可從試劑公司購買，也可用羊毛脂和石蠟油按1：2—4混合自行制備。佐劑與抗原按1：1的比例混合乳化為均勻的乳液，放置後不會發生油水分離。
（3）免疫動物：常用於制備抗血清的動物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生產可用動物羊、馬等，動物接受免疫的乳液量小鼠為1．0—2．0 mL，家兔為2—4mL。抗原免疫動物的途徑取決於動物種類、抗原特性和是否使用佐劑。腹腔注射（i．p），肌肉注射（i．m），皮內注射（i．d．）和皮下注射(s．c．）適合於任何抗原，這些途徑主要刺激局部淋巴結發生免疫應答，初次免疫和免疫加強注射均可使用。靜脈注射（i.v.）則只適合於可溶性抗原及分散的單細胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發的免疫應答主要發生在脾臟。此外，在單克隆抗體制備時，亦可用脾臟直接注射或體外免疫方法，尤其對微量抗原比較實用。體外免疫方法也常用於人源單克隆抗體的制備。體外免疫時將脾細胞或外周血淋巴細胞（包括B細胞，T細胞及抗原遞呈細胞）與抗原一起作體外培養，然後再與骨髓瘤細胞融合。初次免疫後要經過2—3次以上的免疫加強以保證能形成較高水平的IgC抗體。兩次免疫注射之間的時間間隔，一般3—4周比較適合大部分動物，小動物可間隔10—14d，大動物則在2月左右。在免疫加強最後一次注射後的一周內採集抗血清，可獲得高水平的抗體。 （1）采血：加強免疫的動物2—3次後，可通過耳靜脈或眼球（小鼠）采血，進行抗血清效價測定。當效價達到理想的高度後，可以采血。采血方式可以從心臟直接取血，也可通過動脈放血。待血液凝固後用針筒或吸管吸取血清。
（2）抗血清的純化與保存：除抗體外血清中含有多種其他蛋白成分。為了避免這些蛋白質干擾抗體（免疫球蛋白）標記反應和抗原抗體反應，抗血清可經過純化以獲得單一的機體（常為IgG）組分。常用的純化IgG的方法為飽和硫酸胺鹽析和層析法。蛋白質在不同的鹽濃度的溶液中，其溶解度不一樣，鹽離子干擾蛋白質和水分子間氫鍵形成，因為水—鹽結合比水—蛋白質結合更穩定，蛋白質即可從溶液中沉澱出來。蛋白質分子越大，沉澱時所需鹽離子濃度越低。免疫球蛋白（Mr 1.5×105）比血清中主要蛋白質白蛋白（M r 6.7×104）的分子大得多，抗體在30%—50%飽和度的硫酸鹽中析出，而白蛋白需在70%—80%飽和度才析出，因此常用33%飽和度的硫酸胺純化血清中的IgG。鹽析時為了減少抗體變性，需在4℃進行，同時用pH8.0緩沖液稀釋抗血清，以減少蛋白濃度過高而發生共沉澱。銨鹽的溶解度不隨溫度變化而明顯改變，0℃和25℃僅差3%，而鈉鹽則相差5倍，因此常在低溫沉澱時用銨鹽，室溫沉澱用鈉鹽。銨鹽對抗體的標記反應（如FITC和biotin標記時）有一定的干擾作用。
鹽析法只能部分純化抗體，更高純度的抗體制劑可用層析法制備。IgM五聚體相對分子質量達9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子篩層析很容易將其純化。IgG在PH 8．0時帶負電荷，能與DEAE纖維素上的陽離子結合，因此可用離子交換層析來純化IgG。IgG純化最常用的方法為親和層析。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白具合高度的親和性，可用這兩種蛋白質交聯親和層析柱將IgG純化。大部分IgG與蛋白A結合PH為8—9，洗脫PH為2—4；而與蛋白G的結合PH為5—7，洗脫PH為9—10。C蛋白更適合於IgG的純化，不但反應條件為溫和的弱酸性或弱鹼性，並且與IgG的結合力高於A蛋白。G蛋自能與大部分動物種類的IgG結合，而A蛋白對小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、馬和綿羊IgG結合力弱或不能結合G蛋白和A蛋白均不能與雞IgG結合。
抗血清或純化的抗體在低溫保存可維持活性數年，反復凍融使抗體很快失活，被細菌或黴菌污染的抗血清或IgG製品也易失去活性。稀釋的抗血清加入防腐劑疊氮化鈉和保護劑如BSA等可於4℃保存。長期保存常用等量甘油於—20℃以下冷藏。也可置於 50%飽和硫酸銨中4℃保存，還可以冷凍乾燥保存。 根據不同目的制備的抗血清，對其中所含抗體的濃度，特異性及免疫球蛋白種類的要求也不一樣。為了獲得質量和數量上合符要求的抗血清，在收集動物血清前必須對免疫效果進行檢測，對收獲後的抗血清也必須對—些參數進行分析，如效價、親和力及交叉反應等。根據不同的抗原性質選用合適的檢測方法。最常用的為免疫沉澱，ELISA，放射免疫等。
效價又稱滴度（titer），是常用於表達抗血清中特異性抗體相對含量的—個半定量指標，即在給定的條件下，結合—定量抗原的抗血清的稀釋度。抗血清經一系列稀釋後（如倍比稀釋）與定量的抗原反應，以能檢測抗血清最大稀釋倍數即為該抗血清的效價。不同的檢測方法測定同一種抗血清的效價，靈敏度不一樣，抗血清的效價也不一樣，如沉澱反應（瓊脂雙擴散）與ELISA二者的效價相差甚大，後者遠高於前者。放射免疫分析（RIA）常用於標記小分子抗原來檢測抗血清的效價。
親和力（affinity）表示抗血清與相應抗原的結合強度，是描述抗體持異性的重要指標，
常用親和常數K表示。親和常數K與抗原抗體反應的平衡常數有關：
抗體特異性與交叉反應：抗體是特異的。只與相應抗原反應。實際制備的抗體卻常有非特異性反應，這是因為抗原不純造成的。多組分抗原之間存在共同的抗原決定簇，或者兩個抗原決定簇結構類似能與同一抗體結合，均可出現抗體與異源抗原的交叉反應。用瓊脂雙擴散能簡便直觀地反映不同抗原與同一抗血清，或不同抗血清與同一抗原的交叉反應。 原理1：單克隆抗體（MAb）與抗血清（又稱多克隆抗體，PAb）最主要的區別是MAb為單一種B細胞克隆所產生的一種均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B細胞克隆的標志，是一種獨特型的抗體，它的特異性是針對一個抗原決定簇的。制備單克隆抗體不能用化學分離的方法從多克隆抗體中去分離純化得到它，而是用分離產生抗體的B細胞克隆的方法得到它。為了使B細胞克隆能在體外人工培養下長期存活並產生完全均一的MAb，G．KÖhler合Milstein於1975年創立了雜交瘤方法。所以制備單克隆抗體的技術又稱雜交瘤技術（hybredoma technique）。
雜交瘤技術的基本原理是用分泌抗體但不能長期培養的B細胞與能在體外長期培養並可低溫保存的腫瘤細胞進行雜交。篩選得到的雜交瘤細胞應該是既能分泌抗體又有瘤細胞的特性，可長期傳代培養，又可在液氮中保存的細胞。把這些細胞單克隆化，用單克隆化的雜交瘤細胞進行單克隆抗體的生產。
原理：最常用的單克隆抗體是小鼠的單抗，此外也有大鼠的和人源的單抗。人源單抗制備比較復雜。小鼠單抗的制備通常是使用Balb/c小鼠的B細胞和它的骨髓瘤細胞。大鼠的單抗制備通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤細胞。B細胞是從免疫動物的脾臟中分離出來的。動物免疫方法與抗血清制備相同，只是在制備脾臟前3d必須進行一次靜脈加強注射以保證得到的B細胞有旺盛的分泌抗體的活性。骨髓瘤細胞有許多細胞株是經過誘變和篩選得到的缺陷型。篩選的標準是①瘤細胞本身不產生抗體或者產生抗體的某種鏈，但不能分泌；②是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。因為這種缺陷型的瘤細胞正常的核酸合成途徑被氨基喋吟（aminopterin）阻斷後，由於缺失這些酶，即使補充它的底物次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，結果導致瘤細胞死亡（圖7—2）。而雜交瘤細胞因帶有B細胞的全套基因，在HAT存在的條件下藉助於HGPRT和TK的作用通過替代的核酸合成途徑能正常合成DNA和RNA。所以雜交瘤能正常地生長繁殖而被選擇出來。未被融合的游離的B細胞只能存活3d而後自行死亡。這就是用HAT培養基進行選擇的原理。 （1）融合：細胞雜交之前，要分別准備好脾臟的B細胞懸液和小鼠骨髓瘤細胞（如SP2/0—Agl4細胞株）。免疫後的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細胞懸浮在沒有血清的培養液中（通常使用RPMIl640商品配製），並洗滌3次去掉小鼠的血清。SP2/0細胞是用加有10%胎牛或小牛血清培養的，每天更換新鮮培養液使成為對數分裂期生長旺盛的細胞。細胞用RPMIl640洗滌2—3次，把兩種細胞合並在同—試管中，用50%的聚乙二醇（相對分子質量為1000—1500）作為融合劑，在37℃條件下融合l—2min。然後用1640培養液緩慢稀釋，然後除去PEG，將細胞分散至HAT選擇培養板中。電融合方法也可用於單克隆抗體制備，雖融合率較高，但一次融合的細胞數少，且需專門設備，故限制了其廣泛使用。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例在5：1—10：1均可獲得滿意結果，每次融合細胞數量在10—10較為合適。融合後的細胞在40或96孔板上的HAT培養液(RPMIl640含10%—20%胎牛或小牛血清和HAT）中37℃，5%CO2條件下培養。融合後的細胞懸液中只有脾細胞和骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養基中生長，其他形式的融合細胞均不能生長．未融合的細胞也不能在HAT培養液中生存。
在融合後的細胞培養過程中，飼養細胞（feeder cell）有助於雜交瘤細胞的生長。飼養細胞可用同種動物的腹腔細胞或胸腹細胞。腹腔細胞中的吞噬細胞能清除死亡細胞碎片。使背景更為清潔「干凈」。同時飼養細胞分泌的細胞因子或活性物質有助於雜交瘤細胞的生長。現有商品「雜交瘤細胞生長因子」可用於替代飼養細胞。
（2）陽性雜交瘤細胞的篩選與單克降化：雜交細胞經約10—14d培養後，形成可用的細胞集落（克隆）。經過幾次更換培養液（HT培養液）後進行抗體活性檢測。常用的篩選槍測方法是ELISA和凝集試驗，前者常用於可溶性抗原，後者適用於細胞、細菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗均可用於雜交瘤細胞的篩選。
使許多細胞克隆混合生長的細胞分離為單個的細胞克隆的過程稱克隆化（colonization）最常用的單克隆化方法是有限稀釋法（limited dilution），即將混合細胞經稀釋後分裝於培養板上，使培養板的大部分孔中只出現一個細胞。為了確保抗體分泌細胞來源於單個細胞，克隆化過程可重復進行，稱為亞克隆化（subclonization）。除有限稀釋法外，熒光激活細胞分揀法（FACS）也用於雜交瘤細胞的克隆化過程。 產生特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株應立即擴大培養，以獲得足夠的細胞用於保存和生產可供應用的抗體。生產大量單克隆抗體的方法目前常用的有3種：小鼠腹水制備、大瓶培養和中空纖維反應器，前者多用於實驗室制備，後二者適應於工廠化生產。
腹水制備：雜交骨髓瘤細胞在腹腔中定植，並產生大量腹水。選用與單克隆抗體制備所用相同的動物品系或者含有相同基因的Fl代雜交品系。雜交F1代品系更適合於腹水制備，如果用異源動物制備腹水時可選用無MHC限制性的裸鼠。用小鼠制備腹水時，先用礦物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利於腹水的形成。腹腔注射10—10個雜交瘤細胞，經過7—10 d後形成腹水。每隻小鼠可獲得3—5mL腹水，每mL含IgG抗體可達5—10mg。腹水中含有較多的雜蛋白和非特異性IgG，並且含有許多蛋白酶，易使抗體失活，因此腹水收集後應盡快純化，以防止降解。
大瓶培養：採用1000mL或更大的搖瓶培養。大瓶培養上清體積大，但抗體濃度低，給抗體純化帶來很大困難，消耗人力和培養液，增加生產成本。
中空纖維反應器：是比較經濟的單克隆抗體生產方法。該裝置由具有半透膜性質的成束的微孔纖維組成，雜交瘤細胞位於纖維外部的小量培養液中，培養液在纖維的微孔中循環，供給營養和帶走廢物，抗體大分子和小分子化合物被隔開。高密度的雜交瘤細胞能在此系統中維持數月，每天可產生數百毫克的抗體，抗體濃度高，體積小易於純化。
胎（小）牛血清一直是細胞培養所必須的，在單克隆抗體生產過程中培養液中的血清蛋白使抗體的純化增加了困難，近年開發的無血清培養技術已逐漸用於單克隆抗體的生產中。 小鼠的單克隆抗體蛋白應用於人體後，作為抗原能引起人的免疫應答，大大降低其生物活性，並可能導致變態反應。因此人源單克隆抗體在臨床治療上有廣泛應用前景，引起人們的普遍興趣。但是人單克隆抗體制備存在許多技術上和倫理上的障礙，如人雜交瘤細胞系不穩定，有些抗原不能對人進行人工免疫，人B細胞只能從外周血中分離而無法從脾臟取得等。盡管如此，一些人源單克隆抗體已經獲得，技術上也在逐步完善起來。
人的瘤細胞株U—266常用來與人外周血B細胞融合以獲得人源單克隆抗體。另一些淋巴母細胞抹（LCL）則來源於EB病毒轉化的淋巴細胞，如GMl500，W1—L2和ARH77等也用於雜交瘤細胞的制備。這些細胞系表現ED病毒核抗原（EBNA）陽性，且形成的雜交瘤細胞抗體的分泌水平不高。
獲得人單克隆抗體的另一方法是用EBV直接轉化某些抗體分泌細胞，使之成為「不死」的細胞在體外培養。EBV感染人B細胞後，病毒基因插入人B細胞基因組中，有1%的細胞轉化為「不死」的細胞。B細胞轉化可通過「病毒驅動」和「細胞驅動」兩種方法獲得。前者是將B細胞與分泌EBV的B95—8細胞系一同培養，後者則是與EBNA陽性的LCL細胞一同培養。「細胞驅動」轉化的B細胞比較穩定，抗體分泌能力也較強。
人淋巴母細胞系和人雜交瘤細胞較難獲得，人單克隆抗體也可以通過異源雜文的辦法制備，即將EBV轉化的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，將獲得的異源雜交瘤細胞再與免疫後的B細胞融合，得到人單克隆抗體分泌細胞，不產生自身免疫球蛋白，EBVA也是陰性。 抗體的化學修飾：
抗體Fc段用雙功能連接劑與熒光素，同位素，酶，發光化合物，稀土元素以及葯物，毒素等連接後，並不影響其Fab功能區與特異性抗原結合。根據交聯物的性質不同，標記的抗體可用作診斷試劑，也可作為葯物的定向載體，引導葯物或毒素到達抗原存在部位使葯物或使毒素發揮更有效的作用，即俗稱「生物導彈」。從而減少葯物、毒素、同位素、酶在腫瘤治療過程中引起嚴重的副作用，大大提高治療腫瘤的效果。
許多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，紅豆毒素等均為蛋白質或糖蛋白，可用雙功能劑與抗體相連；嗎啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亞胺（EDC），混合酸酐法與抗體的氨基形成醯胺鍵；同樣，含脂肪胺的葯物如慶大雷素，阿黴素在水溶性EDC的作用下與抗體的羧基連接；而含芳香胺的葯物則先在低溫下與亞硝酸作用形成重氮化合物，再與抗體分子上的酪氨酸或組氨酸殘基形成偶氮鍵。總之通過抗體的化學修飾把抗體的特異性用到定向給葯和定位檢測上。 抗體基因文庫（antibody recombination library）是將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合，克隆到合適的表達載體中，在原核細胞表達不同的抗體，形成一個抗體庫，從這個抗體庫中，用抗原可以篩選到相應的抗體基因。抗體基因來源於雜交瘤細胞或動物B細胞（免疫或未免疫）的DNA和mRNA。
用質粒作為抗體文庫的載體，雖然也可能表達有活性的抗體分子或片段，但由線狀噬菌體表達更為方便有效。M13、fd、F1等噬菌體的外殼蛋白由5種蛋白組成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每種含量不一，其中pⅧ含量最多，每個噬菌體有2700個pⅧ亞基，其餘4種蛋白僅5個拷貝。增加噬菌體外殼蛋白的長度並不影響噬菌體的裝配，抗體以融合蛋白的形式表達於噬菌體表面。噬菌體表達質粒常用的有fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗體融合蛋白構建多用pⅢ和pⅧ，pⅧ拷貝數高，低親和力的抗體蛋白容易篩選出來。
在噬菌體表達抗體時，常常不表達完整的抗體分子，（因為CH2上不能進行糖基化）。根據不同的引物得到重鏈的VH或VHCH1區，輕鏈的VL或VLCL區。VL和VH兩個片段用一短肽作連接片段，形成單鏈可變區（single－chain fragment variable，scFv）；VHCH1和VLCL兩片段則形成Fab片段。另外，單獨的VH和VL也能結合抗原，如果二者形成同源或異源二聚體（dAb），則穩定性和親和性明顯提高（圖7—4）。此外在抗體片段DNA末端加上一些功能蛋白（如鹼性磷酸酶和蛋白毒素）的基因，則表達的抗體就帶有一定生物活性功能片段，可用於檢測或治療。如果在抗體基因末端加上終止子（TAG）則表達的抗體片段是可溶性的，而不是結合在噬菌體表面。
用特異性抗原免疫的動物B細胞構建抗體的噬菌體文庫，抗體親和性高，用與免疫抗原不同的抗原篩選得到的抗體親和性普遍較低。可用模擬天然體細胞突變的方法來提高親和力。如混雜重組法，即將己獲得的輕鏈或重鏈的V片段切下，再克隆至隨機的文庫中的V區構成二級文庫，使H鏈和L鏈混雜，可以使抗體片段的親和性提高。利用PCR錯配將隨機突變引人至抗體的抗原結合區，也能提高對抗原的親和力。先用低親和力的載體在噬菌體的PⅧ表達，篩選後、將抗體基因片段PCR擴增轉至PⅢ上表達，可獲得高親和力的抗體片段。
抗體基因文庫有兩個優點，一是從不適合進行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得單克隆抗體。 將鼠源抗體的V區基因與人源抗體C區基因重組，獲得的嵌合抗體（chimericalantibody），可保留鼠抗體對抗原的高親和性，又減弱鼠源抗體對人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。
重組的嵌合抗體基因轉化骨髓瘤細胞或中國地鼠卵細胞（CH0），可在其中表達。為了進一步地消除鼠抗體V區框架區（FW）的異源性，可實行CDR移植（CDR grafting），以獲得與鼠FW類似的人FW結構的嵌合抗體。
噬菌體表達的抗體僅含V區（scFv）或Fab片段，缺乏Fc區，使抗體的穩定性下降，半衰期縮短，與Fc受體結合功能也消失。因此在抗體功能片段的末端連接A蛋白、酶、細胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗體片段的穩定性，又可發揮某些生物學活性功能。
用抗體基因工程方法獲得的抗體與效應分子交聯物比用化學交聯法具有優點：可以大量生產，不會因修飾作用影響抗體及效應分子的活性，效應分子還可根據需要進行改造。
此外在抗體片段的末端連接一段特異的雙親性螺旋（amphiphilic helixes）結構，如亮氨酸拉鏈結構（leucine zipper），可使單價的scFv或Fab片段在體內或體外形成穩定的雙分子聚合體，從而提高抗體片段的親和力。此法也可用於制備雙特異性抗體。 噬菌體表達的抗體片段常常是在原核細胞（E.coli）中完成。原核系統表達抗體片段產量
高，成本低，快速易於操作。但抗體片段在原核表達系統中不能進行CH2糖基化，從而影響抗體的活性。因此重組抗體基因片段可轉移至適合的骨髓瘤細胞系或哺乳動物細胞系（如CHO），甚至於植物細胞中表達，可以得到與淋巴細胞表達相同的抗體分子。免疫球蛋白IgA的重鏈和輕鏈及分泌片基因可以分別轉化不同的植株，將表達這些蛋白的植株進行有性雜交，在雜交後代中可以裝配成完整的IgA雙分子。以植物作為生物反應器進行抗體的表達已有許多成功的研究報道，與動物細胞相比更為經濟，具有廣泛的應用前景。 抗體酶是抗原決定簇處於轉換態結構的抗體。因為轉換態分子極不穩定無法制備抗體，所以催化性抗體的獲得主要是通過設計穩定的轉換態的類似物作為半抗原，與載體蛋白交聯後，免疫動物，獲得針對半抗原的抗體，從中篩選具有催化活性的抗體。篩選催化性單克隆抗體所用的ELISA與篩選一般抗體的方法不完全一樣，應根據催化反應的特點而進行適當的修改。經典的方法是先篩選出與底物或半抗原結合的抗體，然後從中再篩選出有催化活力的抗體，這種方法費時費力。利用催化性抗體對底物的催化活性，對底物進行適當修飾，使催化反應的產物可直接表現抗體的催化活性，這樣可以簡化檢測步驟。
轉換態類似物半抗原的設計，必須了解催化反應的轉換態模型的結構特點。催化抗體的抗原結合位點上與轉換態互補的某些催化基團的形成，能穩定轉換態分子。此外有人把單克隆抗體分子用化學修飾方法引入一些活性基團，提高催化性抗體的催化與親和效率。應用噬菌體抗體文庫也可以篩選催化性抗體，可省去制備轉換態類似物的復雜過程，直接用底物從文庫中篩選有催化活性的抗體片段。如用半抗原免疫後制備的文庫或文庫經過多次混雜重組，則可以得到更高的親和力的催化性抗體。抗獨特型抗體也用於催化性抗體的制備，用酶作為抗原免疫小鼠獲得能夠封閉酶活性位點的單克隆抗體，將這個抗體用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗體具有相應的酶催化活性。
從理論上看，B細胞具有全套免疫球蛋白的多樣性的胚系基因，當然也包括有催化作用的自身抗體在內。然而1989年Paul W.首次報道了人體的一種能催化蛋白質水解的免疫球蛋白。它是—種自身抗體，能水解血管活性腸肽（vasoactive intenstinal peptide，VIP）的Glnl6—Met17鍵。用VIP作為抗原能得到有催化作用的單克隆抗體，也能催化Glnl6—Met17鍵。大約有17%的人有這種自身抗體酶，但患有氣喘的病人中該抗體與VIP的親和力比健康人高50倍。由於VIP是一種氣管鬆弛劑，因此有人認為這種VIP自身抗體的長期作用可能與氣喘的過敏應答有一定關系。由此推測除了人工設計催化抗體以及發現的自身催化抗體外，用篩選單抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗體。

2. 單克隆抗體的制備過程中，檢驗陽性是什麼意思

單抗的制備中，經篩選後的雜交瘤細胞產生的抗體是不一樣的，其中有些是我們所需要的單克隆抗體，所以要把篩選後的雜交瘤細胞在多孔板上培養，每個小孔中只有一個細胞，然後用抗原去試，呈陽性的就是能產生特定抗體的雜交瘤細胞。

3. 什麼是單克隆抗體有何特點及應用價值

分類：分子生物學知識 字型大小： 大大 中中 小小 1975年Kohler和Milstein首先報道，用細胞雜交技術，使經綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠的脾細胞，與小鼠的骨髓瘤細胞融合，並由此創建了第一個B細胞雜交瘤細胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。他倆首先創立了將能分泌特異性抗體的B淋巴細胞同無限繁殖的骨髓瘤細胞融合技術,為單克隆抗體的制備奠定了基礎。這是免疫學，乃至醫學史上的一個里程碑。

所謂的單克隆抗體是指由單一克隆雜交瘤細胞產生的只識別某一特定抗原表位的同源抗體。

單克隆抗體是經過人工制備的一類特殊抗體,它具有一般抗體的性質;它是B細胞增殖分化為漿細胞所產生的一類球蛋白,存在於體液中,具有免疫功能 ,介導體液免疫;它能與相應抗原(如病原體)特異性結合,在其他免疫分子和細胞的參入下發揮免疫效應.

單克隆抗體的本質是球蛋白,具有球蛋白的理化性質,空間結構和生物學活性.球蛋白對熱和化學物質敏感,加熱和加入化學試劑易破壞其結構,具有一定的半衰期.它和球蛋白一樣具有可變區和恆定區,可變區結合抗原,形成抗原抗體復合物;恆定區有補體結合位點,介導補體發揮作用,形成攻膜復合物,殺傷變異的細胞.

單克隆抗體除了具有抗體的一般性質外,還具有其特殊性.它在結構和組成上高度均一,其類型抗原結合特異性和親和力完全相同,易於體外大量制備和純化,可以廣泛的應用於醫學和微生物學領域.單克隆抗體有小鼠免疫脾細胞(B細胞)和無限繁殖的骨髓瘤細胞融合在一起形成一個雜交瘤細胞.而這個雜交瘤細胞不僅具有無限繁殖的能力,還具有分泌抗體能力,因此在體外培養後,可無限的分泌抗體.

單克隆抗體的制備比較復雜,其中涉及多種生物學技術,在此簡述其過程.用特定的抗原免疫純系動物(如BALA--C小鼠),多次反復經背部皮下多點注射,每次注射應定量,也要注重接種的時間間隔,可適當的添加弗氏佐劑.經過一段時間的飼養後,選擇血清抗體高的接種動物在無菌的情況下處死,取出脾臟剪碎,分離,離心取其懸浮細胞置入培養皿中,備用.在另取純系小鼠的骨髓瘤細胞放進培養皿中,加入一些飼養細胞(如胸腺細胞,巨噬細胞)促使其生長,在該混合液中有多種細胞,為了提取目的細胞--雜交瘤細胞,必須進行HAT選擇,培養獲得純代雜交瘤細胞.在眾多的雜交瘤細胞中,有的不表達免疫球蛋白,有的表達其他類型的球蛋白,因此,要用特異性的檢測方法從眾多的細胞中篩選出陽性雜交瘤細胞.將目的細胞分離成單個細胞讓其克隆化形成細胞株,再轉移至其他培養基中擴大培養.為了大量的獲得抗體,還需要經過小鼠腹腔接種,然後從腹水中分離提純抗體.

單克隆抗體的分離,提純,檢驗.將體外擴大培養液或者小鼠腹腔接種的腹水裝入離心管中置於離心機上高速離心,取其上清液置於玻片上,加入相應的抗原,看是否有凝聚現象.

單克隆抗體問世後取得了輝煌的成就,如應用白喉外毒素單克隆抗體治療白喉棒狀桿菌;應用抗內毒素類脂A的單克隆抗體治療G~菌敗血症等.單克隆技術也因此獲得了1984年的諾貝爾醫學獎.它的主要作用是:用單克隆抗體代替多克隆抗體克服了交叉反應,提高了免疫學實驗的特異性和敏感性,從而促進了醫學檢驗學的發展;用單克隆作親和柱,可分離提純含量極底的可溶性的抗原,如激素,細胞因子和難以純化的腫瘤抗原等;為物質提純開辟了一條新途徑;制備的單克隆抗體識別細胞表面特異性受體,若將抗腫瘤葯物(如毒素或放射性物質)偶連到其上,構建生物導彈,有望攻克人類頑疾--腫瘤.

單克隆抗體有廣闊的發展前景,但有其局限性.單克隆抗體作為外源性的抗原,多次反復的注射後能促使機體發生免疫應答,產生相應的抗抗體,產生排斥現象,因此單克隆抗體應用於臨床有其風險性,在緊急預防的情況下,可以慎用.

總之,單克隆抗體為人類在檢驗疾病,治療疾病方面取得了重大突破,盡管它還有些弊端,相信在不久的將來人類會制備出更加優良的單克隆抗體,為攻克腫瘤作出更大的貢獻!

單克隆抗體的特點是：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結合的特異性強、便於人為處理和質量控制，並且來源容易。這些優點使它一問世就受到高度重視，並廣泛應用於生物學和醫學研究領域。

1 作為親合層析的配體

單克隆抗體能與其相應的抗原特異性結合，因而能夠從復雜系統中識別出單個成分。只要得到針對某一成分的單克隆抗體，利用它作為配體，固定在層析柱上，通過親合層析，即可從復雜的混和物中分離、純化這一特定成分。如用抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)親合層析柱，就可從孕婦尿中提取到純的hCG。與其它提取方法(沉澱法、高效疏水色譜法等)相比，具有簡便、快速、經濟、產品活性高等優點。

2 作為生物治療的導向武器

脂質體是由既親水又親油的兩親磷脂組成的連續雙分子層微囊，內含水相空間，可包裹水溶性物質。包有細胞毒劑的脂質體膜上偶聯抗體，可定向攻擊靶細胞，稱為免疫脂質體。這種「導向治療」，在動物試驗與體外試驗中已獲得滿意效果。如熱敏免疫脂質體，由抗人乳癌細胞抗體經疏水長鏈脂肪酸修飾，抗體帶上長的疏水碳鏈，部分插入脂質體的脂雙層膜中，抗體Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗體活性。熱敏免疫脂質體可特異識別靶細胞(人乳癌細胞)，並通過相變溫度引起脂質體破裂，從而定向釋放葯物。另外，可將化療葯物、細菌毒素、植物毒素或放射性同位素等細胞毒劑與抗腫瘤抗原的單克隆抗體直接交聯，利用其導向作用，使細胞毒劑定位於腫瘤細胞把它直接殺傷。這不僅提高了抗體的療效，也可降低細胞毒劑對正常細胞的毒性反應。如應用抗T細胞單抗和柔紅黴素結合物，在體外對非T淋巴細胞就無殺傷作用。但是，要把這種方法應用於臨床，目前還存在不少技術難關，包括人體對鼠源單抗的排異問題等。

3 作為免疫抑制劑

抗人T淋巴細胞單抗(McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應用於臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應。其作用機理有賴於McAb的種類及其免疫學特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應。此外，對用於同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經抗T細胞單抗加補體處理，能減輕移植物抗宿主病的發生。

4 作為研究工作中的探針

單克隆抗體只與抗原分子上某一個表位(即抗原決定簇)相結合，利用這一特性就可把它作為研究工作中的探針。此時，可以從分子、細胞和器官的不同水平上，研究抗原物質的結構與功能的關系，進而並可從理論上闡明其機理。如用熒光物質標記單抗作為探針，能方便地確定與其結合的相應生物大分子(蛋白質、核酸、酶等)在細胞中的位置和分布。

5 增強抗原的免疫原性

抗體對抗原免疫原性的增強作用由來已久，60年代就已發現幼豬對破傷風類毒素難以產生抗體，注射相應特異性抗體IgG，就能有效地提高對委內瑞拉馬腦炎病毒的免疫應答。1984年以來，Celis等發現，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增強HBs抗原對特異性人T細胞克隆的刺激增殖，並可誘生干擾素。在小鼠中發現，當低劑量的HBs抗原不產生免疫反應時，加入抗HBs抗體組成的復合物，則可有效地誘生免疫反應。根據這一作用，現已研製出乙肝的抗原—抗體復合物型治療性疫苗。

6 作為醫學檢驗試劑

單克隆抗體作為醫學檢驗試劑，更能充分發揮其優勢。單克隆抗體的特異性強，大大提高了抗原—抗體反應的特異性，減少了和其它物質發生交叉反應的可能性，使試驗結果可信度更大。單抗的均一性和生物活性的單一性，使抗原—抗體區應結果便於控制，利於標准化和規范化。目前已有許多檢驗試劑盒用單抗製成，其主要用途如下：

(1)診斷各類病原體

這是單抗應用最多的領域，已有大量診斷試劑商品供選擇。如用於診斷乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒和各種微生物、寄生蟲感染的試劑等。單抗所具有的靈敏度高、特異性好的特點，使其在鑒別菌種的型及亞型、病毒變異株，以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具獨特優勢。

(2)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原的檢測

用於腫瘤的診斷、分型及定位。盡管目前尚未制備出腫瘤特異性抗原的單抗，但對腫瘤相關抗原(如甲胎蛋白、腫瘤鹼性蛋白和癌胚抗原)的單抗早就用於臨床檢驗。

隨著淋巴細胞雜交瘤技術的應用，許多抗人腫瘤標記物的雜交瘤細胞株已經建立，這為腫瘤的早期診斷及其闡明腫瘤的發生、發展，了解腫瘤細胞的生物學活性及其定量研究奠定了基礎。用抗腫瘤單抗檢查病理標本，可協助確定轉移腫瘤的原發部位。以放射性核素標記單抗可用於體內診斷，再結合X-線斷層掃描技術，可對腫瘤的大小及其轉移灶作出定量診斷。

(3)檢測淋巴細胞表面標志

用於區分細胞亞群和細胞的分化階段。例如檢測CD系列標志，有利於了解細胞的分化和T細胞亞群的數量和質量變化，這對多種疾病診斷具有參考意義。細胞表面抗原的檢測，將對白血病患者的疾病分期、治療效果、預後判斷等方面有指導作用。組織相容性抗原檢測是移植免疫學的重要內容，應用單抗對其進行位點檢測可得到更可信的結果。

(4)機體微量成分的測定

應用單抗結合其它技術，可對機體的多種微量成分進行測定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的靈敏性和抗原-抗體反應的特異性而建立起來的方法，它可以測至10-9～10-12g，使原來難以測定的激素能夠進行定量分析。除了激素，還可檢測諸多酶類、維生素、葯物和其它生化物質。這對受檢者健康狀態判斷、疾病檢出、指導診斷和臨床治療均具有實際意義。

綜上所述，單克隆抗體在理論和實踐上的應用成為解決生物學和醫學等許多重大問題的重要手段。但是，上述應用的單抗屬於鼠源性，用於人類疾病的預防和治療時會產生異種蛋白變態反應，大大限制了其臨床應用價值。而且，鼠源性抗體在人體內半衰期縮短，生物活性降低。因此，人們一直致力於人源性抗體的研究，如用人脾細胞與鼠骨髓瘤細胞雜交；用EB病毒轉化人的B淋巴細胞；用基因工程法制備嵌合抗體等。但都遇到相當的困難。以分子生物學技術提取、擴增編碼人抗體的DNA，構建質粒，建立組合抗體文庫，再利用供者文庫建立針對某一特定抗原的子文庫是近年來形成的最新方法。以該技術制備的抗體片段(Fab)是人源抗體，具有建庫簡單、抗體表達穩定等特點。迄今已有多種抗體產生。可以預見，該技術具有良好的發展和應用前景。

單克隆抗體綜述

一、抗體的定義和第一代單克隆抗體（經雜交瘤細胞生產）

抗體是在對抗原刺激的免疫應答中，B淋巴細胞產生的一類糖蛋白。它是能與相應抗原特異的結合、產生各種免疫效應（生理效應）的球蛋白。國際衛生組織將具有抗體活性及化學結構與抗體相似的一類蛋白統一命名為免疫球蛋白，它與抗體都是指同一類蛋白質。70000之間，稱為「重鏈」（H鏈）。輕、重鏈之間和兩重鏈之間由二硫橋連接，這樣的四鏈結構（L2H2）組成一個免疫球蛋白分子。550個氨基酸殘基，相對分子質量在55000;抗體的基本結構如圖所示，由四條肽鏈組成，其中兩條相對分子質量較低的肽鏈約含210個氨基酸殘基，相對分子質量約24000，稱為「輕鏈」（L鏈）；另兩條相對分子量較高的肽鏈約含450，其相應的抗體分別命名為IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。以重鏈抗原性差異來進行抗體的血清學分類：用分離純化的各種重鏈免疫動物獲得相應的抗血清，再通過免疫交叉反應等血清學檢測方法，分析其結構的異同，反復的驗證，最後發現人類有5類不同的重鏈，分別為）與多種細胞結合，(5)可能造成免疫損傷。IgG占成人血清中抗體總量的75%以上，是人類血清中主要的一類抗體，由B細胞產生，其功能結構也是研究最清楚的。它主要的生理功能有：(1)中和毒素和病毒，(2)凝集和沉澱抗原，(3)激活補體，(4)通過特異的膜受體（Fc單克隆抗體技術的應用是現代生物科學領域中的重要進展之一。單克隆抗（Monoclonalantibody，簡稱McAb）具有廣泛的應用價值，它為生物學和醫學等自然科學的研究開辟了新的途經。

二、 第二代單克隆抗體：經過基因重組的嵌合或人源化單克隆抗體

嵌合抗體：指用人的恆定區取代小鼠的恆定區，保留鼠單抗的可變區序列，形成一個人-鼠雜合的抗體。其研製程序快，可大幅度降低異源抗體的免疫原性，卻幾乎保持親本鼠單抗全部的特異性和親和力。另外，它還具有人抗體的效應功能，如補體固定、抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（ADCC）等。嵌合抗體成功的例子有：

Rituxan：Idec Pharmaceutical/Genentech的小鼠抗CD20抗體，含人IgG1κ恆定區，用於治療B淋巴瘤。它的抗淋巴瘤作用主要可能來自於補體作用、ADCC和誘導腫瘤細胞凋亡。

Remicade：Centocor公司的抗TNF-α抗體，用於治療風濕性關節炎和節段性回腸炎。

Simulect: Novartis公司的抗CD25抗體，用於抗移植排斥。

Erbitux：美國Imclone公司的抗EGFR（Her-1）單克隆抗體，目前FDA已批准其用於治療結直腸癌。

人源化抗體：利用現有的無數已詳細分析過的小鼠抗體，取其與抗原直接接觸的那段抗體片段（互補決定區，CDR）與人的抗體框架嫁接，經親和力重塑，可維持其特異性和大部分的親和力，同時幾乎去除免疫原性和毒副作用。

成功的例子：

Herceptin：Genentech公司的抗HER2/neu抗體，用於治療乳腺癌。

Synsgis：Medimmune公司的抗F抗體，用於治療呼吸道病毒感染。

Zenapax：Protein Design Labs（PDL）/Roche的抗CD25抗體，用於抗移植排斥。

h-R3：古巴分子免疫學中心的抗EGFR（Her-1）單克隆抗體，用於治療頭頸癌。

三、 噬菌體展示抗體和全人抗體

（1）噬菌體顯示技術制備人源性抗體

基於噬菌體可把抗體片段表達在外膜的能力而建立一系列的抗體文庫，然後用目的抗原來篩選文庫中相應的抗體片段，再經體外加工可形成有功能的完全人抗體。用此方法可制備針對簡單或復雜抗原的單抗，並得到中等親和力的抗體，但該方法需用高通量篩選。現有一些已進入臨床II/III期研究，如Cambridge Antibody Technology（CAT）的D2E7和CAT-152，分別用於治療風濕性關節炎和青光眼。D2E7是抗TNF-α單抗，現正由Abbott Laboratories開發。從其2002年6月份提供的臨床III期數據看，有望於近期進入市場。

（2）轉基因動物制備人源性抗體

抗體衍生物：有的研究者正在開發更容易生產和使用的單抗衍生物，最成功者當屬賓夕法尼亞大學的Mark Greene。他在尋找抗體互補決定區CDR衍生的多肽小分子[16]，並成立了CDR Therapeutics（現屬Xcyte Therapies）以加速其多肽生產的商業化。他的多肽有親本單抗的親和力和選擇性，但作為小分子，多肽應無免疫原性，且更容易制備。

4. 單克隆抗體技術的程序

(1) 抗原制備。制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應 根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與 免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇。根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來 源於LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一 般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。
(3) 免疫程序的確定。免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交 瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免 疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注 射、腹腔或靜脈注射，也採用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後一次加強免疫多採用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。 在最後一次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗 體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿 母細胞，這在最後一次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道採用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天後即可融合。 （1）雜交瘤細胞的凍存。在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產生很多「陽性」孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細胞凍存起來；另一方面，為了防 止實驗室可能發生的意外事故，如停電、污染、培養箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災難，通常盡可能早地凍存一部分細胞作為種子，以 免遭到不測。在雜交瘤細胞建立以後，更需要凍存一大批，以備今後隨時取用。
（2）雜交瘤細胞的復甦。雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞或其他細胞在液氮中保存，若無意外情況時，可保存數年至數十年。復甦時融解細胞速度要快，使之迅速通過最易受損的-5℃—0℃，以防細胞內形成冰晶引起細胞死亡。 ⑴ 單克隆性的確定 包括雜交瘤細胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。
⑵ 單抗理化特性的鑒定。從實用意義上說，單抗對溫度和PH變化的敏感性以及單抗的親合力都是理化特性鑒定的主要項目，它們可為單抗的使用和保存提供重要依據。
⑶ 單抗與相應抗原的反應性測定。單抗與相應抗原的反應性決定於它所識別的抗原表位，確定單抗針對的表位在抗原結構上的位置，是單抗特性鑒定的關鍵環節，同時，進一步分析這類表位的差別， 可正確評價單抗的特異性和交叉反應性。