抗病毒的方法圖片

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『貳』 現代分子生物學技術與植物病毒病的防治方法有哪些

選育抗病品種是防治病毒病最經濟有效的方法，但常規育種的缺陷限制了符合農業生產要求的抗病品種的產生。現代分子生物學技術的迅猛發展給抗病毒育種開辟了新的途徑。迄今為止，人們已研究出了許多來獲得轉基因抗病毒植物的方法。

1.外殼蛋白介導的抗性

病毒上存在一種交叉保護現象，即當一種弱侵染性病毒侵染植株後，該植株就獲得了一種抵抗強侵染性病毒侵染的抗性。1986年，美國的Beachy研究組利用此原理將煙草花葉病毒（TMV）的外殼蛋白基因（CP基因）導人煙草，首次獲得了抗TMV的煙草植株，開創了抗病育種的新紀元。病毒外殼蛋白是一種存在於絕大多數病毒中的結構蛋白，且是其中含量最多的一種蛋白。在轉外殼蛋白基因的植物中表達這種蛋白以後，就可以產生類似交叉保護的效果，大大減弱了以後病毒對轉基因植物的侵染及進行系統性傳播的能力。這種抗病毒作用存在於病毒復制的早期，並能導致病毒的重要成分的合成受阻。近幾年來，病毒外殼蛋白基因法被用來提高植物對多種病毒的抵禦力，包括TMV、黃瓜花葉病毒（CMV）、苜蓿花葉病毒（ALMV）、煙草條紋病毒（TSV）、煙草脆裂病毒（TRV）、馬鈴薯X病毒（PVX）、PVY、煙草蝕刻病毒（TEV）等12個屬近20種病毒。另外，國內還成功地克隆了水稻和小麥黃矮病毒的外殼蛋白基因。採用這一方法培育成功的抗病毒轉基因植物有煙草、苜蓿、番茄、馬鈴薯等。盡管用這種方法不能獲得對病毒的完全抗性，但可獲得高水平的抗性。而且來自於一種病毒的外殼蛋白基因有時對不相關的病毒可提供廣譜抗性。通過轉基因植株所進行的田間試驗和實驗室研究證明了這種方法的可行性。

2.利用缺損的復制酶

研究表明，向植物體內轉入缺損的病毒復制酶基因，表達出的無功能的缺損的復制酶可以與有功能的復制酶相互競爭，從而干擾病毒的正常復制。1990年Golemoboski將煙草花葉病毒TMVul株系的非結構基因（54ku基因）導入煙草，獲得了對TMV免疫性抗性的工程植株。將豌豆早枯病毒（PEBV）的復制酶C端編碼序列轉入煙草後，轉基因煙草對PEBV、胡椒環斑病毒（PRV）和煙草脆裂病毒都表現出抗性。將黃瓜花葉病毒的復制酶基因通過限制性內切酶切去其活性中心的GDD區域後，將缺損的基因轉入煙草，轉基因煙草對缺損的復制酶株系相同的病毒具有抗性。目前利用缺損的復制酶獲得抗病毒活性的作用和機理還停留在假說階段，不過從現有的結果看，利用該策略獲得具有抗病毒活性的轉基因植物是大有前途的。

3.干擾運動蛋白

病毒在植物體內的傳播途徑主要依賴於運動蛋白。運動蛋白可與胞間連絲相互作用，促進病毒在細胞間的轉移。如果能夠干擾或阻礙運動蛋白與胞間連絲的結合，就可以阻止病毒在植物體內的擴散，將已侵入植物體內的病毒局限在最初的侵染部位，從而達到抗病毒的目的。因此人們正在嘗試設計一種或幾種分子轉入植物，特異性地封閉運動蛋白或與運動蛋白相互競爭，從而獲得具抗病毒活性的轉基因植物。

以上3種策略在本質上都是由轉基因序列表達蛋白質量的多少來決定抗性水平高低的。因此這類抗性常稱作蛋白質介導的抗性。其主要特徵是抗性水平與轉基因的蛋白質表達的量成正相關。但是，隨著研究的深入，研究者們發現許多與此不符的情況。如在一些高度抗病的轉基因植物內，轉基因蛋白表達量很低，甚至根本檢測不到。當將病毒轉基因的起始密碼除去後，轉基因植物仍可以高度抗病，有的甚至免疫。這是不同於蛋白質介導的另一種抗性。

4.RNA介導的抗性

1992年3個研究小組同時報道了用非翻譯的序列轉化植株也能產生抗性，所抗病毒分別是番茄斑萎病毒（TSMV）、煙草蝕紋病毒（TEV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）。它們的抗性表現型與用能翻譯的DNA序列轉化所獲得的植株抗性表現型相似，但卻與蛋白質介導的抗性明顯不同。在RNA介導的抗性中RNA積累水平對病毒侵染的抗性水平之間無直接關系。有研究表明，細胞內RNA含量和抗性水平之間存在著反向關系。在RNA介導的抗性中，轉基因可以高水平轉錄，卻沒有大量穩定的RNA積累。轉基因植株中有一種普遍現象，即基因沉默，又叫外源基因失活。基因沉默有轉錄基因沉默（TGS）和轉錄後基因沉默（PTGS）兩種。TGS是指基因在轉錄水平上的沉默，即基因不能被正常轉錄；PTGS是指基因能被正常轉錄，但所轉錄的RNA在細胞內積累很低或根本檢測不到。這兩種基因沉默都可以稱為同源依賴的基因沉默。其中轉錄後的基因沉默一般是外源基因與同緣的內源基因一起發生沉默，即所謂的共抑制。由於轉基因在植物體內可以轉錄，卻沒有大量的RNA的積累，所以RNA介導的病毒抗性也被認為是一種PTGS。關於RNA介導抗性的分子機理雖然沒有統一和明確的認識，但許多研究者已對此做了許多有益的探討。Lindbo等在用煙草蝕紋病毒（TEV）接種轉TEV外殼蛋白基因的煙草植株的實驗中得出，轉基因RNA水平降低是由一種被誘導的轉錄後抑制過程所造成。Pang等認為，RNA介導的抗性的誘導依賴於所轉基因的長度。當植株用非翻譯的TSWV核蛋白基因片段91（110～235個核苷酸）轉化時，未觀察到植株的抗病性。但當這些相同的片段與非靶子的綠色熒光蛋白（GFP）基因融合後轉化植物時，這些轉基因植物就表現出抗病性。這表明一個臨界的轉基因的長度對誘導RNA介導的抗性是必需的。

基因沉默對轉基因的表達也許是不利的，但從植物抗病毒育種的角度來看，這種類似共抑制現象的抗病性卻是一種新的抗病毒策略。與蛋白質介導的抗性相比，RNA介導的抗性具有高抗或免疫、抗病性持久和生物安全性高等特點。

5.衛星RNA介導的抗性

所謂衛星RNA（SatelliteRNA）是指在復制和包裝時需其他病毒的小分子RNA，與輔助病毒在核酸序列上沒有任何同源性。衛星RNA只要在輔助復制酶病毒的衣殼中，在體內和體外都有很高的穩定性。實驗表明，衛星RNA可以干擾和抑制輔助病毒的復制。因此，人們認為可以把衛星RNA轉入植物從而獲得抗病毒的轉基因植物。1986年Bawlcome等成功地將CMV衛星RNA導入煙草，獲得了表達全長序列衛星RNA的工程煙草植株，對該病毒或相關病毒的復制和症狀表現有抑制效果。1988年，吳世宣、田波等將CMV的衛星RNA反轉錄為CDNA，加上調控序列，通過Ti質粒引入煙草，從而在我國首次培育出抗CMV的煙草植株。

6.反義RNA介導的抗性

用於翻譯蛋白質的RNA稱為正義RNA，互補於一般轉錄所得的mRNA的RNA分子稱為反義RNA。反義RNA與正義RNA形成雙鏈分子，從而阻礙翻譯的進行，導致基因產物合成減少。從理論上說，把互補於病毒外殼蛋白mRNA的反義RNA轉入植物，應有可能阻礙病毒復制和減輕病毒對植物組織的危害，獲得抗病毒的轉基因植物。人們將CMV外殼蛋白基因的正義和反義RNA分別轉化煙草，然後測定轉基因植物對病毒侵染的敏感度，以此來比較病毒外殼蛋白基因及其反義RNA轉化這兩種方法的效果。結果表明，外殼蛋白的反義RNA一般比正義RNA所能提供給植物的保護更少。以後又有實驗表明，反義RNA導入並不能使植物產生抗性。因此，採用反義RNA來獲得具有抗病毒能力的轉基因植物還需要做出更大的努力。

7.中和抗體基因

它是利用抗體對病毒的中和作用而達到防病的目的。其方法是將對病毒有中和作用的抗體基因轉移到植物中進行表達。國際上已經成功地將小白鼠雜交瘤細胞的cDNAR轉移到酵母中表達出有活性的抗體，並且在抗體基因的克隆方法和改造上有了新的突破。在高等植物中抗體基因的表達和有相同活性抗體的產生已被證實。抗體在植物細胞內與病毒結合有可能阻止病毒的進一步侵染。因此，作為抗病毒基因工程的一條新的途徑已受到國內外廣泛重視。

劉德虎等（1996）已進行了馬鈴薯Y病毒小鼠中和抗體輕鏈基因的克隆和序列分析，為該病毒中和抗體基因工程打下了基礎。

8.其他策略

核酶（Ribozyme）是一種能特異切割RNA的RNA，依據已知的病毒基因組的特定區域序列設計R2，使它能特異地識別、切割病毒的特定區域，從而切斷病毒基因組，破壞其生物能力，已有不少成功的報道。另外，還有植物來源的基因介導的抗性，植物在長期進化過程中形成一套對付病毒等病原的防禦系統。如何激發、利用植物本身的這種抗性機制，從植物體內找出有用的、關鍵的抗性基因，將是發展植物抗病毒基因工程的另一方向。我國將現代分子生物學技術應用於植物的抗病毒育種起始於20世紀80年代末90年代初，目前已將TMV、CMV、PVX、PVY、PLYV、RDV和BYDV等病毒的基因轉化煙草、番茄、辣椒、馬鈴薯、番木瓜、小麥和水稻等，獲得了多種抗病毒轉基因植物，有的已進入大田試驗。

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