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⑵ 植物組織培養的步驟有哪些
組織培養的方法和步驟
要根據培養目的適當選取材料，選擇原則：易於誘導、帶菌少。要選取植物組織內部無菌的材料。這一方面要從健壯的植株上取材料，不要取有傷口的或有病蟲的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，決不要在雨天、陰天或露水未乾時取材料。因為健壯的植株和晴天光合呼吸旺盛的組織，有自身消毒作用，這種組織一般是無菌的。培養材料的消毒
從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養基，便會造成培養基污染。因此，植物材料必須經嚴格的表面滅菌處理，再經無菌操作手續接到培養基上。
第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鍾至數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。洗時可加入洗衣粉清洗，然後再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質性的物質，便於滅菌液的直接接觸。當然，最理想的清洗物質是表面活性物質—吐溫。
第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈台或接種箱內完成，准備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手錶等。用70%酒精浸10～30s。由於酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內部的材料，則可只用70%酒精處理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發後再剝除外層，取用內部材料。
第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1—2種使用見表。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視採用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用注意：①酒精滲透性強，幼嫩材料易在酒精中失綠，所以浸泡時間要短，防止酒精殺死植物細胞。②老熟材料，特別是種子等可以在酒精中浸泡時間長一些，如種子可以浸泡5分鍾。③升汞的滲透力弱，一般浸泡10分鍾左右，對植物材料的殺傷力不大。④漂白粉容易導致植物材料失綠，所以對於幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入濃度為0.08—0.12%的吐溫20或80（一種濕潤劑），可以降低植物材料表面的張力，達到更好的消毒效果。滅菌劑 使用濃度(%) 持續時間（min） 去除的難易 效果
次氯酸鈣 9~10 5~30 易 很好
次氯酸鈉 2 5~30 易 很好
氯化汞 0.1~1 5~8 較難 最好
抗菌素 4~50mg/L 30~60 中 較好
制備外植體
將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷等，在無菌的環境下，剝去芽的鱗片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，葉片則不需剝皮。在操作中嚴禁用手觸動材料。
接種和培養 （一）接種
在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養基上，每瓶接種1－2個，以防止交叉污染。（二）封口
接種後，瓶、管用無菌葯棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶封口。 （三）溫度
培養基大多應保持在25℃左右，但要因花卉種類及材料部位的不同而區別對待。
增殖
外植體的增殖是組培的關鍵階段，在新梢等形成後為了擴大繁殖系數，需要繼代培養。把材料分株或切段轉入增殖培養基中，增殖培養基一般在分化培養基上加以改良，以利於增殖率的提高。增殖1個月左右後，可視情況進行再增殖。
根的誘導
繼代培養形成的不定芽和側芽等一般沒有根，必須轉到生根培養基上進行生根培養。1個月後即可獲得鍵壯根系。
組培苗的煉苗移栽 試管苗從無菌到光、溫、濕穩定的環境進入自然環境，必須進行煉苗。一般移植前，先將培養容器打開，於室內自然光照下放3天，然後取出小苗，用自來水把根繫上的營養基沖洗干凈，再栽入已准備好的基質中，基質使用前最好消毒。移栽前要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度（相對濕度98％左右），但基質不宜過濕，以防爛苗。
植物組織培養方法 1 MS培養基的配製包括以下步驟.
培養基母液的配製和保存 MS培養基含有近30種營養成分,為了避免每次配製培養基都要對這幾十種成分進行稱量,可將培養基中的各種成分,按原量的20倍或200倍分別稱量,配成濃縮液,這種濃縮液叫做培養基母液.這樣每次使用時,取其總量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL）,加水稀釋,製成培養液.現將制備培養基母液所需的各類物質的量列出,供配製時使用.
大量元素(母液Ⅰ) mg／L
NH4NO3 33 000
KNO3 38 000
CaCl2·2H2O 8 800
MgSO4·7H2O 7 400
KH2PO4 3 400
微量元素(母液Ⅱ)
KI 166
H3BO3 1 240
MnSO4·4H2O 4 460
ZnSO4·7H2O 1 720
Na2MoO4·2H2O 50
CuSO4·5H2O 5
CoCl2·6H2O 5
鐵鹽(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O 5 560
Na2-EDTA·2H2O 7 460
有機成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇 20 000
ⅣB
煙酸 100
鹽酸吡哆醇(維生素B6) 100
鹽酸硫胺素(維生素B1) 100
甘氨酸 400
以上各種營養成分的用量,除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外,其餘的均為200倍濃縮液.
上述幾種母液都要單獨配成1 L的貯備液.其中,母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配製方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢後,分別用少量的蒸餾水徹底溶解,然後再將它們混溶,最後定容到1 L.
母液Ⅲ的配製方法是：將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450 mL蒸餾水中,邊加熱邊不斷攪拌使它們溶解,然後將兩種溶液混合,並將pH調至5.5,最後定容到1 L,保存在棕色玻璃瓶中.
各種母液配完後,分別用玻璃瓶貯存,並且貼上標簽,註明母液號、配製倍數、日期等,保存在冰箱的冷藏室中.
MS培養基中還需要加入2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、6-苄基嘌呤（6BA）等植物生長調節物質,並且分別配成母液（0.1 mg/mL）.其配製方法是：分別稱取這3種物質各10 mg,將2,4-D和NAA用少量（1 mL）無水乙醇預溶,將6BA用少量（1 mL）的物質的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解,溶解過程需要水浴加熱,最後分別定容至100 mL,即得質量濃度為0.1 mg/mL的母液.
配製培養液 用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50 mL,母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL.再取2,4-D 5 mL、NAA 1 mL,與各種母液一起放入燒杯中.
配製培養液時應注意：①在使用提前配製的母液時,應在量取各種母液之前,輕輕搖動盛放母液的瓶子,如果發現瓶中有沉澱、懸浮物或被微生物污染,應立即淘汰這種母液,重新進行配製；②用量筒或移液管量取培養基母液之前,必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；③量取母液時,最好將各種母液按將要量取的順序寫在紙上,量取1種,劃掉1種,以免出錯.
溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蒸糖30 g,放入1 000 mL的搪瓷量杯中,再加入蒸餾水750 mL,用電爐加熱,邊加熱邊用玻璃棒攪拌,直到液體呈半透明狀.然後再將配好的混合培養液加入到煮沸的瓊脂中,最後加蒸餾水定容至1 000 mL,攪拌均勻.
調pH 用滴管吸取物質的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培養基中,邊滴邊攪拌,並隨時用精密的pH試紙（5.7.0）測培養基的pH,一直到培養基的pH為5.8為止（培養基的pH必須嚴格控制在5.8）.
2 BA為細胞分裂素 NAA 是萘乙酸,為生長素的一種
3 適於百合根的激素暫時沒找到
以下是葉片和胚的激素：對麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)葉片進行離體培養 ,可成功獲得無菌苗.試驗結果表明 :培養基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L適於初代培養 ,有助於根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L適於增殖培養 ,利於愈傷組織的產生 ,並促進芽的分化 ;生根培養基為 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;當試管苗根長 1cm時移栽易成活
在含有1 mg/ L IAA,1 m g/ L GA3,6 0 0 m g/ L CH的 MS培養基上培養 ,蔗糖含量為 6 8%時 ,百合幼胚胚性生長最好 ,培養 30 d後可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA,1 m g/ L BA的 MS培養基上可以形成淡綠色的愈傷組織 ,將這些愈傷組織轉移到 1 / 2 MS無激素的培養基上培養可以形成大量的不定芽 ,不定芽生根移栽後 ,其成活率可達90 %以上
⑶ 妞嶇墿浣撶粏鑳炲煿鍏誨熀鎿嶄綔
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⑷ 培養基的配製與滅菌方法說明
培養基 （Medium）是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配製的養料，一般都含有水、氮源、無機鹽（包括微量元素）、碳源、生長因子（維生素、氨基酸、鹼基、抗菌素、色素、激素和血清等）等。
不同培養基可根據實際需要，添加一些自身無法合成的化合物，即生長因子。有些微生物，如自養型微生物，不需要碳源，所以上述物質只具有一般性。培養基由於配製的原料不同，使用要求不同，而貯存保管方面也稍有不同。一般培養基在受熱、吸潮後，易被細菌污染或分解變質，因此一般 培養基 必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴格滅菌的培養基（如組織培養基），較長時間的貯存，必須放在3-6℃的冰箱內。由於液體培養基不易長期保管，均改製成粉末。
培養基的配製
1.配料
配方換算→在容器中加入少量水（蒸餾水，自然水）→按照配方稱取各種葯品（依次加入）→加足所需水量（一葯一勺，取葯後立即蓋上瓶蓋）。
2.溶解
澱粉溶解：少量冷水調成糊狀加熱溶解，特別是加有瓊脂的培養基，一定要煮沸，瓊脂的熔解溫度95-97℃ ，且需要邊加熱邊攪拌以防止燒焦。
3.調PH
用1N的鹽酸或1N的 NaOH把培養基調節到所要求的值。
4.過濾
濾紙或棉花進行過濾。（有時可以省去）
5.分裝
一般 培養基 放在三角瓶或試管中滅菌使用。
(1)三角瓶
若作靜置培養，判含則100ml培養基/250ml的三角瓶，最多不能超過150ml培養基/250ml的三角瓶，否則滅菌時培養基沸騰容易污染棉塞，造成染菌；若作搖瓶培養，則15-20ml培養基/250ml的三角瓶，保證通氣良好。
(2)試管分裝
液體培養基一衫讓般裝4-5ml，約試管的1/4高度；固體斜面 培養基 一般裝3-4ml，約試管的1/5高度。
6.包紮
分裝好後，塞上棉塞，在用牛皮紙將棉塞包裹好，防止滅菌時水份進入把棉塞弄濕。
7.滅菌
按配方上要求的溫度、壓力進行高壓蒸汽滅菌。如果滅菌的溫度太高，營養成分會被破壞，培養基中的糖、氨基酸會使 培養基 的顏色變深。
8.擺斜面
滅菌後需要擺斜面的試管要趁熱斜著擺放，使其凝固成為一個斜面，約占試管長度的1/2。
9.貯存
培養基 在30℃下放置一天，無污染的即可使用。一般用牛皮紙包裹好存放於2-8℃冰箱中備用。
培養基的滅菌
滅菌是指殺死或消滅一定環境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。
加熱滅菌包括濕熱和乾熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內 蛋白質凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質的凝固變性與其自身含水量有關，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比乾熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質易於凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。
濕熱滅菌有煮沸消毒法和高壓蒸汽滅菌法兩種，煮沸消毒法是注射器和解剖器械等均可採用此法。先將注射器等用紗布包好，然後放進煮沸消毒器內加水煮沸。對於細菌的營養體煮沸約15～30min，對於芽孢則需煮沸約1～2h。
高壓蒸汽滅菌法是高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學實驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基於水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經15～30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。
培養基注意事項
1、確認工作細胞庫是否被污染，確認毒種工作種子批是否被污染，確認所用培養基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用細菌、掘塌笑真菌及支原體無菌試驗來確認並排除。同時要對無菌試驗 培養基 的靈敏度進行驗證。實際生產中，可以從配製好的培養液中取少量加入營養瓊脂於恆溫培養箱內培養，48小時即可觀察有無污染。
2、其它：高壓滅菌設備、過濾除菌設備均應進行驗證，確保滅菌和除菌效果;前者應在投產前及其後的每6個月進行驗證，後者應在每次除菌前、後進行驗證工作(至少應在除菌後進行一次)。
3、另外，應將有毒區與無毒區嚴格分開，並有各自獨立的空氣凈化系統及孵室，有毒區對無毒區應保持相對負壓，防止病毒對培養細胞(尤其是細胞庫)的污染。