組織分離法中哪種方法最常用

A. 食用菌制種技術的分離與培養

食用菌菌種分離方法有四種，即組織分離法、孢子分離法、耳木分離法和土中菌絲分離法。
（一）組織分離法
組織分離法是利用子實體內部組織來獲得純菌種的方法，根據不同的分離材料大體可分為三種。
1、子實體組織分離
①、種菇的選擇 從優良的品系中選取優良的個體作種菇，以單生菇、菇形圓整、無病蟲害菇作分離材料。
②分離 把種菇帶入接種箱內，用75%酒精表面消毒，用解剖刀在菌柄中部縱切一刀，然後撕開，挑取菌蓋與菌柄交界處的一小塊組織，接種到PDA培養基上，數天後就可看到組織塊及培養基上有白色菌絲，即表明分離成功。
2、菌核組織分離 茯苓、豬苓、雷丸等葯用菌，常利用菌核分離得到菌種。分離方法是將菌核表面消毒後，用解剖刀切開，取中間組織1小塊，接入PDA培養基上，20℃—25℃培養。
3、菌索分離 密環菌，假密環菌常用菌索來分離。方法是將菌索表面消毒後，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用無菌剪刀剪成小段。移接在PDA培養基上，20℃—25℃培養，有白色菌絲長出且無污染，即表明分離成功。
（二）孢子分離法
孢子分離法是利用菌類的成熟孢子能自動彈射的原理，在無菌操作條件下，使孢子在適宜的培養基上萌發長成菌絲體而獲得菌種。
1、種菇的選擇 孢子分離用的形態不同，孢子分離的方法也不同。
①整菇插種法：是將整隻成熟度適當的種菇，經表面消毒後，插入孢子採集器內，放在適當的溫度下，讓其彈射孢子的方法。蘑菇、香菇、草菇等食用菌常用此法採集孢子。
②鉤懸法：將新鮮的成熟度適當的耳片用無菌水沖洗後懸掛在無菌的三角瓶內或有孔鍾罩內，在一定溫度下讓其彈射孢子。木耳、銀耳常用此法採收孢子。
（三）、耳木（菇木）分離法
耳木（菇木）分離法是利用耳木或菇木中的菌絲體得到菌種的方法。
1、耳木的採集與選擇 一般在該菌的生長季節里，選取生長的子實體大、肉質厚、成熟度適當、無雜菌感染的耳木或菇木進行分離。
2、分離方法 在所選耳棒長有子實體的部位，橫斷面鋸下鋸成1cm厚薄的木片，帶入已經消毒的接種箱（或接種室）內。將上述木片浸入0.1%升汞溶液中30s—60s，用無菌水沖洗數次，以沖去殘留的升汞液，放在無菌紗布上吸干水分，多面手用滅過菌的榔頭，解剖刀切去樹皮部分，把木片劈成小塊，隨後用鑷子將小木塊放入PDA培養基上，每管放一塊，放適宜溫度下培養。
（四）土中菌絲分離法
它是利用菌類地下的菌絲體來分離得到菌種的一種方法。主要用於腐殖質腐生菌的分離，用前述三種方法能分離得到菌種，一般不採用這一方法。但在野外採集時，菇類子實體已腐爛，而又十分需要該菌種時，就要用此法分離。具體操作如下：
①取菇體下與菇根相連的菌絲體，盡可能取較清潔的菌絲束。
②由於土壤中含有各種微生物，如細菌、放線菌、黴菌等，因此分離時要用無菌水反復沖洗菌絲束，把附著的泥土等雜物沖洗干凈，把無菌棉花或紗布吸干水分。
③取菌絲束尖端部分，接入有細菌抑制劑的培養基中，25℃左右培養，無雜菌污染即分離成功。
④菌絲的鑒定。在土中獲得的菌絲，其可靠性較小，必須經過出菇鑒定，才能確認是該菌的菌種。 接種後的原種或栽培種全部拿出培養箱或培養室，根據不同食用菌菌絲發育最適溫 度進行培養。培養2～3天後，菌絲開始生長時，要每天定期檢查，如發現黃、綠、橘紅、黑色雜菌時，要及時揀出清理。尤其是塑料袋菌種，檢查工作到菌絲長滿為止。培養室切忌陽光直射，但也不要完全黑暗；注意通風換氣，室內保持清潔，空氣相對濕度不要超過65%；同時菌種瓶、袋不要堆疊過高，瓶間要有空隙，以防溫度過高造成菌絲衰老，生活力降低。特別是對加溫的培養室要注意：一要保持室內溫度的穩定，因在溫差較大的情況(特別是母種培養)會形成冷凝水，而使菌絲倒伏變黃。有條件的話，可根據菇類的菌絲生長對溫度的要求，按品種分開放在不同溫度的培養室(箱)內培養。同時要注意經常調換原種、栽培種排放的位置以使同一批菌種菌絲生長一致。二要注意通風換氣，以免室內二氧化碳濃度過高而影響菌絲生長。

B. 實驗室微生物菌種純化方法

1、傾注平板法
首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養瓊脂培養基充分混合，然後把這混合液傾注到無菌的培養皿中，待凝固之後，把這平板倒置在恆箱中培養。單一細胞經過多次增殖後形成一個菌落，取單個菌落製成懸液，重復上述步驟數次，便可得到純培養物 2、塗布平板法
首先把微生物懸液通過適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然後用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地塗布在培養基表面上，經恆溫培養便可以得到單個菌落。3、平板劃線法
最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。當接種環在培養基表面上往後移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，最後在所劃的線上分散著單個細胞，經培養，每一個細胞長成一個菌落。
4、富集培養法
富集培養法的方法和原理非常簡單。我們可以創造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重復移種，最後富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重復移種便可以得到純的寄生菌。
5、厭氧法
在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養基的試管作為培養容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數分鍾，以便逐出培養基中的溶解氧。然後快速冷卻，並進行接種。接種後，加入無菌的石蠟於培養基表面，使培養基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種後，利用N2或CO2取代培養基中的氣體，然後在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種於培養基上，然後再把培養皿放在完全密封的厭氧培養裝置中。

C. 解離組織製片的常用方法有哪些

解離組織製片的常用方法有：質量分數15%的鹽酸和體積分數95%的酒精，鹽酸能殺死細胞，使其停止在各個分裂時期；還能溶解細胞之間的中膠層（破壞胞間連絲）。

保護組織位於植物的植物體幼嫩的根、莖、葉、花、果實的表面、直接接觸外界環境的細胞層，而輸導組織則是貫穿於植物體的根莖葉等器官為他們提供營養，掐去一根枝條的頂端就不會向上長了，因為植物生長靠的是細胞分裂，頂端的分生組織被破壞。

解離就是用要葯液

使組織的細胞相互分離開來，便於最後製片時能被壓成一薄層進行顯微觀察。解離液中酒精的作用是迅速殺死細胞，固定細胞的分裂相（將洋蔥根尖剪下後，如果不立即投入固定液中將其殺死並令其各種細胞結構凝固，那麼，整個根尖將一個分裂期細胞也找不到！）；而鹽酸能溶解果膠，從而使洋蔥細胞的細胞壁軟化，並使細胞間的中膠層物質溶解，從而達到分離細胞的目的。

D. 組織分離的常用分離方法

種菇要選朵大蓋厚，柄短，八九分成熟的優良品種。切去菇兩基部，在無菌箱內以0.1%的升汞水浸幾分鍾，再用無菌水沖洗並揩乾或用75%酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進行表面消毒。
接種時，只要將種菇撕開，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織；移接 到PDA培養基上。置25℃左右溫度下培養3-5天，就可以看到組織上產生白色絨毛狀菌絲，轉管擴大即得到菌種。
如香菇、平菇等可以用此方法。 茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易採集。而常見的是它貯藏營養的菌核。用菌核分離，同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗凈，用酒精或升汞消毒後，切開菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在PDA 培養基斜面上，保溫培養。
應注重的是，菌核是貯藏器官，大部分是多糖類物質，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些，假如組織塊過小，則不易分出菌種。 有一部分子實體不易找到，也沒有菌核，可以用菌素進行分離。如蜜環菌、假蜜環菌。
其操作方法是先用酒精或升汞將菌素表面黑色皮層輕輕擦拭2～3次， 然後去掉黑色外皮層（菌鞘），抽出白色菌髓部分；用無菌剪刀將菌髓剪一小段，接種在培養基上，保溫培養，即得該菌菌種。
菌素分離要注重：因菌素比較細小，分離素也比較細小，分離時極易污染雜菌，所以要嚴格操作。 1.著名的黑木耳菌種「菊三」、「冬梅1號」、「雪梅1號」、「雪梅3號」、「984」就是黑龍江省柴河食用菌學會冬梅食用菌廠，通過對野生木耳組織分離，馴化選育成功的。
2.香菇組織分離方法
選用的子實體先經0.1%開汞水或70%酒精表面消毒後。用無菌水沖洗並用無菌紗布擦去表面水分。
分離香菇時，用無菌解剖刀自菌柄處切開少許，再用手將子實體掰開為二，在菌蓋與菌褶交界處，切取0.3～0.4立方厘米的一小塊菌肉，移放在斜面培養基中央。如已開傘的種菇、則選菌蓋與菌柄交界處的菌肉。
分離草菇時，用無菌解剖刀把菌蕾縱切少許；再用手把菌蓋輕輕剝開，在菌柄上方和菌蓋交界處，切取1～5毫米的細塊，接在斜面培養基中。如種菇已受雨淋，吸水較多，應取菌褶作為接種材料。組織分離後將試管外面放在恆溫箱中培養。待組織塊周圍萌發出菌絲，並向 培養基蔓延生長後，再挑取生長健壯的菌絲進行轉管培養。
組織分離法操作簡便，又不易帶入雜菌，容易獲得純菌種。但對銀耳、黑木耳等膠質菌；因其子實體中菌絲的含量極少，如用組織分離培養，則往往不易成功。

E. 什麼是食用菌母種、原種和栽培種

母種:從蘑菇上直接分離得到的菌種(試管種,用培養基培養)。

原種:由母種擴大繁殖得到的菌種(瓶裝種,用培養料培養,一般多拿罐頭瓶或者小袋子培養)。

栽培種:由原種擴大繁殖得到的菌種(袋裝種,用培養料培養,一般都拿蘑菇袋子培養)。

母種用來保存菌種,原種用來擴大菌種,栽培種用來生產的。

組織分離法組織分離法是通過切取菌索、子實體、菌核的新鮮幼嫩的組織進行分離，以獲取純菌絲的方法，是最常用的菌種分離法之一 。

子實體、菌索等實際就是雙核菌絲的紐結物，具有很強的再生能力。因分離時所 選擇的材料不同 ，該方法又可分為菌索組織分離法、子實體組織分離法及菌核組織分離法。

在實踐中，子實體組 織分離法是最有效、最常用的方法。但對於膠質菌，由於其子實體中所含的菌絲量比較低 ，如黑木耳、銀耳等，利用組織分離培養難度較大。

組織分離屬於無性繁殖的范疇，能保持原菌株的特性，遺傳穩定變異小，不僅適於孢子不易收集或萌發的食用菌，也適於穩定優良品種的遺傳性。

孢子分離法 孢子分離法，是採取子囊果或子實體中成熟的子囊孢子或有性孢子萌發成純菌絲，再進一步培養成菌種的方法。

由此法可以獲得強活性、短菌齡的菌絲，該方法的另外一個優點是分離得到的有性孢子兼有雙親的遺傳特性，可用於雜交育種和選育新種中。

只是孢子間不僅存在個體差異，還存在較普遍的自然分化現象，出現的變異較大，必須經過出菇試驗後才能用於生產中團。對於產孢子的真菌，一般其分離法多採用孢子分離法。

以上內容參考：網路-食用菌菌種