pcr擴增儀使用方法

1. pcr儀使用時，在設定反應程序時，一共分了多少個步驟

• 1．常規程序

• 將PCR反應所需的成分配置完後，在PCR儀上於94-96℃預加熱幾十秒至幾分鍾，使模板DNA充分變性，然後進入擴增循環。在每一個循環中，先於94℃保持30秒鍾使模板變性，然後將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鍾，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鍾（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環。重復這樣的循環25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。最後，在72℃保持3-7min，使產物延伸完整，4℃保存。

• 2．復性（退火）和延伸溫度

• 復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

• 3．反應時間

• 變性步驟一般使用30秒鍾，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般採用1kb用1分鍾來保證充足的時間。

• 4．循環次數

• 循環次數主要與模板的起始數量有關，在模板拷貝數為104～105數量級時，循環數通常為25～35次。

• 平台效應（plateaueffect）：PCR擴增過程後期會出現的產物的積累按減弱的指數速率增長的現象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低，產生的焦磷酸會出現末端產物抑製作用，非特異性產物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不徹底。

• 5．PCR反應液的配製

• PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規方法與其它酶學反應一樣，在最後加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發。

• 對於使用具3』-5』外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時，如果將反應成分分開配製，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然後再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。

• 按照常規的方法配製反應體系，有時會出現非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配製好，然後加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最後加入模板和DNA聚合酶等剩餘成分。只有當PCR反應進入高溫階段後，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。

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2. 簡述PCR技術操作步驟

PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction）的縮寫，它是體外酶促合成特異DNA片段的方法。這一方法的要點是合成兩個分別互補於待擴增DNA片段兩端的小片段引物，在含有引物、待擴增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反應體系中DNA復制反復進行，在短時間內可以取得大量擴增產物。其原理是寡聚核苷酸鏈引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成兩個與靶DNA兩側序列互補的引物，在體外進行靶DNA的重復合成。
主要的技術步驟是：
（1）DNA變性 加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。
（2）引物與靶DNA退火 適當降低溫度，使兩個引物分別結合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離後，又可作為模板與引物雜交，並且在DNA聚合酶的催化下，引導合成新的靶DNA鏈。如此反復進行以上3個步驟，即可使靶DNA片段指數性擴增。

3. PCR實驗方法步驟

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面小編就向大家介紹PCR實驗方法步驟：

方法

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  在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

  10×PCR buffer

  5 μl dNTP mix （2mM）

  4 μl 引物1（10pM）

  2 μl 引物2（10pM）

  2 μl Taq酶 （2U/μl）

  1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）

  1 μl 加ddH2O至 50 μl

  視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
  

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