Ⅰ 基因克隆的方法主要有哪幾種，簡述各種方法的原理和用途
基因克隆的方法主要有哪幾種
選擇目的基因,並設計相應引物；
用引物PCR擴增目的基因片段；
選擇合適（抗性標記、酶切位點等）的克隆載體（為了保真擴增）,並將PCR片段連接入克隆載體中；（一般用Taq酶的PCR產物在末尾會自帶一個A,可在Solution 1作用下與兩端各帶一個T的線性T載體直接相連）
將連接產物轉化入感受態大腸桿菌,使之在含有抗生素的培養基上生長擴增；
從大腸桿菌中提取質粒（即前面的連接產物）,酶切鑒定和測序鑒定均無誤後將目的基因片段切下並與新的表達載體連接,然後再次轉化入大腸桿菌中擴增,再提質粒,即得到想要的目的基因片段克隆.
Ⅱ 基因克隆常見方法
、T4連接酶介導的DNA克隆
傳統的分子克隆，通常需要使用相同的限制性內切酶酶切載體和目的片段，使得載體和片段產生相同的粘性或平末端，使用T4 DNA連接酶對其進行連接，轉化，挑取陽性克隆，得到重組質粒
為了更方便的對DNA進行克隆，後續又將克隆的載體進行了簡化，出現了T載體，這樣就可以不用酶切，直接將片段連接到載體上，以便於DNA的保存及後續擴增。
以TA克隆為例來介紹整個連接過程。常規的連接是一個三分子共同反應的過程（圖1），載體、片段和連接酶碰撞在一起，發生反應，完成連接過程。為了得到更多的陽性克隆，我們會傾向於加入更多的片段、載體和連接酶，以提高分子碰撞機率，但同時也會遇到一個問題，過高的DNA濃度和T4連接酶濃度會增加分子間相互作用促進串聯體和載體自連的形成，反而導致片段和酶的利用率降低。所以在進行TA克隆時，並不是DNA和酶加入的越多越好。
使用這種方法進行克隆，如果需要連接平末端的DNA片段（比如Pfu類酶擴增的片段），則需要進行額外的加A尾反應（可以使用Taq酶完成加A）
二、EASY克隆
EASY克隆的方法主要依賴於載體上所攜帶的拓撲異構酶。拓撲異構酶的生理作用主要體現在DNA復制的過程中，同時具有內切酶和連接酶的功能：酶切釋放DNA復制過程中產生的螺旋力；在復制完成後，將缺口補上，完成DNA的復制。很多拓撲異構酶無明顯特異性結合DNA序列的規律，直到1990年，科學家舒曼在牛痘病毒中發現了一種拓撲異構酶能特異性識別C/TCCTT序列（圖2），並對後面序列進行切割和連接，才使得拓撲異構酶用於DNA克隆成為可能。
圖2 左圖：拓撲異構酶識別特定的序列；右圖：拓撲異構酶介導的基因克隆
EASY克隆就是基於這一原理，將T鹼基通過磷酸鍵與拓撲異構酶第274位酪氨酸結合，使拓撲異構酶和載體偶聯在
Ⅲ 基因克隆的常用方法有哪幾種
根據已知探針克隆基因
這也是基因克隆的一種較直接的方法。首先將探針作放射性或非放射性標記,再將其與用不同內切酶處理的基因組DNA雜交,最後將所識別的片段從膠中切下來，克隆到特定的載體(質粒、噬菌體或病毒)中作序列測定或功能分析。這種方法不但可以將基因克隆出來,還能同時觀察該基因在基因組中的拷貝數。但在探針雜交後,要注意高強度(highstringent)漂洗,以避免干擾信號,即保證克隆的特異性,同時節省時間。
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Ⅳ 基因克隆的方法有哪些
簡單的說一下：
擴增目的基因，比如通過PCR的方法。
PCR擴增的序列可以通過酶切或者TOPO TA的方法插入到載體質粒。
轉染大腸桿菌
篩選陽性克隆一般常採用藍白克隆方法，就是在載體上，序列的插入位置本來是一個完整編碼β-gal這個酶的序列，如果不被破壞，產生的酶可以降解細菌培養盤上的底物，形成藍色產物。如果有目的序列插入，這個酶就不能表達，形成的克隆就是白色的。
挑取陽性克隆，測序確認無變異和方向後，擴增質粒，提純質粒。
Ⅳ 怎樣克隆一個目的基因
目的基因的克隆是利用一個單一的基因副本的行為。有pcr方法，凝膠電泳方法，色譜法，瓊脂糖凝膠電泳法，質粒法等。具體方法可分別檢索文獻。
常用的植物目的基因克隆技術
1、通過已知基因產物的分析和鑒定
這類技術主要通過生物化學和病理學研究分離鑒定有關基因的蛋白產物，並對蛋白質氨基酸順序進行分析，推斷出編碼該蛋白質的基因序列，然後通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對文庫進行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當其他植物的同類基因已分離到並且核苷酸序列保守性較高時，也可直接用這些已知的基因片段作探針對未克隆到該基因的植物基因文庫進行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過遺傳表型分析
（1）基因標鑒法。該法是利用轉座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產生一些突變體，然後用相應轉座子或T-DNA對突變體文庫進行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功能的轉位因子系統的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交後代中篩選由於轉位因子插入到某一特定基因序列中導致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構建基因文庫，然後將轉位因子用同位素標記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉位因子的目的基因。該法主要限於二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應用該法已分離出與玉米種子發育有關的Viviparious-1基因及與金魚草花發育有關的一些基因等。
（2）激發子的寄主受體基因克隆技術。該技術是利用病菌無毒基因（avrgene）編氳募し⒆佑爰鬧骺共』�蟣嗦氳氖芴逯�浯嬖誆磺綴偷幕プ鞴叵擔�圓≡�し⒆擁鞍孜�咚鞣擲牒塗寺〕鮃恍┘付≈士共』�潁�綬�延胛薅凈�騛vr9對應的抗病基因cf9，與avrPto對應的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對應的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎的定位克隆技術
以圖譜為基礎的定位克隆技術在分離未知產物的基因方面有廣闊的應用前景。該法的基本前提是基因定位，然後以緊密連鎖的分子標記如RFLP等為起點，通過染色體步移逐步向目標基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標基因定位在高密度的分子標記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標記的遺傳圖譜距轉換成物理距離；（3）構建YAC文庫，找到含連鎖標記的YAC克隆，並通過克隆的排序獲得目標基因的DNA片段；（4）通過轉化和功能互補試驗證實基因所在的DNA片段。如用該技術已分離出番茄抗根結線蟲mi基因和擬南芥菜抗細菌性莖腐病的RPM1基因等。